I.U.B.: 3.4.21.1
C.A.S.: 9004-07-3

Reacție enzimatică (imaginea se va deschide într-o fereastră nouă)

Chymotrypsin este o serin endopeptidază produsă de celulele acinare ale pancreasului. Chimotripsina se activează după proteoliza chimotripsinogenului de către tripsină. În timp ce tripsina hidrolizează la nivelul lizinei și argininei, chimotripsina scindează selectiv legăturile peptidice formate de reziduurile aromatice (tirozină, fenilalanină și triptofan) (Hedstrom et al. 1992). Două forme predominante de chimotripsină, A și B, se găsesc în cantități egale în pancreasul bovinelor. Acestea sunt proteine foarte asemănătoare (identice în proporție de 80%), dar au caracteristici proteolitice semnificativ diferite (Hartley 1964, Meloun et al. 1966, Smillie et al. 1968 și Gráf et al. 2004). Informațiile de mai jos se referă în principal la forma A a chimotripsinogenului și chimotripsinei.

Istoric:

La începutul anilor 1900, Vernon a propus că preparatele pancreatice ar putea da naștere unui activator intrinsec al propriilor sale enzime (Vernon 1901). Experimentele de coagulare a laptelui efectuate de Vernon au determinat că existau cel puțin două enzime prezente și că una era mai stabilă decât cealaltă (Vernon 1902). Cu toate acestea, această idee nu a fost acceptată pe scară largă până în 1934, când Kunitz și Northrop au confirmat prezența unei enzime în plus față de tripsină, numind-o chimotripsină. Ei au reușit să cristalizeze chimotripsina, precum și precursorul inactiv, chimotripsinogenul (Kunitz și Northrop 1934). În 1938, Kunitz a izolat diferite forme active ale chimotripsinei, denumindu-le alfa, beta și gamma (Kunitz 1938).

La începutul anilor 1940, Fruton și Bergmann au studiat în continuare specificitatea chimotripsinei, raportând mai multe substraturi noi (Fruton și Bergmann 1942). Jacobsen a identificat curând forme suplimentare de chimotripsină, desemnându-le ca fiind delta și pi (Jacobsen 1947). În 1948, Schwert a caracterizat în continuare greutățile moleculare ale chimotripsinei și chimotripsinogenului.

În 1954, prima dovadă a mecanismului în trei etape al chimotripsinei care hidrolizează substraturile amidice și esterice a fost raportată de Hartley și Kilby, care au emis ipoteza prezenței unui intermediar enzimatic acil, care s-a dovedit ulterior a fi adevărată (Henderson 1970). În 1955, Laskowski a obținut un al doilea chimotripsinogen cristalin, numindu-l chimotripsinogen B. În 1964, Hartley a determinat secvența de aminoacizi a chimotripsinei A, care a fost ulterior rafinată de Meloun et al. în 1966. În 1968, Smillie și colab. au determinat secvența de aminoacizi a chimotripsinei B, care a evidențiat o identitate de secvență de 80% cu chimotripsina A. De-a lungul anilor 1970 și 1980 au fost efectuate cercetări pentru a înțelege mai bine mecanismul de acțiune și pentru a identifica diferențele de secvențe de aminoacizi dintre tripsină și chimotripsină (Steitz și colab. 1969, Cohen și colab. 1981, Asbóth și Polgár 1983 și Gráf și colab. 1988).

În anii 1990, chimotripsina a fost purificată din alte surse, inclusiv din cod de Atlantic (Ásgeirsson și Bjarnason 1991) și cămilă (Al-Ajlan și Bailey 1997). De asemenea, au început lucrările de investigare a inhibitorilor (Baek și colab. 1990), iar Frigerio și colab. au elucidat structura cristalină a chimotripsinei bovine la o rezoluție de 2,0 Å (Frigerio și colab. 1992).

Cercetări recente au investigat plierea și denaturarea chimotripsinei pe o gamă de concentrații (Ghaouar și colab. 2010), interacțiunea chimotripsinei cu substraturi de nanoparticule (You și colab. 2006 și Jordan et al. 2009) și creșterea stabilității chimotripsinei prin conjugarea cu molecule de PEG (Castellanos et al. 2005 și Rodríguez-Martínez et al. 2009).

Specificitate:

Chimotripsina este activată prin scindarea legăturii dintre arginină și izoleucină (R15 și I16) de către tripsină, determinând modificări structurale și formarea situsului de legare a substratului (Sears 2010). Chimotripsina diferă de tripsină prin faptul că tripsina clivează peptidele la nivelul reziduurilor de arginină și lizină, în timp ce chimotripsina preferă reziduurile hidrofobe mari (Hedstrom et al. 1992). Chymotrypsina catalizează preferențial hidroliza legăturilor peptidice care implică izomerii L ai tirozinei, fenilalaninei și triptofanului. De asemenea, acționează cu ușurință asupra amidelor și esterilor de aminoacizi susceptibili. Specificitatea chimotripsinei pentru reziduurile hidrofobe mari poate fi explicată printr-o zonă de legătură hidrofobă S1 formată de reziduurile 189-195, 214-220 și 225-228 (Cohen et al. 1981).

Deși structura situsului S1 al tripsinei și chimotripsinei prezintă doar o singură diferență (la poziția 189), mutageneza dirijată de situs a tripsinei și chimotripsinei nu a reușit să schimbe specificitățile, sugerând că mecanismul prin care tripsina și chimotripsina realizează cataliză specifică substratului nu este pe deplin înțeles (Steitz și colab. 1969, și Gráf et al. 1988).

Caracteristici moleculare:

Chimotripsina A și B au o identitate de secvență de 80% (Hartley 1964, Meloun et al. 1966, Smillie et al. 1968, și Gráf et al. 2004). Aminoacizii din triada catalitică (H57, D102 și S195) sunt foarte bine conservați în secvențele peptidazelor din familia S1 (Gráf et al. 2004). Serina de la poziția 214 este, de asemenea, foarte conservată în familie și a fost propusă ca al patrulea membru al triadei catalitice (Ohara et al. 1989 și McGrath et al. 1992).

Compoziție:

Cele trei reziduuri de aminoacizi din triada catalitică (H57, D102 și S195) sunt esențiale pentru scindarea legăturii peptidice și sunt stabilizate prin legături de hidrogen (Sears 2010 și Gráf et al. 2004). G193 și S195 alcătuiesc gaura oxianionică și interacționează cu grupul carbonil al legăturii peptidice scissile, orientând-o pentru a forma intermediarul tetraedric (Rühlmann et al. 1973, Huber și Bode 1978, și Gráf et al. 2004).

Numărul de accesare a proteinelor: P00766

Clasificare CATH (v. 3.3.0):

• Clasa: Clasa: În principal Beta
• Arhitectură: Beta Barrel
• Topologie: Serin-protează de tip tripsină

Greutate moleculară:

• 25,6 kDa (Wilcox 1970)

Ph optim: 7,8-8,0 (Rick 1974)

Punct izoelectric:

• 8.52 (Chymotrypsinogen, Teoretic)
• 8,33 (Chymotrypsin, Teoretic)

Coeficient de extincție:

• 51,840 cm-1 M-1 (Teoretic)
• E1%,280 = 20.19 (Chymotrypsinogen, Teoretic)
• E1%,280 = 20.57 (Chymotrypsin, Teoretic)

Reziduuri ale situsului activ:

• Histidină (H57)
• Aspartat (D102)
• Serină (S195)

Activatori:

• Bromură de cetiltributilamoniu (Spreti et al. 2008)
• Bromură de dideciltrimetilamoniu (Abuin et al. 2005)
• Bromură de hexadeciltrimetilamoniu (Celej et al. 2004)
• Bromură de tetrabutilamoniu (Spreti et al. 2001)

Inhibitori:

• Hidroximetilpirrole (Abell și Nabbs 2001)
• Acizi boronici (Smoum și colab. 2003)
• Derivați de curcumarină (Pochet și colab. 2000)
• Peptidil aldehide (Lesner și colab. 2009)
• Peptide din surse naturale (Telang et al. 2009, Roussel et al. 2001, și Chopin et al. 2000)
• Peptide care conțin un aminoacid nenatural (Legowska et al. 2009 și Wysocka et al. 2008)

Aplicații:

• Analiză de secvență
• Sinteză de peptide
• Cartografiere de peptide
• Individualizare de peptide

.