Invasion Assay

Materiale:

Placă de cultură de țesut Falcon cu 24 de godeuri

Insertul de cultură celulară Falcon:Dimensiunea porilor 8μm, format 24 de godeuri

Cat# 3097

Matrigel (diluat înDMEM/F12)

5% Glutaraldehidă în 1XPBS

0.5% albastru de toluidină în 2% Na2CO3

Pregătireacameră Boyden:

1. Utilizând o pensă sterilă, scoateți inserțiile de perete celular din ambalajul lor și puneți-le în godeurile unei plăci cu 24 de godeuri.
2. Spălați inserțiile de 2 ori cu 300μl DMEM/F12

(Aveți grijă să nu înjunghiați membrana)

1. Adaugați 20μl de Matrigel diluat în proporție de 1:6 (2-3 mg/ml de proteină) în centrul fiecărei inserții cu celule. Întindeți ușor Matrigel-ul pe întreaga suprafață a membranei.
2. Puneți inserțiile acoperite în incubator pentru a permite ca Matrigel-ul să se solidifice timp de 20-30 min.

Prepararea celulelor pentru analiză:

1. Tratați și creșteți celulele în conformitate cu condițiile experimentale. Poate fi de dorit să se sincronizeze celulele la aceeași stare de creștere.
2. Tripsinizarea și numărarea celulelor
3. Îndepărtați tripsina și resuspendați cu mediu proaspăt.
4. Se plasează 1X105 celule în 200 μl de mediu definit în camera superioară.
5. Se adaugă 300 μl de mediu în camera inferioară.
6. Culture timp de aproximativ 20 de ore.

Timp variază pentru diferite linii celulare și poate fi de până la 48 de ore pentru celulele mai puțin invazive.

Fixare și colorare:

1. După cultivare, aspirați mediul din camera inferioară
2. Adaugați 0,5 ml de glutaraldehidă 5% în 1XPBS, incubați timp de 10 min. @ R.T
3. Aspirați soluția de Glutaraldehidă, spălați fiecare puț de 3 ori cu D.W
4. Adaugați 0,5 ml de soluție de colorare cu albastru de toluidină 0,5% în camera inferioară, incubați timp de 10-20 min @ R.T
5. Aspirați soluția atât din camera superioară, cât și din cea inferioară, spălați camera inferioară de 3 ori cu D.W
6. Ștergeți cu grijă suprafața interioară a camerei superioare folosind un tampon de bumbac. (Aveți grijă să nu apăsați prea tare, membrana poate să se desprindă.) Celulele invadate se vor afla în centrul părții inferioare a membranei.
7. Contează numărul de celule cu obiectivul q 20X al microscopului. Numărați cel puțin 3 câmpuri pe membrană.