2.19.2.3.3 Condiții de eluție

Soluțiile de eluție eficiente ar trebui, în mod ideal, să întrerupă interacțiunile analit-anticorp fără a afecta negativ Abs imobilizat. Un dislocant este o moleculă de reacție încrucișată foarte concentrată, capabilă să inducă o desorbție biospecifică. Moleculele de deplasare concurează cu moleculele de analit legate, iar excesul mare de deplasator asigură o desorbție cantitativă a analitului. Pentru o performanță optimă, dislocatorul trebuie să îndeplinească mai multe criterii: (1) o reactivitate încrucișată ridicată cu anticorpii imobilizați, (2) un timp de retenție semnificativ diferit de cel al analiților, deoarece excesul mare determină un vârf proeminent care poate interfera cu ușurință cu detectarea analiților, (3) o stabilitate bună și o puritate ridicată, deoarece impuritățile prezente la niveluri de doar 0,01-0,1% pot perturba cromatograma și (4) un preț scăzut, caracteristici netoxice, absența în probele reale și o detectabilitate scăzută în comparație cu analiții. În plus, este necesar un volum mare de soluție de eluție, ceea ce impune o reconcentrare pe un suport SPE clasic înainte de analiză. În consecință, sunt preferate condițiile de eluție care permit recuperarea completă a analitului țintă cu un volum de eluție mic.

Ionii haotici sunt utilizați în mod obișnuit pentru eluția moleculelor mari, cum ar fi proteinele. Acești ioni perturbă structura de apă din jurul moleculelor mari, adică a anticorpilor și a moleculelor țintă, ceea ce induce o rupere a interacțiunilor hidrofobe din structurile moleculelor mari și dintre analit și anticorp. Cei mai răspândiți ioni haotropi sunt ionii de clorură, iodură, perclorat și tiocianat, la concentrații cuprinse între 1,5 și 8 mol l-1. Cu toate acestea, diferitele soluții apoase care pot fi aplicate cu succes pentru desorbția proteinelor din SI s-au dovedit a fi incapabile de a desorbi moleculele mici. Probabil că desorbția proteinei se bazează în principal pe modificări ale structurii proteinei legate (denaturare parțială), și nu pe modificări ale structurii anticorpilor imobilizați. Prin urmare, eluția moleculelor mici, care nu sunt sensibile la denaturare, necesită condiții mult mai riguroase. În plus, cu o creștere a temperaturii de la 4 la 43 °C, constanta de disociere a interacțiunilor anticorp-anit poate crește cu două ordine de mărime. Această metodă nu este suficient de eficientă pentru a fi aplicată la eluția moleculelor mici. Eluția cu soluții cu pH scăzut este adesea efectuată pentru a desorbi moleculele mici din IS, dar sunt necesare trei unități de pH de la punctul izoelectric al anticorpului. Acest tip de eluție (deplasare a pH-ului fără a modifica forța ionică) evită deteriorarea anticorpilor labili. Un inconvenient este că sunt încă necesare volume mari pentru desorbția completă, scăzând astfel factorii de îmbogățire asociați cu procedurile de extracție.

O eluție eficientă a moleculelor mici dintr-un SI poate fi obținută cu un volum redus al unui amestec de modificator apă-organic. Cu titlu de exemplu, figura 6 prezintă profilul de eluție a două erbicide, isoproturon și atrazină, după percolarea unei probe de apă îmbogățită cu fiecare analit pe SI corespunzător. Au fost evaluați mai mulți solvenți de eluție (metanol, etanol și ACN) amestecați cu apă.

Figura 6. Profilurile de eluție ale atrazinului, izoproturonului, 2,4,6-triclorofenolului și pentaclorofenolului din SI corespunzătoare, utilizând soluții de eluție care conțin cantități crescânde de solvent organic în apă acidificată sau neacidificată, după percolarea probelor de apă îmbogățite cu fiecare analit. ACN, acetonitril; MeOH, metanol; EtOH, etanol; AA, acid acetic; TFA, acid trifluoroacetic.

Profilele de eluție rezultate depind în mare măsură de natura solventului. Cei trei solvenți testați permit eluția completă a ambilor analiți. Cu toate acestea, ACN prezintă cea mai mare putere de eluție: cel mai mic conținut al acestui solvent asigură o eluție completă a ambilor analiți. Un conținut de ACN de 40 % și 60 % este suficient pentru a recupera izoproturonul și, respectiv, atrazina, în timp ce este necesar un conținut de metanol de 60 % și 80 %. În acest caz, puterea de eluție a solventului pare să fie legată de natura sa hidrofobă, ACN (parametrul de solubilitate Hildebrand δ = 24,3 MPa1/2) fiind mai puțin polar decât etanolul (δ = 26,0 MPa1/2) și metanolul (δ = 29,7 MPa1/2). Aceste rezultate par să indice faptul că interacțiunile dintre erbicide și anticorpii lor corespunzători sunt în principal de natură hidrofobă. Prezența solvenților nepolari reduce componenta de legare hidrofobă a interacțiunii anticorp-anit. Cu toate acestea, afectează, de asemenea, stabilitatea legăturilor hidrofobe, menținând structura terțiară a anticorpilor, și are ca rezultat eliberarea antigenului. Aceste exemple legate de eluția atrazinei sau a izoproturonului din SI corespunzătoare arată că o eluție eficientă va fi obținută prin adăugarea directă a unei cantități mari de metanol sau ACN, 70-80%, în fracția de eluție. Această cantitate mare de modificator organic va permite reducerea cât mai mult posibil a volumului fracției de eluție, permițând astfel concentrarea analitului în eluat. Trebuie să se aibă grijă ca alegerea modului de legare să fie compatibilă cu aceste condiții de eluție. Utilizarea legării necovalente împiedică posibilitatea de a aplica o cantitate atât de mare de modificator fără riscul de a întrerupe legarea anticorpilor de sorbent. Utilizarea unui procedeu sol-gel pentru imobilizarea anticorpilor limitează, de asemenea, posibilitatea de a utiliza o cantitate mare de solvent organic. S-a demonstrat că o cantitate mare de modificator organic, cum ar fi anticorpii, determină leșierea anticorpilor din matricea sol-gel.8

Uneori este necesară o combinație de solvent organic și acid organic. Figura 6 prezintă, de asemenea, profilul de eluție al 2,4,6-tricorofenolului și al pentaclorofenolului dintr-un SI anti-pentaclorofenol folosind un amestec hidro-organic cu și fără adăugarea unui acid în soluția de eluție. Triclorofenolul a putut fi recuperat complet folosind fie apă/ACN (20:80, v/v), fie apă/ACN (30:70, v/v) acidificată la pH 3 cu acid trifluoroacetic (TFA). În cazul în care s-a obținut o acidificare cu acid acetic (AA) 1% (v/v), un amestec conținând doar 30% ACN a fost eficient pentru eluție. În schimb, eluția pentaclorofenolului, care are o afinitate mai mare pentru PAbs decât triclorofenolul, a fost imposibilă cu ACN pur sau ACN acidificat cu TFA. Desorbția a putut fi realizată numai cu apă/ACN 20:80 (v/v) conținând 1% AA (v/v).

Prin urmare, în majoritatea procedurilor off-line, inclusiv cele recomandate prin utilizarea de SI comerciale de unică folosință, desorbția se realizează cu un procent ridicat de solvent organic, uneori la un pH scăzut.

În concluzie, alegerea condițiilor de eluție depinde în primul rând de afinitatea dintre anticorpi și analiți. Depinde, de asemenea, de natura analitului, din cauza raportului dintre interacțiunile electronice și hidrofobe implicate în interacțiunile antigen-anticorp. În cele din urmă, depinde de strategia de imobilizare a anticorpilor; legarea necovalentă împiedică utilizarea unor cantități mari de solvenți organici.

.