Abstract
Background. Amiloidoza este o precipitare extracelulară de material hialin eozinofilic de origine proprie, cu caracteristici speciale de colorare și ultrastructură fibrilară. Amiloidoza maculară este limitată la nivelul pielii și au fost propuși mai mulți factori pentru patogeneza sa. Detectarea ADN-ului virusului Epstein-Barr (EBV) în această leziune sugerează că acest virus poate juca un rol în patogeneza acestei boli. Obiectiv. Detectarea ADN-ului EBV a fost efectuată pe 30 de probe de piele cu diagnosticul de amiloidoză maculară și pe 31 de probe de piele sănătoasă în marja unor nevi melanocitare îndepărtate, prin PCR. Rezultate. La pacienții pozitivi pentru gena beta-globinei în PCR, gena BLLF1 a virusului EBV a fost pozitivă la 23 de pacienți (8 pacienți în grupul de caz și 15 pacienți în grupul de control). Nu a existat nicio diferență semnificativă în ceea ce privește prezența ADN-ului EBV între grupurile de amiloidoză maculară (3,8%) și de control (23,8%) (). Concluzii. Rezultatele acestui studiu au arătat că EBV nu este implicat în patogeneza amiloidozei maculare.
1. Introducere
Amiloidoza este depunerea extracelulară a unui grup de proteine fibroase. Există o varietate de abordări pentru clasificarea amiloidozei, dar cea mai simplă metodă este împărțirea în tipuri sistemice și tipuri specifice de organ (localizate). Pielea este un țesut implicat în ambele tipuri. Amiloidoza localizată cutanată este de două tipuri: (i) keratinică, care poate fi primară sau secundară, și (ii) nodulară. Tipul secundar este secundar altor leziuni cutanate, cum ar fi tumorile cutanate, tulburările inflamatorii ale pielii și fototerapia. Au fost identificate două tipuri de amiloidoză keratozică: amiloidoza maculară și lichenică, iar cea din urmă este mai frecventă. În amiloidoza keratozică, depunerile de cheratină provenite din keratinocitele bazale sunt în principal CK5 pozitive. Tipul keratotic este observat mai ales în Asia de sud-est, America de Sud și China. Are forme familiale (10%) și sporadice, iar cea din urmă este mai frecventă la femei . Cele mai frecvente locuri de afectare sunt partea superioară a spatelui (zona interscapulară) și extremitățile (tibii și brațe), deși au fost descrise și la nivelul feței, trunchiului și coapselor . Leziunile de amiloidoză maculară apar de obicei sub forma unor pete hiperpigmentate cu margini nedefinite, compuse din macule brun-cenușii, adesea cu aspect reticulat sau ondulat (figura 1). Mâncărimea este un simptom frecvent înainte de debutul amiloidozei .
Patogenia acestei afecțiuni nu este pe deplin elucidată, cu excepția faptului că keratina depusă este derivată din keratinocite . Au fost propuse două mecanisme patogene, inclusiv teoria apoptotică (fibrilară) și teoria secretorie . Pe baza teoriei apoptotice, degenerarea keratinocitelor deteriorate din stratul bazal este urmată de transformarea acestor corpuri coloidale de către histiocitele dermice și fibroblaste în amiloid în dermul papilar (figura 2). Conform teoriei secretorii, depozitele de amiloid derivate din keratinocitele bazale degenerate se răspândesc în dermul papilar prin lamina densa deteriorată . Există mai mulți factori etiologici implicați în patogeneza amiloidozei maculare: factori rasiali , predispoziție genetică, factori de mediu , sex (feminin) , hormoni feminini , expunere la lumina soarelui , fricțiune (abraziune de lungă durată) , atopie , autoimunitate (pe baza asocierii cu lupusul eritematos sistemic, dermatomiozita, scleroza sistemică, sarcoidoza și nefropatia IgA) și infecția cu EBV . EBV, a cărui prezență a fost raportată în epiderma amiloidozei maculare, este probabil să acționeze ca un factor care contribuie la degenerarea keratinocitelor .
Rolul EBV în etiopatogenia amiloidozei cutanate primare a fost evaluat în doar două studii anterioare, inclusiv un singur raport de caz și o serie de cazuri de 27 de pacienți din China . Având în vedere deficitul de studii privind asocierea dintre EBV și amiloidoza maculară, ne-am propus să realizăm un studiu în acest sens în Iran. Poate că agenții antivirali pot fi utilizați în viitor pentru tratamentul acestei boli în cazul asocierii cu EBV.
2. Materiale și metode
În acest studiu caz-control, 38 de eșantioane de amiloidoză maculară și 38 de eșantioane de piele sănătoasă din jurul unor nevi melanocitare excizate de la pacienți de vârstă și sex asortat fără amiloidoză maculară au fost înrolate în examenul clinic pe baza unei eșantionări nealeatorii orientate spre obiective. Criteriile de includere au inclus blocuri de parafină cu țesut suficient în arhivele Departamentului de Patologie al Spitalului Imam Reza din Mashhad diagnosticate cu amiloidoză maculară pe baza raportului patologic și a prezentării clinice. Criteriile de excludere au inclus blocuri cu date imperfecte în arhive și eșantioane insuficiente pentru PCR.
În grupul de cazuri, depunerea de amiloid a fost confirmată prin microscopie optică și colorație cu roșu Congo. În etapa următoare, șase secțiuni de 5 μm au fost pregătite din fiecare dintre blocurile din grupurile de caz și de control în condiții sterile, folosind o lamă sterilă, și au fost plasate în tuburi Eppendorf sterile.
2.1. Deparafinarea
Pentru deparafinarea țesuturilor parafinate s-a folosit xilol/etanol. Un ml de xilol a fost adăugat la microtuburile care conțineau secțiuni de țesut și a fost incubat la temperatura camerei timp de o jumătate de oră cu agitare constantă. În etapa următoare, microtuburile au fost centrifugate la 13.000 rpm timp de 10 minute, iar supernatantul acestora a fost aruncat. Aceste două etape au fost repetate o singură dată. Cinci sute μL de etanol 100% au fost adăugate la precipitat și centrifugate timp de 10 m în 13.000 rpm după mai multe inversări ale microtubului, iar supernatantul a fost apoi eliminat. Această etapă a fost repetată din nou. În cele din urmă, precipitatul rezultat a fost plasat la temperatura camerei pentru a se evapora complet etanolul, dar nu și precipitatul.
2.2. Extracția ADN-ului
Extragerea ADN-ului s-a făcut folosind kitul BIO BASIC INC (Canada) cu numărul de lot 8401-140116. Pentru extracție s-a utilizat tamponul de liză-T. În etapa următoare, 100 μL de tampon de extracție și 10 μL de proteinază K au fost adăugate în fiecare microtub și au fost amestecate. Probele de țesut au fost adăugate în amestec și au fost incubate la temperatura camerei timp de 10 minute. Apoi, probele au fost incubate la 95°C timp de 3 minute pentru a inactiva proteinaza K. O sută de μL de Universal Buffer NST au fost adăugate în tuburi și inversate de 10 ori. Amestecul obținut a fost utilizat pentru PCR.
2.3. PCR
În acest studiu, PCR a fost utilizat pentru a detecta prezența genomului EBV în amiloidoza maculară. După extragerea ADN din blocuri parafinate, calitatea ADN-ului extras din țesuturile incluse în parafină a fost determinată cu ajutorul primerilor genei beta-globinei. Amorsele GH20 și PC04 pentru gena beta-globinei utilizate în acest studiu au amplificat un fragment de 260 bp. Secvența acestor amorse a fost următoarea: GH20: 5′ GAA GAG CCA AGG ACA GGT AC 3′. PC04: 5′ CAA CTT CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC 3′.Probele care au produs fragmentul de 260 bp cu ajutorul amorselor dorite au fost considerate favorabile pentru amplificarea genei BLLF1 a virusului EBV.
Prezența secvenței EBV în probele de ADN extrase a fost testată cu ajutorul kitului Cinna Gen cu numărul de lot 935701 (Sina Clon, Iran). Acest kit a fost conceput pentru a determina calitatea ADN-ului EBV în probele infectate prin PCR. Reactivul optimizat 1x PCR ca amestec de ADN polimerază Taq ADN recombinant, tampon PCR, MgCl2, dNTP și primeri a fost reactivul utilizat pentru amestecare. Regiunea foarte specifică și repetitivă a genei BLLF1 care codifică gp 350/220 este amplificată de primeri. Aceștia pot detecta cel puțin 30 de copii ale EBV. Prezența fragmentelor de 239 pb sau 256 pb indică un rezultat pozitiv al testului.
Analiza datelor a fost efectuată cu ajutorul software-ului SPSS 11.5. Graficele și tabelele statistice au fost folosite pentru a descrie datele, iar testele Chi pătrat și independent -tests au fost folosite pentru a compara EBV în probele sănătoase și în cele ale pacienților. În toate testele, a fost considerat nivelul de semnificație de 0,05.
3. Rezultate
Cinci la sută dintre pacienți au fost bărbați (19/38) și 50% femei (19/38). Trei pacienți au fost în grupa de vârstă sub 20 de ani (7,9%), 5 pacienți 20-30 de ani (13,2%), 10 pacienți 30-40 de ani (26,3%), 13 pacienți 40-50 de ani (34,2%), 4 pacienți 50-60 de ani (10,5%) și 3 pacienți peste 60 de ani (7,9%). Vârstele minimă și maximă au fost de 19 și, respectiv, 76 de ani. Au existat 27 de cazuri de infecție la nivelul trunchiului (71,1%) și 11 cazuri la nivelul extremităților (28,9%). Grupul de studiu și grupul de control au fost asortate în ceea ce privește vârsta () și sexul ().
PCR a fost efectuată pentru gena beta-globinei în 76 de probe (38 de cazuri și 38 de controale), care a fost pozitivă în 61 de probe (30 de probe în grupul de cazuri și 31 în grupul de control) și a fost negativă în 15 probe (8 probe în grupul de cazuri și 7 în grupul de control) (figura 3).
În cele 61 de probe pozitive pentru gena beta-globinei în PCR, gena BLLF1 din EBV a fost pozitivă în 23 de cazuri (8 cazuri în grupul de studiu și 15 cazuri în grupul de control) și a fost negativă în 38 de cazuri (22 de cazuri în grupul de studiu și 16 cazuri în grupul de control) (Figura 4).
PCR a genei BLLF1 din EBV a fost pozitivă în proporție de 26,7% în grupul de studiu și 48,4% pozitivă în grupul de control. Rezultatele testului Chi-pătrat nu au arătat nicio corelație între EBV și amiloidoza maculară () (Tabelul 1).
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
4. Discuție
Amiloidoza este cunoscută ca depunerea extracelulară de material hialin eozinofilic de origine proprie cu colorare și caracteristici ultrastructurale specifice. Această afecțiune poate să apară pe fondul unor boli sistemice sau poate fi limitată la nivelul pielii. Amiloidoza maculară este limitată la piele . EBV poate stimula secreția de material amiloid de către keratinocite sau poate fi un stimulent pentru degenerarea keratinocitelor și conversia filamentelor keratinocitelor degenerate în amiloid . Studii recente au indicat rolul celulelor epiteliale în reproducerea continuă a EBV. Receptorii de suprafață celulară EBV găsiți în epiteliul scuamos mai puțin diferențiat sugerează infectarea directă a keratinocitelor epidermice. Infecția poate avea loc în straturile germinative; cu toate acestea, replicarea virusului este fezabilă numai prin maturizarea și diferențierea celulelor. Expresia citokeratinei în keratinocitele umane este modificată in vitro după infecția cu EBV, ceea ce duce la transformarea lor în fibroblaste . Fibroblastele pot fagocita agregatele de cheratină și le pot transforma în amiloid .
Drago și colab. au arătat această corelație în Italia în 1996. Pacientul lor a fost o femeie în vârstă de 30 de ani, cu un istoric de zece ani de papule și macule maro pruriginoase pe piept și spate, cu simptome de sindrom de oboseală cronică. Ei au putut evidenția genomul EBV în leziunile epidermice folosind tehnica de hibridizare in situ. Genomul EBV a fost evidențiat în principal în celulele epidermice bazale, precum și în celulele stratului superior, în special în citoplasmă. Testele serologice pentru EBV au fost, de asemenea, pozitive la pacient. Terapia antivirală cu aciclovir și interferon alfa a ameliorat leziunile cutanate și simptomele generale la pacient . Un alt studiu a fost realizat de Chang et al. pe țesutul cutanat a 27 de pacienți cu diagnostic de lichen și amiloidoză maculară în Taiwan în 1997. Metoda de hibridizare in situ a indicat ADN EBV în leziunile a 11 pacienți (40,7%), în timp ce grupul de control (incluzând trei pacienți cu amiloidoză cutanată secundară, doi pacienți cu amiloidoză sistemică primară și patru pacienți cu lichen simplex cronic) nu aveau ADN EBV .
Conform acestui studiu, nu a existat nicio corelație între EBV și amiloidoza maculară (). ADN-ul EBV a fost prezent la 8 pacienți cu amiloidoză maculară și la 15 controale în studiul nostru. Diferența în ceea ce privește rata de detectare a ADN-ului EBV între pacienții cu amiloidoză maculară și martorii din acest studiu față de studiile menționate se poate datora următoarelor motive:(1)Lipsa asocierii dintre amiloidoza maculară și infecția cu EBV: există câteva studii care prezintă dovezi insuficiente pentru o corelație definitivă între EBV și amiloidoza maculară, astfel încât, pe baza rezultatelor studiului nostru, am putea face această concluzie.(2)Metodologie (PCR versus hibridizare in situ): am folosit o metodă sensibilă pentru detectarea ADN-ului EBV cu martori pozitivi și negativi. Pe baza studiilor anterioare, PCR este la fel de sensibilă ca și hibridizarea in situ . Cu toate acestea, deoarece nu am utilizat hibridizarea in situ, nu am putut localiza exact celula infectată cu EBV în controalele noastre, care ar putea fi celulele B circulante ale pielii în loc de keratinocite. Deoarece am folosit controale pozitive și negative în kitul nostru PCR pentru EBV, cazurile pozitive din grupul nostru de control nu ar putea fi fals pozitive.(3)Controale: controalele din studiul nostru au fost pielea sănătoasă din jurul neviilor melanocitare, dar controalele din studiul Chang au fost alte afecțiuni cutanate.(4)Tipul de amiloidoză cutanată: în studiul nostru, toți pacienții au avut amiloidoză maculară, dar în ambele studii anterioare majoritatea pacienților au fost de lichen amiloidoză.
5. Concluzie
În conformitate cu rezultatele acestui studiu, nu a existat nicio corelație între EBV și amiloidoza maculară. Recomandăm utilizarea țesutului proaspăt sau a punchului de biopsie congelat rapid, precum și studiul serologic simultan al pacienților pentru depistarea anticorpilor anti-EBV pentru a obține rezultate mai precise pentru studiul comparativ al ADN-ului EBV în amiloidoza maculară. PCR in situ poate fi, de asemenea, utilizat pentru a localiza celulele pozitive la ADN EBV în probe. Alte gene pot fi utilizate pentru a detecta EBV în țesuturi, deoarece unele probe EBV sunt mutante pentru gena BLLF1 utilizată în acest studiu .
De asemenea, recomandăm efectuarea unui studiu comparativ privind detectarea EBV atât în pielea implicată, cât și în cea neimplicată a pacienților cu amiloidoză maculară.
Conflict de interese
Autorii declară că nu există conflicte de interese.
Recunoștințe
Autorii își exprimă profunda recunoștință pentru adjunctul de cercetare al UMMS pentru sprijinul financiar și aprobarea propunerii de cercetare (nr. 911283) legată de teza lui Narges Nazeri. Se recunoaște sprijinul financiar acordat de către adjunctul de cercetare al Universității de Științe Medicale din Mashhad.
.