Rezultate și discuții
Două căi de oxidare a Pt în E. coli. Studiile genetice au arătat că enzima C-P liază, codificată de operonul phn, este capabilă să oxideze Pt (26). Cu toate acestea, într-un studiu recent (9), am fost surprinși să observăm că unii mutanți phn de E. coli au rămas capabili să oxideze Pt. Examinarea genotipului acestor tulpini a sugerat că locusul phoA ar putea fi implicat în oxidarea Pt. Pentru a testa această ipoteză în mod direct, am examinat tulpinile de E. coli care difereau doar în ceea ce privește locii phn și phoA în ceea ce privește capacitatea lor de a oxida Pt, demonstrată prin capacitatea lor de a crește pe medii cu Pt ca unică sursă de P. Deoarece fosfatul este necesar pentru creștere, organismele nu pot crește pe acest mediu decât dacă au capacitatea de a oxida Pt în fosfat. Tulpinile care au fost fie phoA +, fie phn + au crescut pe mediul de Pt (indiferent dacă celălalt locus a suferit mutații), în timp ce tulpinile cu mutații atât în phn, cât și în phoA nu au crescut (Fig. 1). Prin urmare, E. coli are două căi de oxidare a Pt: una dependentă de phn și una dependentă de phoA.
În sprijinul acestei ipoteze, am detectat producția de H2 dependentă de Pt atât in vitro cât și in vivo. Testele in vitro au fost efectuate aerob în flacoane sigilate, folosind BAP foarte purificat. După incubare, spațiul de cap a fost analizat pentru H2, iar porțiunea apoasă a fost analizată pentru fosfat. După cum se arată în Fig. 2B , cantități stoichiometrice de fosfat și H2 au fost produse din Pt în prezența BAP, în timp ce nici fosfat, nici H2 nu au fost produse în reacțiile de control care conțineau fie BAP, fie Pt singur.
Produsele oxidării Pt catalizate de BAP sunt fosfatul și H2 molecular.(A) Sunt indicate spectrele de rezonanță magnetică nucleară 31P decuplate cu protoni și pozițiile vârfurilor pentru controalele de 5 mM Pt și 5 mM fosfat, precum și pentru o reacție de o noapte care a conținut inițial 5 mM Pt plus 500 μg de BAP purificat. În spectrul reacției enzimatice este evident un vârf pentru Pt nereacționat și un nou vârf de fosfat, dar nu s-au obținut alți produse. Ușoara deplasare a poziției vârfului de fosfat între produsul de control și cel al reacției catalizate de BAP se datorează unor diferențe minore de pH: adăugarea de soluție stoc de fosfat la analiză a crescut înălțimea vârfului de Pi, dar nu a produs vârfuri suplimentare. Spectrele cuplate cu protoni sunt în deplină concordanță cu această interpretare (datele nu sunt prezentate). (B) Oxidarea Pt catalizată de BAP produce cantități stoichiometrice de fosfat și H2 molecular. Reacțiile in vitro care conțin componentele indicate au fost incubate peste noapte la 37°C în flacoane sigilate. Atmosfera din spațiul de cap a fost apoi analizată pentru H2 prin cromatografie în fază gazoasă cu detecție prin conductivitate termică, în timp ce faza apoasă a fost analizată pentru fosfat cu ajutorul testului cu verde de malachit. Reacțiile (3 ml) au fost efectuate în 50 mM Mops (pH 7,0) cu 50 mM Pt (pH 7,0) și 387 μg de BAP purificat, după cum se indică. S-au efectuat controale în triplicat care conțineau fie BAP, fie Pt singur, dar în aceste condiții nu s-a detectat nici fosfat, nici H2. Rezultatele in vivo arată cantitatea de H2 produsă în timpul creșterii de WM3924 (Δlac X74, Δphn 33-30, ΔhypABCDE) în bulion de glucoză/Mops 0,4 % care conține 2,5 μmol din sursa de P indicată. Deoarece acest nivel de P (500 μM) este limitativ pentru creștere, se așteaptă ca sursa de P să fie complet asimilată atunci când culturile ajung la saturație. După o noapte de creștere la 37°C în flacoane sigilate, spațiul de cap a fost analizat pentru H2 prin cromatografie în fază gazoasă cu detectare prin conductivitate termică. Atât experimentele in vitro, cât și cele in vivo au fost efectuate aerob (adică O2 a fost prezent în timpul oxidării Pt).
Măsurarea H2 in vivo este complicată de faptul că E. coli are multiple hidrogenaze care pot atât produce, cât și consuma H2. Pentru a ocoli această problemă, am construit un mutant ΔhypABCDE, care nu poate produce nicio hidrogenază activă din cauza incapacității sale de a maturiza proteinele precursoare (32). Mutantul hyp, cultivat aerob în tuburi sigilate, a produs, de asemenea, cantități aproximativ stoichiometrice de H2 în culturile cultivate cu niveluri de Pt care limitează creșterea, în timp ce nu s-a detectat H2 în culturile cultivate cu niveluri limitative de fosfat sau de ester fosfatic fosfoserină (Fig. 2B ).
Oxidarea Pt nu este o caracteristică comună a tuturor fosfatazelor alcaline. Oxidarea eficientă a Pt pare a fi o caracteristică unică a fosfatazei alcaline E. coli. Nici Bacillus subtilis, despre care se știe că produce mai multe fosfataze foarte active (33), nici P. stutzeri, despre care se știe că produce o fosfatază distinctă de BAP (în tulpini care nu au sistemul dehidrogenazei Pt) (A. K. White, S. Neuhaus, M. M. Wilson și W.W.M., date nepublicate), nu pot utiliza Pt ca sursă unică de P (Fig. 3A ), deși ambele organisme cresc pe medii cu fosfoserină ca sursă unică de P (datele nu sunt prezentate). Astfel, fosfatazele produse de aceste organisme sunt incapabile să oxideze Pt la rate care sunt suficiente pentru a susține creșterea. Am testat, de asemenea, preparatele comerciale de fosfatază intestinală de vițel (CIP) și de fosfatază alcalină de creveți (SAP) în ceea ce privește capacitatea lor de a produce fosfat din Pt (Fig. 3B ). Deși au fost produse cantități mici de fosfat de către fosfatazele eucariote după o noapte de incubare, numai E. coli BAP a fost capabilă să catalizeze reacția la viteze semnificative. Această constatare este deosebit de surprinzătoare, deoarece enzimele eucariote sunt, de fapt, fosfataze mult mai bune, cu activități specifice de până la 40 de ori mai mari decât BAP (27). Toate aceste enzime împărtășesc o homologie semnificativă (25-35% identitate) cu BAP din E. coli; în plus, majoritatea reziduurilor situsului activ, inclusiv Ser-102 (care formează un intermediar covalent fosfo-enzimatic în timpul reacției de fosfatază), sunt conservate (27).
Oxidarea Pt este unică pentru fosfataza alcalină E. coli. (A) A fost testată capacitatea lui B. subtilis și P. stutzeri de a oxida Pt, așa cum a fost demonstrată prin creșterea pe medii cu Pt ca unică sursă de P, așa cum este descris în Fig. 1. Niciunul dintre organisme nu a crescut pe mediul cu Pt, în timp ce ambele organisme au crescut pe mediul cu fosfat. Astfel, în ciuda faptului că ambele organisme au fosfataze active, niciunul dintre ele nu poate oxida Pt la rate suficiente pentru a susține creșterea. P. stutzeri WM3617 (ΔptxA-htxP, Δphn) conține mutații care elimină cele două căi de oxidare a Pt caracterizate de acest organism, dar care nu afectează expresia fosfatazei (9, 10). (B) BAP (fosfatază alcalină E. coli), SAP (fosfatază alcalină de creveți; Roche Applied Science, Mannheim, Germania) și CIP (fosfatază intestinală de vițel; Sigma) au fost testate pentru oxidarea Pt conform descrierii de mai sus. Am utilizat 56 μg din fosfataza indicată în fiecare test, ceea ce corespunde la 3 unități de fosfatază BAP, 32 SAP și 65 CIP, măsurate prin hidroliza pNPP. În ciuda activităților de fosfatază mult mai mari ale enzimelor eucariote, numai BAP a catalizat oxidarea Pt la rate semnificative. Este reprezentată media a două încercări.
Pare a fi plauzibil ca oxidarea Pt să fie catalizată de BAP printr-un mecanism similar celui utilizat pentru hidroliza esterilor de fosfat (Fig. 4A ). În consecință, Pt poate fi hidrolizat de BAP cu anionul hidrură ca grup formal de plecare. În sprijinul acestei idei, un mutant phoA cu reziduul Ser-102 al situsului activ înlocuit cu alanină nu poate utiliza Pt ca sursă unică de P, ceea ce indică faptul că acest aminoacid este necesar pentru hidroliza esterilor de fosfat (27) și pentru oxidarea Pt (Fig. 4B ). Deși transferul direct de hidride de la un substrat la un proton apos este fără precedent din punct de vedere biochimic, această reacție este rezonabilă din punct de vedere termodinamic, având în vedere potențialul puternic de reducere al cuplului fosfat-Pt (E o′ = -0,650 V). Astfel, reacția de producere a H destul de favorabilă: ΔG o′ = -46,3 kJ/mol (calculat din potențialele redox din ref. 34). Dacă modelul hidrolitic pentru oxidarea Pt se dovedește a fi corect, aceasta ar fi o reacție enzimatică foarte neobișnuită. Studiile au arătat că BAP este, de asemenea, capabilă să hidrolizeze fosfodieri (35), fosfoamide (36), esteri de sulfat (37) și tiofosfat (38). Cu toate acestea, aceste reacții au loc la viteze care sunt considerabil mai lente decât cele ale reacției de hidroliză a Pt, în ciuda faptului că implică grupe de plecare mult mai bune. De asemenea, acestea nu sunt reacții redox. Reacția analogă care implică hidroliza acizilor alchilfosfonici nu este catalizată de BAP, așa cum s-a demonstrat atât din punct de vedere biochimic (39), cât și prin incapacitatea tulpinilor Δphn de a utiliza acești compuși ca singure surse de P (13).
Oxidarea Pt de către BAP poate avea loc prin hidroliză cu anionul hidrură ca grup de plecare. (A) Mecanismul chimic de hidroliză a esterilor de fosfat de către BAP implică atacul nucleofilic al unui reziduu de serină activat (Ser-102) asupra esterului de fosfat pentru a forma un intermediar enzimatic fosfoserină. Grupa de plecare a alcoxidului dobândește rapid un proton din soluție pentru a forma alcoolul corespunzător. Pare a fi probabil ca oxidarea Pt să aibă loc prin intermediul unui mecanism similar cu anionul hidrură ca grup de plecare. (B) Rolul lui Ser-102 în oxidarea Pt a fost testat examinând dacă un mutant purtător al unei mutații Ser-102-Ala în gena phoA poate crește pe medii de Pt, așa cum este descris în Fig. 1. Mutantul nu a reușit să se dezvolte pe mediul Pt, demonstrând cerința Ser-102 din situsul activ în oxidarea Pt. Tulpina gazdă a fost BW14893 (Δlac X74, ΔphoA532, Δphn 33-30), WM3610 și WM3611 poartă integranți cu o singură copie a plasmidelor pKY1 și pKY2, care codifică gena phoA de tip sălbatic (phoA+) sau, respectiv, mutantul phoA-S102A (Ser-102-Ala).
Pt dehidrogenază (PtxD) a fost singura enzimă caracterizată in vitro care s-a demonstrat că catalizează oxidarea Pt (11). Deși detaliile reacției BAP rămân să fie elucidate, mecanismele chimice ale celor două enzime sunt clar distincte. În timp ce PtxD are nevoie de NAD ca acceptor de electroni pentru reacția redox, reacția catalizată de BAP nu are nevoie de acceptori de electroni exogeni, dar exploatează forța motrice termodinamică mare a reacției pentru a produce un produs puternic redus (H2) din apă într-o reacție în esență ireversibilă (K eq calculată = 1,1 × 108). Toate celelalte reacții cunoscute de producere a H2 funcționează mult mai aproape de echilibrul chimic și sunt de obicei reversibile. Mai mult, toate celelalte hidrogenaze cunoscute conțin fie Fe sau Ni, fie ambele, în situsurile lor active (40). Această observație include așa-numita dehidrogenază de metilen tetrahidrometanopterină de la archaea metanogenă, așa-numita dehidrogenază „fără metale” care formează H2, despre care se știe acum că conține și Fe (41). În schimb, BAP nu conține metale redox active, deși atât Zn, cât și Mg sunt necesare pentru activitatea hidrolitică (27). Tratarea BAP cu chelatori inhibă oxidarea Pt, sugerând că metalele joacă un rol în reacția Pt (datele nu sunt prezentate).
În cele din urmă, datele in vivo prezentate aici sugerează că reacția de oxidare a Pt este relevantă din punct de vedere biologic. Observarea faptului că multe bacterii posedă enzime dedicate oxidării Pt demonstrează că această trăsătură este supusă unei presiuni selective puternice în populațiile microbiene (4, 5, 9, 42). Ținând cont de acest fapt, este interesant de remarcat faptul că, deși enzimele eucariote sunt mult mai bune fosfataze, acestea sunt incapabile de oxidarea Pt. Această observație ridică posibilitatea ca E. coli BAP să nu fi evoluat pentru a fi cea mai eficientă fosfatază, ci mai degrabă pentru a fi o fosfatază cu capacitatea de a hidroliza Pt. Această idee este în concordanță cu observația curioasă că E. coli BAP este foarte puternic exprimată (până la 6% din proteina celulară totală) în condiții de foamete de fosfat (28). Explicația tradițională pentru acest fenomen este că un substrat necunoscut al BAP trebuie să fie slab hidrolizat și, prin urmare, necesită cantități masive de enzimă pentru a susține rate de creștere competitive. Cu toate acestea, deoarece există puține diferențe între ratele măsurate de hidroliză pentru o mare varietate de substraturi de ester fosfatic (39, 43), pare puțin probabil ca acest substrat slab să fie un ester fosfatic. În schimb, rata de hidroliză a Pt este substanțial mai mică decât rata de hidroliză a esterilor de fosfat, ceea ce sugerează că Pt ar putea fi substratul care explică nivelul extrem de expresie phoA observat în E. coli lipsit de fosfat.
Evident, multe detalii ale reacției BAP cu Pt rămân de elucidat. Studiul în continuare al acestei reacții unice va contribui probabil nu numai la înțelegerea chimiei redox a P și a reacțiilor de transfer de fosforil, ci și la cunoașterea transferului de hidrură, a reacțiilor de producere a H2 și a rolului compușilor P reduși în natură.
.