Aristotel l-a învățat pe Alexandru (356-323 î.e.n.) înainte ca prințul să moștenească tronul Macedoniei în 336 î.e.n. și să înceapă să extindă imperiul pe care tatăl său îl obținuse prin cuceriri. Mai târziu, grădina de la Liceul din Atena a ajuns să conțină plante aduse de adepții armatelor lui Alexandru. Theophrastus și-a bazat multe dintre descrierile de plante pe relatările pe care le-a obținut de la călătorii care au vizitat regiuni îndepărtate ale imperiului lui Alexandru. Biblioteca din Alexandria, pe care Dioscoride a folosit-o probabil, a fost deschisă în timpul domniei lui Ptolemeu I Soter, generalul lui Alexandru (cca. 367 î.Hr.- cca. 283 î.Hr.). Ptolemeu I a fost un prieten personal apropiat al lui Alexandru și este posibil să fi fost un coleg de clasă al lui Aristotel. A devenit conducător al Egiptului în 323 î.e.n., după moartea lui Alexandru. Munca propriu-zisă de planificare și supraveghere a bibliotecii a fost delegată lui Demetrius din Phaleron (cca. 350-cca. 280 î.e.n.), un student la Lyceum al lui Theophrastus.

Alexandru a condus Macedonia ca regent din 340 î.e.n., în timp ce tatăl său, Filip al II-lea, a condus o mare armată macedoneană care a invadat Tracia, țara care se învecina cu Macedonia în est. Mai târziu, Alexandru s-a certat cu Filip și a părăsit Macedonia, dar în 336 î.e.n. Filip a fost asasinat, iar Alexandru, în vârstă de 20 de ani, a devenit Alexandru al III-lea al Macedoniei, numit mai târziu Alexandru cel Mare. Pe măsură ce vestea morții lui Filip s-a răspândit, oamenii din țările cucerite de macedoneni au văzut o șansă de a-și lua libertatea, iar Alexandru a trebuit să acționeze. A început prin a-și executa toți oponenții din interiorul Macedoniei, apoi a restabilit dominația macedoneană în Grecia, Tracia și Iliria.

Lăsându-l pe un general experimentat, Antipater (cca. 398-319 î.e.n.) să mențină ordinea acasă, în 334 î.e.n. Alexandru a condus o forță mare în Asia Mică, ca primă etapă a expansiunii sale imperiale. Macedonenii au învins o mare armată persană, au securizat coasta Asiei Mici, iar în 333 î.e.n. au luptat și au învins o altă armată persană, aceasta condusă de regele persan Darius al III-lea. Forțele lui Alexandru și-au croit apoi drum spre sud prin Siria și Fenicia. În primăvara anului 331 î.e.n., macedonenii au intrat în Egipt. După câteva luni, s-au întors la Tyr, unde au primit întăriri din Europa și s-au îndreptat spre est. I-au învins din nou pe perși la Gaugemala, la est de râul Tigru, au ocupat Babilonul, apoi au capturat Susa și capitala persană, Persepolis, iar Alexandru a fost proclamat rege al Asiei. Macedonenii și-au reluat apoi urmărirea lui Darius, pe care l-au găsit muribund din cauza rănilor provocate de unul dintre nobilii săi – care a fost capturat mai târziu de macedoneni și pedepsit din ordinul lui Alexandru. Presărând spre est în Asia Centrală, au ajuns în Munții Tian Shan, în vestul Chinei, unde a fost găsită o statuetă a unui soldat grec într-un loc de înmormântare.

În 326 î.e.n., Alexandru i-a invitat pe căpeteniile din ceea ce este astăzi nordul Pakistanului să se supună dominației sale. Unii au fost de acord, dar alții s-au opus macedonenilor și au fost învinși doar după lupte intense în care Alexandru a fost rănit. Soldații macedoneni, care tânjeau să își vadă casele și familiile, s-au opus planului lui Alexandru de a înainta mai departe în India și l-au convins să se întoarcă înapoi. Au ajuns la Babilon, unde Alexandru a murit la 11 iunie 323 î.e.n., în palatul lui Nabucodonosor al II-lea. Istoricii nu sunt siguri de cauza morții sale, dar cel mai probabil aceasta a fost cauzată de o boală. Peste încă o lună, Alexandru ar fi împlinit 33 de ani. După cum arată harta de mai jos, la apogeu, imperiul său se întindea de la Macedonia, în vest, până la Valea Indusului, în est, și de la țărmul sudic al Mării Negre și al Mării Caspice până în Egipt. Imperiul a început să se dezintegreze la câțiva ani de la moartea lui Alexandru, rupându-se în multe regate independente.

Alexandru fusese elevul lui Aristotel și, deși educația tânărului a fost întreruptă, acesta era foarte inteligent, iar Aristotel a exercitat o influență puternică asupra dezvoltării sale. Aristotel i-a încurajat pe toți studenții săi să observe și să cerceteze lumea naturală, iar Alexandru era foarte interesat de plante și animale. O mare suită de savanți îl însoțea în timp ce își conducea armatele. Aceștia măsurau distanțe, pregăteau hărți, studiau religiile necunoscute, dar și flora și fauna. Când întâlneau specii de plante sau animale necunoscute, Alexandru trimitea specimene în Europa, multe dintre ele la Liceul din Atena, în atenția lui Aristotel însuși. A adunat ce informații a putut despre tratamentele locale pe bază de plante și a practicat medicina, tratând personal unele dintre rănile și bolile de care sufereau soldații săi.

În anul 332 î.e.n., Alexandru a fondat orașul Alexandria pe locul lui Rhakotis, un port de pescuit egiptean. El intenționa ca orașul să creeze o punte între culturile Greciei și Egiptului, dar a rămas acolo doar câteva luni după ce a început construcția și nu s-a mai întors niciodată. După moartea lui Alexandru, Ptolemeu I a reușit să obțină ca trupul său să fie adus în oraș. Biblioteca din Alexandria a fost construită ca o replică a Lyceumului, cu o alee cu colonade și grădini. Existau săli de lectură, săli de lectură și o sală de mese comună, iar biblioteca era situată lângă și în slujba Musaeum-ului, care era un templu folosit ca instituție academică – și care este la originea cuvântului muzeu. Managerii bibliotecii au fost instruiți să colecteze toate informațiile din lume. Reprezentanții bibliotecii participau la târgurile de carte din Atena și Rodos, iar de fiecare dată când o navă sosea în port, orice carte pe care o transporta era confiscată și copiată, biblioteca păstrând originalele și returnând copiile comandantului navei. Aceasta este biblioteca în care este posibil să fi studiat Pedanius Dioscorides. O mare parte din bibliotecă a fost incendiată accidental în 48 î.e.n. în timpul unui război civil și, deși o ramură a bibliotecii, cunoscută sub numele de biblioteca fiică, a continuat să funcționeze în sudul orașului, și aceasta a fost distrusă în 391 e.n. când împăratul roman Theodosius I (347-395) a ordonat distrugerea tuturor templelor păgâne.

.