Clonarea moleculară este un set de tehnici utilizate pentru a introduce ADN recombinant dintr-o sursă procariotă sau eucariotă într-un vehicul de replicare, cum ar fi plasmidele sau vectorii virali. Clonarea se referă la realizarea a numeroase copii ale unui fragment de ADN de interes, cum ar fi o genă. În acest videoclip veți afla despre diferitele etape ale clonării moleculare, despre modul de configurare a procedurii și despre diferitele aplicații ale acestei tehnici.
Pentru a începe clonarea sunt necesare cel puțin două molecule importante de ADN. În primul rând, și cel mai important, aveți nevoie de fragmentul de ADN pe care urmează să îl clonați, cunoscut și sub numele de inserție. Acesta poate proveni de la un procariot, eucariot, de la un organism dispărut sau poate fi creat în mod artificial în laborator. Prin utilizarea clonării moleculare putem afla mai multe despre funcția unei anumite gene.
În al doilea rând, aveți nevoie de un vector. Un vector este ADN plasmidic folosit ca instrument în biologia moleculară pentru a face mai multe copii sau pentru a produce o proteină dintr-o anumită genă. Plasmidele sunt un exemplu de vector și sunt ADN circular, extra-cromozomal, care este replicat de bacterii.
O plasmidă are de obicei un situs de clonare multiplă sau MCS, această zonă conține situsuri de recunoaștere pentru diferite endonucleaze de restricție cunoscute și sub numele de enzime de restricție. Diferite inserții pot fi încorporate în plasmidă printr-o tehnică numită ligare. Vectorul plasmidic conține, de asemenea, o origine de replicare, ceea ce îi permite să fie replicat în bacterii. În plus, plasmidul are o genă antibiotică. Dacă bacteriile încorporează plasmidul, acesta va supraviețui în mediul care conține antibioticul. Acest lucru permite selectarea bacteriilor care au fost transformate cu succes.
Insertul și vectorul sunt clonate într-un organism gazdă, cel mai frecvent utilizat în clonarea moleculară este E. coli. E. coli crește rapid, este disponibil pe scară largă și are numeroși vectori de clonare diferiți produși în comerț. Eucariotele, cum ar fi drojdia, pot fi, de asemenea, utilizate ca organisme gazdă pentru vectori.
Prima etapă a procedurii generale de clonare moleculară constă în obținerea inserției dorite, care poate fi derivată din ADN sau ARNm din orice tip de celulă. Vectorul optim și organismul gazdă al acestuia sunt apoi alese pe baza tipului de inserție și a ceea ce se va face în cele din urmă cu aceasta. O reacție în lanț a polimerazei, sau o metodă bazată pe PCR, este adesea utilizată pentru a replica insertul.
Apoi, prin utilizarea unei serii de reacții enzimatice, insertul și digestul sunt unite și introduse în organismul gazdă pentru replicare în masă. Vectorii replicați sunt purificați din bacterii și, în urma digestiei de restricție, sunt analizați pe un gel. Fragmentele purificate pe gel sunt trimise ulterior pentru secvențiere pentru a verifica dacă insertul este fragmentul de ADN dorit.
Să vedem puțin mai în detaliu cum se realizează clonarea moleculară. Înainte de a începe, veți dori să vă planificați strategia de clonare, înainte de a face orice încercare de clonare la banc. De exemplu, orice vector plasmidic dat, vă va oferi un număr finit de situsuri de restricție pentru a încorpora inserția prin intermediul situsului de clonare multiplă. Va trebui să alegeți situsuri de restricție care nu se regăsesc în inserția dumneavoastră, astfel încât să nu o clivați. S-ar putea să vă confruntați cu o situație în care să fiți nevoit să uniți un fragment cu capăt bont cu unul care are o suprapunere. Dacă este așa, atunci utilizarea fragmentului klenow pentru a stabili o ligare cu capăt bont ar putea fi singura opțiune pentru a introduce inserția în vectorul dorit. Înțelegerea diferitelor instrumente de clonare moleculară pe care le aveți la dispoziție, precum și elaborarea unei strategii atente înainte de a începe clonarea poate fi un imens economizor de timp.
Sursa de ADN pentru clonarea moleculară poate fi izolată din aproape orice tip de eșantion de celule sau țesuturi prin tehnici simple de extracție. Odată izolat, se poate folosi PCR pentru a amplifica inserția.
După ce inserția este amplificată, atât ea cât și vectorul sunt digerate de enzime de restricție, cunoscute și sub numele de endonucleaze de restricție.
După ce au fost digerate, inserția și vectorul pot fi trecute pe un gel și purificate printr-un proces numit purificare pe gel. În ceea ce privește vectorul, această etapă va ajuta la purificarea plasmidelor liniarizate de plasmidă netăiată, care tinde să apară ca o pată de greutate moleculară mare pe un gel.
După purificarea pe gel a digestărilor, insertul este ligat sau unit cu plasmidul, prin intermediul unei enzime numite ADN ligază.
În general, este întotdeauna o idee bună să se stabilească ligaturi, astfel încât raportul dintre inserție și vector să fie de 3 la 1, ceea ce asigură faptul că doar o cantitate mică de vector se va autoliga. După ce ligatura a fost pregătită la gheață, aceasta este incubată la o temperatură cuprinsă între 14-25˚C, de la 1 oră până la o noapte.
În continuare, se efectuează transformarea pentru a introduce vectorul plasmidic în gazda care îl va replica.
În urma transformării, bacteriile sunt plasate pe plăci de agar cu antibiotic și incubate peste noapte la 37°C. Deoarece plasimidul conține o genă de rezistență la antibiotice, transformarea reușită va produce colonii bacteriene atunci când este cultivată pe plăci de agar în prezența antibioticelor. Coloniile individuale pot fi apoi prelevate de pe placa transformată, plasate în medii de creștere lichide în tuburi numerotate și puse într-un incubator cu agitare pentru expansiune. Un mic volum de cultură lichidă se adaugă pe o placă de agar numerotată, în timp ce restul culturii trece la purificarea plasmidelor. Schema de numerotare care denotă identitatea coloniilor bacteriene din care se vor purifica în cele din urmă plasmidele este menținută pe tot parcursul procesului de purificare a plasmidelor.
Un eșantion de plasmidă purificată este apoi tăiat cu enzime de restricție. Digestia este apoi încărcată și rulată pe gel pentru a se verifica prezența inserției, ceea ce va verifica dacă colonia bacteriană a fost transformată cu o plasmidă care conține o inserție și nu cu o plasmidă autoligată. Bacteriile pentru care s-a verificat că au fost transformate cu o plasmidă care conține un insert sunt expandate pentru purificarea ulterioară a plasmidelor. Secvențierea este utilizată ca o etapă finală de verificare pentru a confirma că gena de interes a fost clonată.
Clonarea moleculară poate fi utilizată pentru un număr aproape nelimitat de aplicații. De exemplu, atunci când un șablon de ARNm este transcris invers pentru a forma ADNc, sau ADN complementar, de către o enzimă numită transcriptază inversă și apoi se utilizează PCR pentru a amplifica ADNc, clonarea moleculară poate fi utilizată pentru a crea o bibliotecă de ADNc – o bibliotecă a tuturor genelor exprimate de un anumit tip de celule.
Clonarea moleculară poate fi, de asemenea, utilizată pentru a lua o serie de gene sau un grup de gene dintr-o tulpină bacteriană, pentru a le reorganiza în plasmide care sunt transformate într-o altă tulpină, astfel încât o întreagă cale biosintetică poate fi recreată pentru a produce o moleculă complexă.
Prin clonarea moleculară, o bibliotecă de mutanți poate fi generată prin exprimarea unei plasmide țintă într-o tulpină bacteriană specială care utilizează o polimerază predispusă la erori atunci când este cultivată la anumite temperaturi. Mutațiile pot fi caracterizate prin secvențiere. Bacteriile transformate cu gene mutante pot fi apoi testate cu diferite medicamente sau substanțe chimice pentru a vedea ce colonii bacteriene au evoluat pentru a avea rezistență la medicamente.
Grație clonării moleculare, genele reporter pot fi încorporate în plasmide de ADN, o genă reporter obișnuită este proteina fluorescentă verde sau GFP, care emite o fluorescență verde atunci când este expusă la lumină UV. O genă reporter poate fi, de asemenea, inserată într-un alfavirus pentru a arăta infecția la țânțari și transmisibilitatea în celule.
Ai urmărit videoclipul JoVEs despre clonarea moleculară. Acum ar trebui să înțelegeți cum funcționează clonarea moleculară și cum poate fi utilizată această tehnică în biologia moleculară. Ca întotdeauna, vă mulțumim pentru vizionare!