Azida de sodiu induce apoptoza mediată de mitocondrie în celulele PC12 prin intermediul căii de semnalizare asociată cu Pgc-1α

Introducere

Ca o pulbere albă, incoloră și cristalină, azida de sodiu (NaN3) este clasificată ca o substanță foarte toxică. Efectele sale toxice sunt similare cu cele ale cianurii și lezează sistemul nervos și cardiovascular, ochii și pielea. Acest toxicelement devine activ rapid după ingestie, iar efectele sale majore apar la câteva ore după administrarea orală, în funcție de cantitatea ingerată (1,2). Expunerea la NaN3 poate induce o serie de simptome în câteva minute, inclusiv greață, vărsături, dureri de cap, neliniște, amețeli, slăbiciune, respirație rapidă și bătăi rapide ale inimii (3). Cantități mari din acest element toxic induc imediat convulsii, pierderea cunoștinței, ritm cardiac și tensiune arterială scăzute și insuficiență respiratorie, ducând în cele din urmă la mortalitate (3). Dintre mecanismele de acțiune demonstrate ale NaN3, cel mai relevant este inhibarea complexului complexului de lanț respirator al citocromecoxidazei-oxidazei-respiratorii (4). Studii anterioare au arătat că NaN3, un inhibitor al complexului IV (Cox IV), poate induce apoptoza în neuronii corticali primari, care este dependentă de caspaza-3 și asociată cu eliberarea de citocrom c (5).

În biosinteza mitocondrială, promotorul lanțului respirator Cox IV poate fi activat de factorii respiratori nucleari (Nrf)-1/2. Concomitent, Nrf poate fi ajustat prin reglareaactivității genelor care codifică factorul de transcripție mitocondrial A(Tfam) pentru a regla indirect nivelurile de expresie ale genelor lanțului respirator. Nrf-1/2, Tfam, peroxisome proliferator-activatedreceptor γ co-activator 1-α (Pgc-1α) și alți co-activatoriconstituie cascada de semnale Pgc-1α, care joacă un rol central într-o rețea de reglementare care guvernează controlul transcripțional al biogenezei mitocondriale și al funcției respiratorii. În această cascadă de semnal, Pgc-1α activează mai întâi Nrf-1/2, spre deosebire de legarea directă la ADN mitocondrial, iar Nrf-1/2 induce activarea Tfam în combinație cu promotorul Tfam și declanșează transcrierea și replicarea ADN-ului mitocondrial, ceea ce duce la creșterea nivelului de expresie a proteinelor mitocondriale(6). Concomitent, Pgc-1α poate fi activată de căile de semnalizare mediate de CaN-, Ca2+/proteinkinaza dependentă de Ca2+/calmodulină (CaMK), proteina kinaza activată de mitogen (MAPK) și kinaza dependentă de ciclină (7). În studiul de față, celulele PC12 au fost utilizate pentru a genera un model de neuron dopamină și au fost investigate efectele și mecanismul NaN3 asupra căilor asociate cu Pgc-1α în celulele PC12, pentru a identifica dacă NaN3 a indus toxicitate în celulele PC12 cultivate și mecanismele de bază implicate în aceste efecte.

Materiale și metode

Materiale

Celele de feocromocitom PC12 de șobolan au fost achiziționate de la Banca de Celule a Colecției de Cultură de Tip a Academiei Chineze de Științe (Shanghai, China). Soluția stoc de NaN3 (Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Germania) a fost dizolvată în soluție salină sterilă pentru a obține o soluție stoc de 1 M, care a fost ulterior diluată la concentrațiile dorite înainte de experimentări. S-a folosit un kit de testare a apoptozei TUNEL într-o singură etapă (C1090), un kit de detectare a apoptozei Annexin V-fluoresceină izotiocianat (FITC) (C1063), un kit de testare a adenozinei 5′-trifosfatului (ATP) îmbunătățit (S0027), Kitul de testare a potențialului membranei mitocondriale JC-1 (C2006) și kitul de testare a speciilor reactive de oxigen (S0033) au fost furnizate de Institutul de Biotehnologie Beyotime (Haimen, China).

Cultura celulară și testul de viabilitate

Celele PC12 au fost menținute în mediu Dulbecco’s modifiedEagle’s medium (DMEM; Hyclone; GE Healthcare Life Sciences, Logan,Logan, UT, SUA) suplimentat cu 10% ser fetal bovin (FBS; Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, SUA) și soluție antimicotică antibiotică de 1% compusă din 10.000 U de penicilină și 10.000 U de streptomicină. Celulele au fost incubate la 37°C într-o atmosferă inumidificată cu 5% CO2 și au fost folosite întotdeauna la70-80% confluență.

Viabilitatea celulelor PC12 a fost determinată cu ajutorul unuiCell Counting Kit (CCK-8; Dojindo Molecular Technologies, Inc.,Shanghai, China). Celulele au fost însămânțate în plăci cu 96 de puțuri la o densitate de 1×105/puț. După 24 de ore de cultură, celulele au fost tratate cu NaN3 (0-80 mM) și incubate timp de 12, 24, 48 și 72 de ore pentru a stabili modelul de leziune celulară. Ulterior, s-au adăugat 10 µl de soluțieCCK-8 (Dojindo Molecular Technologies, Inc.) la fiecare gode și s-au incubat timp de încă 2 ore în condiții standard (37°C și 5% CO2). Absorbția la o lungime de undă de 450 nm a fost determinată cu ELx808 Absorbance MicroplateReader (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, SUA). Viabilitatea celulară a fost calculată în funcție de densitatea optică medie a 6 godeuri. Experimentele au fost efectuate în trei exemplare. Concentrațiile adecvate de NaN3 pentru utilizarea în experimentele ulterioare au fost determinate în funcție de rezultatele testelor de viabilitate celulară.

Morfologia nucleară a celulelorPC12 colorate cu DAPI

CelelePC12 au fost expuse la 0, 10, 20 și 40 mMNaN3 timp de 24 de ore. Pentru a distinge moartea celulară programată de moartea celulară neapoptotică, nucleii au fost colorați cu 10µg/ml DAPI (C1005; Beyotime Institute of Biotechnology). Pe scurt, celulele au fost spălate de două ori cu PBS și apoi fixate cu paraformaldehidă 4% la temperatura camerei timp de 30 de minute. După trei spălări, celulele fixate au fost colorate cu DAPI (1:5.000) timp de 5 minute și apoi spălate cu PBS. Imaginile de fluorescență au fost achiziționate cu un microscop de fluorescență Leica DMI (mărire, ×400).

Măsurarea ratei de apoptoză

Un kit de detectare a apoptozei Annexin V-FITC/PI (Beyotime Institute of Biotechnology) a fost utilizat pentru a determina apoptoza celulelor în conformitate cu instrucțiunile producătorului.Experimentele au fost repetate în trei exemplare și au fost efectuate după cum urmează: Ratele apoptotice ale celulelor PC12 de control (0 mMNaN3) și ale celulelor PC12 expuse la 10, 20 și 40 mMNaN3 timp de 24 de ore au fost măsurate prin citometrie de flux (FC500; Beckman Coulter, Inc., Brea, CA, SUA). Analizele statistice au fost efectuate cu software-ul statistic SPSS v.13.0 (SPSS, Inc.,Chicago, IL, SUA).

Măsurarea potențialului membranar mitocondrial (ΔΨm)

ΔΨm este un parametru semnificativ al funcției mitocondriale. Acesta a fost evaluat cu ajutorul colorației cu JC-1, o sondă fluorescentă. Experimentele au fost repetate în trei exemplare și au fost efectuate după cum urmează: Celulele PC12 de control au fost tratate cu 0 mMNaN3; iar celulele PC12 experimentale au fost expuse la 10, 20 și 40 mM NaN3 timp de 24 de ore. Ulterior, în conformitate cu protocolul producătorului (C2006; Mitochondrial Membrane PotentialAssay kit; Beyotime Institute of Biotechnology, Haimen, China), celulele au fost incubate cu mediul care conține JC-1 (1X) la 37°C timp de 20 de minute, celulele au fost spălate de trei ori cu tampon de spălare și au fost colectate cu mediu proaspăt fără ser. Concomitent, controlul pozitiv a fost tratat cu cianură de carbonil-3-clorofenilhidrazonă (CCCP), un inhibitor, (10 µM) la 37°C timp de 20 de minute. Apoi, fluorescența roșie/verde a fost determinată prin FCM (FC500; Beckman Coulter, Inc.). Rapoartele dintre intensitatea fluorescenței roșii și intensitatea fluorescenței verzi au reprezentat nivelurile de ΔΨm.

Măsurarea producției de specii reactive de oxigen (ROS)

ROS în celulele PC12 a fost evaluată cu ajutorul unui kit de testare a speciilor reactive de oxigen (S0033; Beyotime Institute ofBiotechnology, Haimen, China). Generarea intracelulară de ROS a fost evaluată cu ajutorul diacetatului de 2′,7′-diclorofluoresceină (DCFH-DA), o sondă fluorescentă. ROS intracelulare oxidează DCFH-DA, producând compusul fluorescent 2′,7′-diclorofluoresceină (DCF), iar intensitatea fluorescenței DCF este considerată a fi paralelă cu cantitatea de ROS formată, în conformitate cu instrucțiunile kitului de testare ROS.Experimentele au fost repetate în trei exemplare și au fost efectuate după cum urmează: Controlul pozitiv a fost tratat cu o concentrație specifică de Rosup (50 mg/ml); celulele PC12 de control au fost tratate cu 0 mMNaN3; iar celulele PC12 experimentale au fost expuse la 10, 20 și 40 mM NaN3 timp de 24 de ore. În plus, celulele PC12 au fost tratate cu DCFH-DA (10 mM) dizolvat în DMEM fără ser (1:1.000) timp de 20 de minute la 37°C și apoi au fost spălate de trei ori cu DMEM fără ser. Controlul pozitiv a fost tratat cu Rosup, pentru a induce producerea de ROS. Producția de ROS a fost determinată prin FCM (FC500; Beckman Coulter, Inc.). Intensitățile medii de fluorescență (MFI) au reprezentat nivelurile de ROS.

Măsurarea conținutului de ATP celular în celulelePC12

Experimentele au fost repetate în trei exemplare și au fost efectuate după cum urmează: Celulele PC12 de control au fost tratate cu 0 mMNaN3; iar celulele PC12 experimentale au fost expuse laNaN3 la diferite concentrații (10, 20 și 40 mM) timp de 24 h. Ulterior, conținutul de ATP celular a fost determinat cu ajutorul unui kit de testare a ATPFirefly Luciferase (Beyotime Institute ofBiotechnology) în conformitate cu protocolul producătorului.

Analiză Western blot

Celele PC12 au fost expuse la 0, 10, 20 și 40 mMNaN3 timp de 24 de ore, au fost lizate în tamponul de analiză de radioimunoprecipitare (Beyotime Institute of Biotechnology) care conține inhibitor de aproază și au fost centrifugate la 13 362 × g timp de 10 minute la 4°C pentru a colecta supranaturile. Ulterior, concentrațiile de proteine au fost determinate cu ajutorul kitului BCA (Pierce; Thermo FisherScientific, Inc.). Cantități egale de proteine (90 µg) au fost supuse la 10 și 12% SDS-PAGE, apoi au fost transferate pe membrane de fluorură de poliviniliden (0,45 µm) cu ajutorul unei unități de electrotransfer Semidry (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, SUA). După blocarea cu 5% albumină serică bovină în TBS conținând 0.1% Tween-20 (TBST) timp de 2 ore la temperatura camerei, membranele au fost incubate cu anticorpi primari împotriva Pgc-1α (Abcam, Cambridge, MA, SUA; 1:500), Nrf-2 (Abcam; 1:500), Cox IV (Abcam; 1:1.000), Tfam (Abcam; 1:1.000), procaspază-3 (Abcam; 1:500), Nrf-1 (Cell SignalingTechnology, Inc, Danvers, MA, SUA, 1:500), pan-calcineurină A (CaN;Cell Signaling Technology Inc.; 1:1.000), fosforilat (p)-CaMKII(Cell Signaling Technology; 1:1.000), p-p38 MAPK (Cell SignalingTechnology, Inc.; 1:1.000), p-extracellular signal-regulated kinase(Erk)1/2 (Cell Signaling Technology, Inc.; 1:1.000), B-cell-lymphoma-2 (Bcl-2)-associated X protein (Bax; Santa CruzBiotechnology, Inc., Dallas, TX, SUA; 1:200), Bcl-2 (Santa CruzBiotechnology, Inc.; 1:200) și citocrom c (Santa CruzBiotechnology, Inc.; 1:200) la 4°C peste noapte. Membranele au fost apoi spălate cu TBST și incubate cu anticorpi secundari conjugați cu peroxidază de hrean-radish (HRP) (iepure; nr. de cat. A0208; 1:1.000; sau șoarece; nr. de cat. A0216; 1:1.000; ambele la Beyotime Institute of Biotechnology) timp de 1 h la temperatura camerei. Benzile imunoreactive au fost vizualizate cu ajutorul sistemului de chemiluminescență îmbunătățită (ClinxScience Instruments Co., Ltd., Shanghai, China) și analizate cantitativ cu Image J versiunea l.32 J (National Institutes ofHealth, Bethesda, MD, SUA), iar β-actina a fost selectată ca și control de încărcare.

Analiză statistică

Toate analizele statistice au fost efectuate cu software-ul SPSSstatistical v.13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, SUA). Datele sunt exprimate ca medie ± abaterea standard eroarea standard a mediei. Semnificația statistică a diferențelor dintre grupuri a fost determinată prin analiza varianței într-o singură direcție urmată de testele post-hocBonferroni. P<0,05 a fost considerat a indica o diferență semnificativă din punct de vedere statistic. Fiecare experiment a fost repetat de cel puțin trei ori.

Rezultate

NaN3 inhibă creșterea celulelor PC12

Efectul expunerii la NaN3 asupra proliferării celulelor PC12 a fost evaluat prin testul CCK-8. Celulele au fost provocate cu diferite concentrații (0-80 mM) de NaN3 timp de 12-72 h. Tabelul I și Fig. 1A-D indică faptul că viabilitatea celulară a fost diminuată de NaN3 într-o manieră dependentă de concentrație. Aproape 100% din celule au murit în urma expunerii la 80 mM NaN3 timp de 72 de ore, ceea ce indică faptul că NaN3 a indus în mod semnificativ moartea celulară, iar citotoxicitatea NaN3 a fost detectată într-o manieră dependentă de doză și de timp. Expunerea la NaN3 la o concentrație de 20 mM timp de 24 de ore a provocat o moarte celulară accentuată la celulelePC12 (50%). Prin urmare, celulele cultivate timp de 24 h au fost folosite pentru experimentele ulterioare.

Tabel I.

NaN3 suprimă creșterea celulelor PC12 (n=6).

Morfologie celulară

La colorarea cu DAPI, modificările morfologice ale celulelor PC12 au fost observate prin microscopie cu fluorescență în urma expunerii la diferite concentrații de NaN3. A fost observată fragmentarea nucleelor celulare expuse la NaN3 timp de 24 h, iar micșorarea nucleelor celulare și condensarea cromatinei au fost ușor crescute odată cu concentrația de NaN3 în celulele PC12 în comparație cu cele de control. În aceste celule, celulele apoptotice au fost mai mici și mai strălucitoare în comparație cu celulele normale. S-a observat, de asemenea, o condensare a cromatinei și o fragmentare nucleară, în timp ce în grupul de control au fost identificate nuclee albastre de celule viabile.În plus, numărul de celule apoptotice și intensitatea fluorescenței verzi au crescut în celulele expuse la NaN3 (Fig. 2).

Determinarea ratei de apoptoză prin colorația cu anexină V-FITC

Celele moarte sau celulele apoptotice târzii care și-au pierdut integritatea membranei celulare pot fi colorate cu iodură de propidiu. Datorită pierderii acestei integrități a membranei celulare, Annexin V-FITC poate intra în citoplasmă și se poate combina cu fosfatidilserina din interiorul membranei celulare, prezentând fluorescență verde în celulele moarte.Fig. 3 demonstrează că numărul de celule apoptotice a fost de 5,03, 8,02, 43,77 și 78,67% (P<0,05) în celulele PC12 în urma expunerii la NaN3 la diferite concentrații (0, 10, 20 și 40 mM) timp de 24 h, respectiv. Aceste rezultate au confirmat, de asemenea, că NaN3 a indus apoptoza celulară într-un mod dependent de doză.

Schimbări ale potențialului membranar mitocondrial (ΔΨm)

Mitochondriile sunt considerate, în general, organite de reglare cheie implicate în viabilitatea celulară. Prin urmare, ΔΨm a fost folosit ca indicator al funcției mitocondriale. Celulele PC12 au fost colorate cu JC-1, un colorant cationic care prezintă o acumulare dependentă de potențial în mitocondrii. Fluorescența roșie (agregate J), care reprezintă mitocondrii active cu potențial de membrană stabil, a fost observată într-un număr mic de celule expuse la concentrații crescânde de NaN3. În schimb, fluorescența verde (J-monomer), care reprezintă mitocondrii apoptotice cu ΔΨm deteriorat, a fost observată într-un număr de celule. Raportul dintre fluorescența roșie și verde a scăzut treptat în grupul de control (Fig. 4).

Acumularea indusă de NaN3 a ROS mitocondriale

Este bine cunoscut faptul că mitocondriile sunt sursa primară de ROS celulare, iar ROS servesc un rol important în inactivarea semnalizării apoptotice. Prin urmare, rolul ROS în moartea celulelor PC12 indusă de NaNaN3 a fost investigat suplimentar. Fig. 5 indică faptul că intensitățile de fluorescență în celulele de control și în celulele expuse la NaN3 la diferite concentrații (0, 10, 20 și 40 mM) timp de 24 h au fost de 3,65, 6,99, 18,63 și 39.35, respectiv, indicând că expunerea la NaN3 a crescut semnificativ producția de ROS mitocondriale în comparație cu grupul de control (P<0,05). Aceste rezultate au sugerat că apoptoza indusă de NaN3 a îmbunătățit producția de ROS intracelulare.

NaN3 reduce producția de energie mitocondrială a ATP-ului celular

Pentru a evalua conținutul de ATP în celulele PC12 expuse la NaN3, unitatea de luminescență relativă (RLU) a fost determinată cantitativ cu ajutorul unui luminometru. Fig. 6 indică faptul că NaN3 a inhibat producția mitocondrială de ATP și a scăzut treptat nivelul ATP celular (P<0,05).

Nivelurile de expresie ale Pgc-1α și ale proteinelor asociate cu apoptoza în celulele PC12

Expresia Pgc-1α la nivel de proteine a scăzut semnificativ în urma expunerii la NaN3 în comparație cu controlul (P<0,05). În plus, Nrf-1, Tfam, p-Erk1/2,Nrf-2 și Cox IV sunt ținte binecunoscute în aval ale dinamicii Pgc-1α în diferite tipuri de celule (8). Studiul de față a identificat că expunerea la NaN3 a inhibat semnificativ dinamica Pgc-1α într-o manieră dependentă de doză (P<0,01; Fig. 7A).

În plus, expunerea la NaN3 a crescut nivelurile de expresie ale Bax și citocromului c, în timp ce a redus nivelurile de expresie ale Bcl-2 și procaspazei-3 (P<0,05). Raportul Bax/Bcl-2 a fost, de asemenea, semnificativ crescut în comparație cu grupul de control (P<0,05; Fig. 7B).

Au fost evaluate, de asemenea, nivelurile de expresie proteică ale altor membri importanți, inclusiv CaN, CaMKII, p-CaMKII, p38 MAPK și p-p38 MAPK. Rezultatele au indicat că NaN3 a crescut expresia CaN și fosforilarea CaMKII și p38 MAPK în comparație cu grupul de control, în timp ce nivelurile de expresie ale CaMKII total și p38 MAPK nu au fost modificate. În plus, raporturile p-CaMKII/CaMKII și p-p38/p38 MAPK în grupul NaN3 au crescut semnificativ în comparație cu cele din grupul de control (P<0,01; Fig. 7C).

Discuție

Pentru a determina dacă NaN3 a inhibat proliferarea celulelor PC12, numărul de celule tratate în faza logaritmică a fost comparat cu numărul de celule de control netratate. Creșterea celulelor a fost inhibată cu ~75% după 24 h de expunere la 20 mM NaN3. Prin urmare, această concentrație a fost utilizată pentru experimentele ulterioare. Apoptoza implică modificări ale morfologiei celulare, inclusiv sângerarea membranei, contracția celulelor, condensarea cromatinei, fragmentarea nucleară și fragmentarea ADN-ului(9). Pentru a analiza în plus morfologia nucleară a apoptozei și rata de apoptoză, celulele au fost provocate cu 0, 10, 20 și 40 mM NaN3 timp de 24 h. După tratament, celulele au fost colorate cu DAPI și AnnexinV-FITC/PI, iar distribuția nucleelor a fost analizată. Rezultatele au confirmat că expunerea la NaN3 a indus apoptoza în celulele PC12 într-o manieră dependentă de concentrație.

Mitochondriile sunt implicate în numeroase funcții metabolice, inclusiv menținerea pH-ului intracelular și producerea de ROS, care promovează și reglează apoptoza celulară (10). Semnele distinctive ale apoptozei celulare suntprecedate de alterări mitocondriale, inclusiv o pierdere de ΔΨm, o scădere a producției de energie (ATP) și o creștere a permeabilității membranei mitocondriale. Studiile anterioare au sugerat căROS declanșează leziuni ale lanțului respirator mitocondrial și induce pierderea ΔΨm, care sunt factorii care mediază sau amplifică disfuncția neuronală în cursul degenerării neuronale, ducând, în consecință, la dezvoltarea bolilor neurodegenerative (11,12).Se știe că NaN3 determină degenerarea și excitotoxicitatea prin creșterea potențialului de permeabilitate a membranei mitocondriale prin peroxidarea lipidelor (13-15), iar NaN3 își exercită acțiunea toxică primară prin inhibarea funcției citocrom oxidazei în lanțul mitocondrial de transport de electroni și prin împiedicarea producției de ATP (4). În studiul de față, FCM a fost utilizată pentru a identifica ΔΨm și producția de ROS în celulele PC12. În plus, a fost examinată sinteza ATP în mitocondrii în urma expunerii la diferite concentrații de NaN3. Perturbarea membranei plasmatice, creșterea producției mitocondriale de ROS și scăderea conținutului celular de ATP observate au sugerat că expunerea la NaN3 a indus apoptoza în celulele PC12.

Moartea celulară mitocondrială poate fi activată de mai mulți stimuli, inclusiv programul de dezvoltare, deteriorarea ADN-ului, stresul reticulului endoplasmatic, factorul de creștere și privarea de nutrienți, infecția virală și stresul oxidativ (16). În calitate de membru al familiei în continuă creștere de co-regulatori nucleari, Pgc-1α poate activa un set mare de gene și poate regla nivelurile de expresie ale genelor implicate în metabolismul energetic ca răspuns la căile de semnalizare care mediază termogeneza, gluconeogeneza, schimbarea tipului de fibre musculare și biogeneza mitocondrială (17).Acești coregulatori există și funcționează în complexe multiproteice mari, în care, mai degrabă decât să se lege de ADN, ei regleazăNrf-1/2 și Tfam și modulează puterea lor transcripțională prin promovarea interacțiunilor biochimice ulterioare necesare pentru inducerea sau reprimarea transcripției genice (8). În plus, Nrf-1/2 controlează, de asemenea, în mod indirect, expresia genelor codificate de ADN mitocondrial prin inducerea potențială a Tfam A, B1 și B2 codificate nuclear (Tfam, Tfb1m și, respectiv, Tfb2m), care sunt regulatori ai transcrierii și replicării genomului mitocondrial (18). Studiile anterioare au demonstrat că NaN3 este un inhibitor al complexului IV al lanțului respirator mitocondrial, care este frecvent afectat în tulburările mitocondriale primare (19,20).În studiul de față, expresia cascadei de semnal Pgc-1α, inclusiv a proteinelor din familia Pgc-1α (Pgc-1α, Nrf-1, Nrf-2 și Tfam) și Cox IV, a fost mai întâi examinată în celulele PC12 pentru a verifica dacă aceste evenimente de semnalizare sunt implicate în apoptoza indusă de NaN3. Rezultatele au sugerat că apoptoza indusă de NaN3 a fost asociată cu nivelurile de expresie ale proteinelor din familia Pgc-1α și Cox IV în calea de semnalizare mediată de mitocondrii. Atunci când concentrațiile de NaN3 au fost crescute,nivelurile de expresie ale acestor proteine au fost semnificativ diminuate, ceea ce indică faptul că acestea pot fi implicate în activarea și dezvoltarea apoptozei.

În mod invers, complexul IV poate declanșa apoptoza în neuronii corticali primari, care este dependentă de caspaza 3 și asociată cu eliberarea de citocrom c (5). Este bine cunoscut faptul că mitocondriile sunt regulatori-cheie ai apoptozei celulare. Proteinele din familia Bcl-2 sunt inițiatorii importanți ai căii apoptotice mitocondriale. Această familie include proteinele proapoptotice Bax, Bcl-2 homologous Bcl-2 antagonist/killer și Bcl-2-asociat agonist al morții celulare și proteinele antiapoptotice Bcl-2 și Bcl-extra large (Bcl-xL). În celulele sănătoase, Bax este o proteină citosolică inactivă, dar estetranslocată în mitocondrii în timpul apoptozei. Își exercită efectele pro-apoptotice prin formarea unui por în membrana mitocondrială, prin care citocromul c este eliberat în citoplasmă, ceea ce duce la activarea caspazei 3 (21). Proteinele antiapoptotice Bcl-2 și Bcl-xL suprimă funcția Bax prin menținerea integrității membranei mitocondriale, ceea ce împiedică eliberarea citocromului cand și activarea caspazei 3 (22). În studiul de față, NaN3 a crescut nivelurile de Bax pro-apoptotic și de citocrom c și a scăzut nivelurile de Bcl-2 antiapoptotic și de procaspază 3, indicând că NaN3 a inițiat semnalizarea apoptozei mitocondriale în celulele PC12.

În plus, nivelurile de expresie ale co-activatorilor Pgc-1α sunt foarte ușor de indus la nivel transcripțional prin intermediul unei varietăți de căi de semnalizare în amonte. De exemplu, expresia Pgc-1α este indusă de exercițiile fizice și de expunerea la frig sub controlul semnalizării stresului prin intermediul semnalizării Ca2+ celulare și a adenozinei 5′-monofosfatului ciclic (cAMP) (23). Transcrierea Pgc-1α poate fi influențată de CaMK, calcineurină, receptorul β-adrenergic/cAMP și p38MAPK (24-26). În plus, p38 MAPK aparținând familiei MAPK are o funcție centrală în proliferarea celulară, diferențierea, transformarea și apoptoza, deoarece activarea apoptozei poate induce Pgc-1α prin fosforilare directă (27). În studiul de față, au fost examinate nivelurile de expresie ale proteinelor din căile de semnalizare a Ca2+ (pan-calcineurina A și p-CaMKII/CaMKII) și calea p38 MAPK (p-p38MAPK/p38 MAPK și p-Erk1/2) pentru a investiga efectele NaN3 asupra homeostaziei Ca2+ intracelulare și a p38 MAPK. Datele au indicat că nivelurile proteice ale pan-calcineurinei A și ratele p-CaMKII/CaMKII și p-p38MAPK/p38 MAPK au crescut, iar nivelul p-Erk1/2 a scăzut în grupul tratat cu NaN3, sugerând că NaN3 a declanșat apoptoza celulelor PC12 într-o manieră dependentă de doză, iar o astfel de activare a fost asociată cu căile Ca2+ și p38 MAPK. Luate împreună, aceste rezultate experimentale au confirmat că NaN3 poate induce apoptoza celulelor PC12 prin activarea căilor Ca2+ și p38 MAPK. Din câte știm noi, studiul de față a arătat pentru prima dată că NaN3 a indus apoptoza mediată de mitocondrie în celulele PC12 prin intermediul căilor de semnalizare asociate cu Pgc-1α, inclusiv Ca2+/p-CaMKII și p38 MAPK.

În concluzie, studiul de față a demonstrat că NaN3 poate induce apoptoza celulelor PC12. Pentru a elucida mecanismul toxic care stă la baza expunerii la NaN3, au fost examinate nivelurile de expresie ale unei serii de proteine pro-apoptotice (Bax și citocrom c) și proteine anti-apoptotice (Bcl-2, procaspaza-3, p-p38 MAPK, p-CaMKII și Pgc-1α). Rezultatele au confirmat că proteinele pro-apoptotice au exercitat efecte pro-apoptotice asupra celulelor PC12 prin activarea și fosforilarea CaMKII și p38 MAPK, care au stimulat activarea Pgc-1α și a procaspazei-3 în celulele PC12. Aceste date oferă o bază pentru studii ulterioare care să investigheze mecanismele de acțiune ale NaN3 la nivel molecular. Studiile viitoare pot include adăugarea de agenți de protecție, de exemplu, inhibitorul de diviziune mitocondrială 1, un derivat al quinazolinonei care este un inhibitor de diviziune mitocondrială recent identificat, înainte de tratamentul cu NaN3, pentru a investiga efectele neuroprotectoare ale agentului de protecție în atenuarea apoptozei induse de NaN3 în celulele PC12 și pentru a elucida în plus mecanismul subiacent.

Recunoștințe

Nu se aplică.

Finanțare

Studiul de față a fost sprijinit financiar de granturile de la Fundația Națională de Științe Naturale a Chinei (grantno. 81571848) și de Priority Academic Program Development ofJiangsu Higher Education Institutions.

Disponibilitatea datelor și materialelor

Seturile de date utilizate sau analizate în timpul prezentului studiu sunt disponibile de la autorul corespondent la o cerere rezonabilă.

Contribuțiile autorilor

YZ și SZ au conceput și proiectat studiul. YZ, JH,HX, TG și YW au achiziționat datele. YZ, JH și HX au analizat și interpretat datele și au redactat manuscrisul. Toți autorii au revizuit critic manuscrisul și au citit și aprobat versiunea finală a manuscrisului.

Aprobarea etică și consimțământul de participare

Nu este cazul.

Consimțământul pacientului pentru publicare