Celele T-reglementatoare (Tregs), cunoscute anterior sub numele de celule T supresoare, sunt un subset de celule T cu roluri directe atât în autoimunitate, cât și în răspunsurile la agenți patogeni.

Tregs scad inflamația prin secreția de citokine imunosupresoare (IL-10, TGF-b) și, de asemenea, prin suprimarea directă a celulelor T efectoare inflamatorii (cum ar fi celulele Th1 și Th17).

Tregs controlează și probabil previn bolile autoimune prin contribuția la menținerea toleranței la autoantigene. Beneficiul terapeutic al transferului de Treg este bine stabilit în modelele animale și sunt în curs de desfășurare eforturi pentru a începe terapii cu Treg la om pentru transplant și pentru pacienții cu diabet de tip 1.

Datorită importanței acestui subset unic de celule T în atât de multe răspunsuri imune, mulți cercetători se simt neglijenți dacă își imunofenotizează populațiile de celule de interes fără a include o măsurătoare Treg în amestec. Dar cuantificarea Treg-urilor poate fi complicată.

De exemplu – Care sunt cei mai buni markeri de utilizat? Cum știți cu siguranță că măsurați adevărate celule T supresoare?

Strategii de gating pentru definirea Tregs prin citometrie în flux

Strategia standard de gating Treg atât pentru probele de șoareci cât și pentru cele umane (după ce mai întâi ați eliminat dubletele și ați făcut gating pe celule vii) include antigenele CD3, CD4, CD25, FOXP3 și CD127.

Când se analizează numai expresia antigenului, Tregs sunt adesea definite ca fiind CD3+, CD4+, CD25hi, FOXP3+ și CD127lo (prezentate în figura de mai jos ca fiind opțiunea 1). Utilizând acești markeri, o populație clară este adesea vizibilă din eșantioane precum splenocitele de șoarece și PBMC umane.

Cu toate acestea, celulele T activate reglează adesea în sus CD25, iar expresia FOXP3 a fost găsită pe liniile de celule T „efectoare” (nesupresoare). Prin urmare, atunci când se bazează doar pe fenotipul prin citometrie în flux pentru a defini Tregs, celulele T inflamatorii ar putea fi un lup în haine de oaie (Treg) și ar putea duce la o interpretare incorectă a datelor.

O celulă poate arăta ca o rață, dar oare chițăie? Măsurarea funcțiilor efectoare ale posibilei dvs. populații de Treg va ajuta foarte mult la elucidarea acurateței strategiei dvs. de porționare a fluxului. Pentru a determina dacă celulele pe care le definiți ca fiind Tregs se aseamănă din punct de vedere funcțional cu acestea, Opțiunea 2 (a se vedea mai jos) include omiterea FOXP3 din panoul dumneavoastră, sortarea celulelor CD3+, CD4+, CD25hi, CD127lo, apoi determinarea funcțiilor populației dumneavoastră „Treg” prin analiza citokinelor și/sau prin teste de co-cultură de suprimare cu celule T non-Treg (CD3+ CD4+ CD25-, CD127hi). De obicei, FOXP3 nu poate fi inclusă în panouri în care sunt necesare celule viabile după sortare, deoarece este necesară o colorare intracelulară.

Definirea varietății tot mai mari de subseturi T

Există mai multe tipuri de Tregs, inclusiv tTregs, pTregs și iTregs.

De exemplu, tTregs (cunoscute și sub numele de nTregs) sunt generate în timus și au un repertoriu TcR care este orientat spre auto-peptide. O altă aromă, cunoscută sub numele de pTregs, este generată în periferie, iar iTregs sunt induse în cultură prin intermediul TGF-b.

Există creatori asociați cu aceste diverse subgrupuri Treg și ar trebui să se ia în considerare includerea lor într-un panou anticorp Treg dacă este de interes subsetul acestora. De exemplu, la om, CD39 este considerat un marker tTreg fiabil. De asemenea, atât la șoareci, cât și la oameni, s-a constatat că Helios distinge în mod fiabil tTregs de subseturile p, și iTreg.

Definirea unei singure celule ca Treg – este posibilă?

O limitare majoră în domeniul Treg este lipsa unui test de suprimare a unei singure celule.

Definirea unei celule T individuale ca membru al unei linii distincte de memorie, cum ar fi Th1, Th2 sau Th17, poate fi realizată prin intermediul analizei analitice cu rezoluție de celulă unică, cum ar fi colorarea citokinelor intracelulare, deoarece aceste celule sunt definite în primul rând, dacă nu exclusiv, prin citokinele pe care le produc.

Cu toate acestea, pentru a demonstra că o singură celulă este o Treg, în mod ideal dorim să putem cuantifica faptul că această celulă aleasă poate suprima funcția celulelor T efectoare (sau a altor subseturi de celule) în co-cultură. În prezent, singura modalitate de a testa funcția supresivă a Treg este într-o cultură masivă, unde se poate concluziona că unele (dar nu toate, posibil nici măcar majoritatea) dintre celulele desemnate ca Tregs sunt supresive.

Gândindu-ne din nou la potențialii lupi în blană de oaie ai „celulelor T efectoare”, pur și simplu nu știm câte celule nesupresive, chiar inflamatorii, se ascund în strategia noastră de gating Treg. Utilizarea citometriei în flux pentru a selecta și sorta mai întâi celulele viabile cu markeri compatibili cu Tregs, apoi testarea funcțională pentru a vedea dacă, ca grup, celulele definite de strategia dvs. de gating acționează cu adevărat ca Tregs, este în prezent cea mai bună modalitate de a cuantifica Tregs în eșantionul dvs.

Prin executarea strategiilor de gating corecte pentru definirea Tregs prin citometrie în flux și luarea în considerare a numărului tot mai mare de subseturi Treg, puteți identifica populațiile Treg de interes. Cheia este testarea funcțională a acestor populații după identificarea lor, deoarece, în prezent, este dificil, dacă nu imposibil, să se definească o singură celulă ca Treg. Cu toate acestea, se fac progrese în fiecare zi și, în cele din urmă, etichetarea corectă a celulelor Treg individuale va fi posibilă.

Pentru a afla mai multe despre analiza celulelor T și a altor tipuri de celule prin citometrie în flux și pentru a avea acces la toate materialele noastre avansate, inclusiv 20 de videoclipuri de instruire, prezentări, cărți de lucru și apartenența la un grup privat, înscrieți-vă pe lista de așteptare a Flow Cytometry Mastery Class.

.