Studii de cercetare
În studiile noastre, am examinat o singură cultură din UE, Pisum sativum (mazăre). Mazărea este sensibilă la o gamă largă de virusuri, inclusiv Pea enation mosaic virus, Pea early browning virus și o serie de virusuri din grupul Potato virus Y (Potyviridae). În cadrul acestui ultim grup, virusul mozaicului galben al fasolei, virusul mozaicului comun al fasolei, virusul mozaicului de mazăre și virusul mozaicului transmis prin semințe de mazăre (PSbMV) sunt toți agenți patogeni importanți. În special, am studiat PSbMV, la care sunt sensibile toate culturile comerciale de mazăre. Această susceptibilitate este agravată de faptul că acest virus nu se transmite doar de la o plantă la alta prin intermediul afidelor sale vectoare, ci și pe verticală, de la o generație la alta, în semințe. Această proprietate a dus la o contaminare serioasă a colecțiilor de germoplasmă de mazăre și oferă un mijloc foarte eficient de infectare timpurie și generalizată a culturilor imediat după germinarea semințelor. Luați în considerare faptul că o eficiență de transmitere a semințelor de numai 0,1% ar duce la 10.000 de infecții după semănarea semințelor la 107/hectar, iar importanța transmiterii semințelor devine evidentă. În prezent, această problemă este contracarată prin testarea eficientă după recoltare a probelor de semințe prin imunodetecția proteinei de acoperire a virusului și prin respingerea loturilor de semințe contaminate. Ca alternativă, și întrucât transmiterea semințelor la o serie de cultivare de mazăre variază de la 0 la 100%, am cercetat dacă rezistența la transmiterea semințelor ar putea fi obținută prin selecție în linii îmbunătățite de mazăre. În cadrul încrucișărilor de testare și al încrucișărilor inverse între liniile care nu prezintă nicio transmitere sau o transmitere de 60-80%, rezistența s-a comportat ca un caracter dominant, deși în generațiile F2 și BC2 nu a segregat ca o trăsătură mendeliană. Natura cantitativă a fenotipului a sugerat că transmiterea semințelor ar fi dificil de inclus ca trăsătură de rezistență într-un program convențional de ameliorare.
Rezistența naturală la PSbMV a fost identificată în accesiuni de mazăre din Africa de Nord și Asia, deși, până în prezent, aceste gene recesive nu au fost introduse în linii comerciale. Analiza genetică a arătat că aceste gene sunt grupate cu alte gene recesive cu specificități diferite ale virusului poty în două locații din genomul mazărei. Genele sbm-1, sbm-3 și sbm-4, care conferă rezistență la patotipurile PI, L-l și, respectiv, P4 ale PSbMV, sunt localizate pe cromozomul 6, în timp ce sbm-2, care conferă, de asemenea, rezistență la patotipul L-l, este localizată pe cromozomul 2 . Cu toate că această organizare sugerează o conversie genetică locală și o translocare între cromozomii 2 și 6, alte dovezi sugerează că cele două grupuri de gene ar putea avea origini și funcții distincte. Utilizând virusuri hibride recombinante realizate între diferite tipuri patologice, determinantul de avirulență al virusului a fost definit ca fiind proteina legată de genomul virusului (VPg) pentru sbm-1 . O analiză structurală și funcțională a genei sbm-1 este subiectul unui proiect CE-Biotehnologie # BI04-CT97-2356 (www.dias.kvl.dk/eupsbmv) la care participă grupuri de cercetare și industria din Danemarca, Finlanda, Spania și Regatul Unit.
Caracterizarea genei sbm-1 va oferi recompense intelectuale și practice deosebite. Deoarece, aproximativ 20% din toate genele de rezistență la virusuri și aproximativ 40% din genele care conferă rezistență la potyvirusuri sunt recesive , înțelegerea modului în care funcționează sbm-1 și a ceea ce controlează specificitatea genei adiacente sbm- și a altor gene de rezistență la potyvirusuri va fi importantă pentru o gamă largă de boli. Cu toate acestea, proiectul sbm- se confruntă, de asemenea, cu provocări tehnice, nu în ultimul rând prin faptul că trebuie să facă față dimensiunii și redundanței din cadrul genomului mazărei. Genomul mazărei este de aproximativ 5 x 109 perechi de baze per genom haploid, de aproximativ 50 de ori mai mare decât cel al Arabidopsis thaliana. Clonarea pe bază de hartă a genelor din mazăre nu a fost realizată, iar bibliotecile mari de inserții nu sunt încă disponibile. Cu toate acestea, există potențialul de a identifica în sbm-1 o nouă clasă de gene de rezistență. Genele de rezistență clonate până în prezent de la alte specii se împart în două clase. Genele de rezistență dominante care funcționează împotriva unor virusuri, ciuperci și bacterii specifice se încadrează în general în clasa „NBS-LRR” și mediază o rezistență hipersensibilă la infecție. Singura genă recesivă care a fost clonată (mlo) mediază o rezistență nespecifică de rasă la otrăvire la orz și este, de asemenea, asociată cu localizarea agentului patogen în celulele moarte. Din punct de vedere funcțional, Mlo acționează ca un regulator negativ al rezistenței constitutive. În schimb, sbm-1 este specific rasei (sau patotipului) și nu este asociat cu moartea celulelor. Din aceste comparații, se pare că sunt posibile mai multe mecanisme funcționale pentru sbm-1. În primul rând, putem considera sbm-1 ca fiind un factor de susceptibilitate dominant, necesar pentru a ajuta la replicarea virusului. Acest lucru s-ar potrivi cu implicarea probabilă a VPg în replicarea ARN-ului viral și cu observația că protoplastele din plante rezistente nu prezintă o replicare detectabilă a virusului . În al doilea rând, la fel ca Mlo, Sbm-1 ar putea acționa ca un regulator negativ al rezistenței, deși diferențele de specificitate față de mlo ar plasa sbm-1 într-o clasă distinctă de gene de rezistență. În al treilea rând, sbm-1 ar putea fi o alelă de rezistență slabă dominantă, dar dependentă de doză. Noi favorizăm prima opțiune ca fiind cea mai directă și mai simplă interpretare.
Pentru componenta noastră în cadrul proiectului CE-Biotehnologie am optat pentru utilizarea abordărilor genetice pentru a identifica produsul genei de rezistență sbm-1. După identificarea unor linii de mazăre adecvate (o pereche BC4 de linii purtătoare de alele homozigote de rezistență și susceptibilitate) s-a folosit o strategie cDNA-AFLP pentru a identifica genele exprimate provenite din regiunea introgresată. Până în prezent, au fost identificate zece ADNc polimorfe. Aceștia sunt în curs de cartografiere cu ajutorul familiilor consangvinizate recombinate pentru a confirma originea lor genomică. Strategia noastră alternativă este de a „pescui” produsul genei sbm-1 prin utilizarea sistemului de hibridare a drojdiilor cu VPg PSbMV ca proteină momeală. Doi cADNc candidați puternici și alți opt cADNc care codifică proteine de interacțiune au fost identificați dintr-o bibliotecă de cADNc de mazăre realizată dintr-o linie sensibilă de mazăre. Acești ADNc sunt, de asemenea, în curs de secvențiere și cartografiere.
În cadrul unui proiect anterior EC-AIR (# CT94-1171) care a implicat parteneri academici și industriali din Danemarca, Franța și Regatul Unit, am explorat, de asemenea, potențialul de a dezvolta PDR la PSbMV în mazărea transgenică. Deoarece, în alte sisteme, gena replicazei virale a fost utilizată în mod obișnuit pentru a oferi PDR prin declanșarea procesului de reducere la tăcere post-transcripțională a genelor (PTGS), am utilizat cistronul replicazei PSbMV (NIb) pentru exprimarea transgenică în mazăre . Din 35 de linii de mazăre, transformate cu Agrobacterium tumefaciens T-ADN purtând o construcție de promotor 35S -Nib – terminator 35S și gena bar ca marker selectabil pentru țesutul transformat în prezența erbicidului Bialophos, trei linii s-au dovedit a fi rezistente la PSbMV. Două dintre aceste linii purtau o repetare directă a capătului 3′ al genei Nib (NIbIb), deoarece existau unele dovezi că aranjamentele complexe de transgene aveau un potențial mai mare de inițiere a PTGS. Toate aceste linii au prezentat un tip de PDR denumit „recuperare”, în care inocularea provocatoare duce la o infecție inițială, dar plantele se refac rapid și nu mai prezintă simptome sau acumulare de virus. Țesuturile recuperate sunt apoi rezistente la o nouă provocare cu izolate virale omologe sau foarte apropiate. Pentru a evalua semnificația acestei situații în câmp, unde plantele pot fi provocate de o populație de virusuri înrudite, a fost evaluată capacitatea diferitelor izolate de PSbMV de a declanșa PTGS și de a fi vizate de PTGS indusă. Aceasta a arătat că virusurile cu o identitate de aproximativ 89% sau mai mare în cistronul NIb ar putea induce rezistența, deși cerințele de specificitate pentru ca un al doilea virus de provocare să fie considerat o țintă ar putea fi mai mari. Pentru referință, cele două izolate PSbMV secvențiate cele mai divergente diferă cu 89% în regiunea Nib. Această distincție în ceea ce privește cerințele de specificitate pentru declanșarea și țintirea în PTGS va fi un aspect important de luat în considerare pentru aplicarea tehnologiei la culturile comerciale. Rezistența relativ largă la izolatele PSbMV din mazărea transgenică Nib contrastează cu specificitatea extremă a patotipului observată pentru genele naturale de rezistență sbm, unde doar una sau câteva modificări ale determinantului de avirulență al virusului sunt suficiente pentru a schimba un izolat PSbMV de la avirulent la virulent.
În ciuda perioadei scurte de infecție inițială, plantele transgenice de mazăre au prezentat o creștere bună și o bună fixare a semințelor după inocularea provocării pentru a da producții în condiții de seră echivalente cu cele observate pentru liniile transgenice sau netransgenice neinfectate. Considerăm că, sub rezerva unor acorduri de licență care să acopere utilizarea genei bar pentru selectarea plantelor transformate, aceste plante ar putea fi adaosuri utile la panoul de gene de rezistență la agenți patogeni care urmează să fie utilizate în dezvoltarea de noi linii îmbunătățite de mazăre.
Plantele transgenice de mazăre reprezintă primele leguminoase care prezintă PDR împotriva potyvirusurilor și unele dintre primele exemple experimentale din Leguminosae de plante care prezintă PTGS. Prin urmare, a fost valoros să se stabilească faptul că principiile care guvernează PTGS și rezistența în acest sistem au fost compatibile cu cele caracterizate cu plante experimentale mai frecvent utilizate (de exemplu, Nicotiana spp.). Așa cum era de așteptat pentru PTGS, rezistența indusă la virus a fost asociată cu degradarea ARN-ului transgenei și a ARN-ului PSbMV . Am arătat, de asemenea, că PTGS a fost mediată în aceste plante de un semnal sistemic generat în timpul fazei inițiale a infecției cu virus și că acest semnal avea potențialul de a media răspândirea PTGS prin inducerea metilării în regiunea transcrisă a transgenei NIb .
În concluzie, am recunoscut că industria agricolă ar beneficia de pe urma unei rezistențe stabile și eficiente la PSbMV la mazăre. Calea cea mai puțin controversată pentru a obține acest lucru ar fi prin încorporarea rezistențelor naturale (fie la transmiterea semințelor, fie la replicarea virusului) folosind strategii convenționale de ameliorare. Înțelegerea noastră relativ slabă a complexității genetice a transmiterii PSbMV prin semințe înseamnă că este puțin probabil ca acest lucru să fie util pe termen scurt. Genele sbm- sunt mai promițătoare, deși lipsa unor markeri genetici strâns legați și natura recesivă a rezistenței creează unele dificultăți. Alternativ, am demonstrat potențialul de creare a rezistenței prin aplicarea tehnologiei transgenice, deși vor trebui abordate aspectele legate de biosecuritate și acceptabilitatea publică. Pe lângă aceste considerații aplicate, cercetarea a generat și generează în continuare materiale și cunoștințe care vor influența modul în care pot fi utilizate abordări similare în cazul altor plante de cultură. În special, va fi importantă înțelegerea mecanismelor de acțiune ale unei noi clase de gene de rezistență la virusuri.
.