Discuție

Studiul de față a identificat o serie de trăsături distincte ale CE și SMC colaterale care pot sta la baza sau contribui la caracteristicile unice ale colateralelor descrise în introducere. Am constatat că, în ciuda stresului de forfecare scăzut și oscilant prezent în colaterale la momentul inițial în absența obstrucției, CE ale acestora sunt aliniate cu axa vasului în același grad prezent în arteriolele cele mai distale și în aorta descendentă – vase cu flux laminar ortograd de mare viteză. Celulele endoteliale atât ale colateralelor, cât și ale arteriolelor au cili primari, iar colateralele posedă mai puțini. Celulele musculare netede ale colateralelor sunt continue, spre deosebire de cele ale DMA-urilor. Colateralele au niveluri mai ridicate de expresie a genelor asociate atât cu căile pro- și antiinflamatorii, cât și cu cele pro- și antiproliferare, comparativ cu DMA-urile. O predispoziție către o rată mai mare de proliferare celulară în celulele murale colaterale este susținută de observația conform căreia colateralele încep să dobândească tortuozitate la scurt timp după formarea lor în embrion, care crește până la vârsta mijlocie (16 luni, 49 de ani-echivalent uman ). Constatările de mai sus oferă o perspectivă asupra specializărilor structurale și moleculare care pot sta la baza caracteristicilor și funcțiilor unice ale vaselor colaterale.

Convergența fluxului sanguin în colaterale la momentul inițial impune forțe scăzute și „deranjate” de flux/stresiune de curgere asupra celulelor lor murale, adică fie absența fluxului, fie un flux foarte scăzut care oscilează încoace și încolo (~1-10 ori pe minut) și are o medie de zero . Acest lucru are ca rezultat o tensiune murală crescută conform relației Bernoulli. Atunci când este prezentă în altă parte în circulația arterială, de exemplu, la bifurcații, în arcul interior al aortei sau în aval de plăci, stresul de forfecare scăzut și perturbat favorizează o morfologie de CE nealiniată și pavată, care este asociată cu un stres oxidativ crescut, inflamație, markeri de îmbătrânire și o activitate scăzută a eNOS/NO (adică disfuncție endotelială) . Cu toate acestea, în mod surprinzător, am constatat că CE colaterale au aceeași aliniere (și dimensiuni celulare) ca și CE din DMA și aorta descendentă. Nu am investigat modul în care este specificat acest fenotip structural antiinflamator. Este posibil ca una sau mai multe dintre celelalte caracteristici unice pe care le-am identificat să fie implicate (a se vedea mai jos). Pe de altă parte, datele din figura 2 pentru fluxul și tensiunea de forfecare au fost obținute la animale anesteziate. În timpul comportamentelor în stare de veghe, colateralele pot avea perioade de flux susținut într-o direcție sau alta, induse de modificări ale activității metabolice regionale în teritoriul alimentat de arborii arteriali pe care aceștia îi interconectează. Nu se știe dacă colateralele contribuie în acest mod la reglarea metabolică fiziologică a fluxului sanguin și a livrării de oxigen, adică la cuplarea neurovasculară în creier și la hiperemia funcțională în alte părți. Cu toate acestea, astfel de perioade de flux unidirecțional susținut ar putea promova orientarea CE pe care am observat-o noi. Indiferent de cauza subiacentă, speculăm că fenotipul aliniat al CE colaterale face parte (sau este un marker) dintr-un grup de mecanisme de protecție care favorizează menținerea colateralelor și atenuează rarefierea acestora (figura 9).

Din câte știm noi, acesta este primul raport care arată că CEs care căptușesc colateralele și arteriolele au cili primari. Aceștia sunt mult mai abundenți decât cei raportați anterior pentru vasele de conductă de la indivizi sănătoși (adică absenți sau prezenți pe mai puțin de 1% din CE ): 18% din CE colaterale au PrC în comparație cu 28% pentru DMA-uri. Cilii primari de pe ECs au fost descriși în 1984 de Haust în aorta iepurilor și oamenilor cu ateroscleroză . Rapoartele ulterioare au descris CE ciliate în capilarele glandei pineale a unui făt uman în vârstă de 20 de săptămâni , în inima în curs de dezvoltare și în pliurile valvelor aortice , și referințele din acestea], în jurul ateroamelor , ectopic în artera carotidă comună a șoarecilor ApoE-/-/- și la indivizi sănătoși la bifurcațiile arterelor de conductă și la curbura interioară a arcului aortic; prin contrast, cili sunt absenți sau aproape absenți în regiunile arterelor în care stresul de forfecare este laminar . Majoritatea celorlalte tipuri de celule exprimă PrC în timpul dezvoltării, în anumite condiții de cultură celulară și la adulți . În funcție de tipul de celule, PrC participă la specificarea asimetriei embrionare, la dispunerea centriolelor, la reglarea proliferării/ciclului celular, la autofagie, la mecanotransducția de detectare a fluxului, la chimiocepție și la compartimentarea și traficul de proteine de semnalizare între cilioplasmă, citoplasmă și nucleoplasmă (de exemplu, pentru Gli și PDGFRα) . Atunci când sunt prezenți, cilii sunt mai abundenți în celulele neproliferante, cu capătul proximal ancorat într-o invaginare a plasmalemei (buzunar ciliar) în CE și în alte tipuri de celule, dar nu în toate tipurile de celule . Cilii primari sunt complexați cu centriolul mamă al corpului bazal care se leagă de centrul de organizare a microtubulilor (MTOC) . Dezasamblarea/resorbția ciliului în timpul fazei S și eliberarea centriolului sunt esențiale pentru diviziunea celulară . Deoarece PrC sunt legate de citoschelet prin intermediul MTOC, flexia ciliului indusă de flux în CE este capabilă să fie transmisă în întreaga celulă, inclusiv la joncțiunile celulă-celulă și celulă-matrice . Cilii primari transpun stresul de forfecare a fluidului în celulele epiteliale tubulare renale și în CE prin intermediul unei căi care este extrem de sensibilă la stresul de forfecare și care implică policistina-1 și policistina-2, care sunt codificate de Pkd1 și Pkd2 . Policistina-1 are proprietăți mecanosensibile, în timp ce policistina-2 este un canal de calciu TRP. Ambele proteine sunt necesare pentru a detecta stresul de forfecare și, la rândul lor, pentru a elibera oxid nitric . Defectele în PrC sunt asociate cu multe anomalii. De exemplu, mutațiile PKD1 și PKD2 sunt cauzale pentru boala polichistică renală autosomal dominantă, iar celulele EC renale și tubulare ale pacienților prezintă răspunsuri deficitare la calciu și NO și o proliferare crescută .

Cilii primari sunt absenți în CE din vena ombilicală umană menținute în condiții de stres de forfecare laminară și de quiescență proliferativă în cultura celulară. În venele ombilicale umane, mai puțin de un procent din CE au cili care ies în lumen, în timp ce într-o fracțiune mai mare, cili sunt localizați intracelular . Aorta embrionară și CE cultivate din aceasta au un singur ciliu care se proiectează în lumen . Cilii endoteliali sunt prezenți în regiunile cu stres de forfecare ridicat în timpul dezvoltării embrionare, împreună cu expresia factorului de transcripție sensibil la stresul de forfecare, KLF2, care tranzactivează eNOS și alte gene antiinflamatorii și antiproliferative . În regiunile cu stres de forfecare scăzut sau perturbat, PrC sunt dezasamblate/absente, iar expresia lui Klf2 și a eNOS sunt abolite și, respectiv, reduse . Expresia lui Klf2 este, de asemenea, inhibată în CE necilitate izolate din arterele embrionare, iar îndepărtarea chimică a PrC din CE în cultură are un efect similar, și anume abolirea expresiei Klf2 . În mod interesant, în CE ale șoarecilor adulți ApoE-/-/, care prezintă disfuncție endotelială, dar nu dezvoltă plăci, cili sunt exprimați ectopic în artera carotidă comună, în ciuda prezenței fluxului laminar, în comparație cu șoarecii de tip sălbatic care sunt lipsiți de cili . Cilia au dispărut atunci când a fost indusă o tensiune de forfecare ridicată prin implantarea unui mulaj de restricție a fluxului în jurul vasului. Turnarea carotidei comune la șoarecii de tip sălbatic a indus ciliogeneza numai în regiunile cu stres de forfecare scăzut și perturbat. Aceste constatări sugerează că expresia PrC pe CE in vivo la adulți este limitată la regiunile cu stres de forfecare scăzut/perturbat, dar poate apărea ectopic în arterele cu flux laminar în prezența disfuncției endoteliale cauzate de hiperlipidemie și, posibil, de alți factori de risc vascular. De remarcat faptul că, în zonele cu flux perturbat, foarte ciliate, cum ar fi curbura interioară a arcului aortic sau în aval de plăci, aproximativ 25% din CE au un singur ciliu, în timp ce restul sunt lipsite de ciliu, un procent similar cu cel observat în arteriole și colaterale.

Constatările noastre că PrC sunt de asemenea prezente pe arteriole și colaterale la șoarecii adulți tineri sănătoși evidențiază necesitatea unor studii care să examineze funcția ciliilor în aceste tipuri de vase. Aceasta include determinarea dacă observația noastră privind mai puțini cili pe CE colaterale decât pe arteriole are semnificație funcțională. Celulele endoteliale sunt cuplate din punct de vedere mecanic, electric și difuzional la CE și SMC adiacente , astfel încât doar o fracțiune din CE ar putea avea nevoie să exprime cili pentru transducția semnalelor mecano-sensibile sau a altor semnale. Stresul de forfecare ridicat cauzează dezasamblarea ciliilor în CE cultivate, în timp ce inversarea oscilatorie a fluxului induce exprimarea acestora . Noi speculăm că cilia de pe arteriolele și CE colaterale pot reflecta fluxul/stresul de forfecare mai mic în arteriole și fluxul foarte scăzut și perturbat în colaterale și că mai puține PrC pe CE colaterale pot servi la reducerea sensibilității lor la mediul predominant de stres de forfecare perturbat. Cu alte cuvinte, mai puțini cili pe CE colaterale pot face parte dintr-un repertoriu de adaptări care echilibrează sau se opun – prin menținerea sau creșterea expresiei KLF2/4, eNOS și a altor factori antiinflamatori/antiproliferativi – semnalelor inflamatorii, oxidative, proliferative și apoptotice de grad scăzut promovate de mediul hemodinamic perturbat prezent în colaterale (figura 9). Egorova et al. au propus ceva similar, și anume că, din moment ce prezența PrC pe CE este asociată cu expresia KLF2, cilia endotelială poate semnala o frână în ceea ce privește activarea CE în regiunile cu flux scăzut și perturbat. Un rol protector pentru cili în aceste regiuni este susținut de raportul recent conform căruia îndepărtarea ciliilor endoteliali prin deleția condiționată a Ift88 a crescut ateroscleroza și expresia genelor inflamatorii și a scăzut activitatea eNOS la șoarecii Apoe-/- hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi , și că endoteliul devine sensibilizat în regiunile predispuse la ateroscleroză pentru a suferi diferențiere osteogenică la șoarecii cu defect de cili Tg737 (orpk/orpk) . De asemenea, este posibil ca, în cazul în care PrC sunt protectoare, un număr mai mic de PrC în colaterale să contribuie la sensibilitatea ridicată a acestor vase la rarefierea cauzată de îmbătrânire și de alți factori de risc vascular. Cu toate acestea, mai puțini cili pe colaterale ar putea reflecta pur și simplu un efect secundar sau secundar, fiind o consecință, de exemplu, a unei rate mai mari de proliferare inerentă a CE colaterale, așa cum reiese din creșterea progresivă a tortuozității colaterale (discutată mai jos), deoarece se crede că prezența PrC și asocierea lor cu corpul bazal favorizează eliminarea celulelor din ciclul celular . Studiile viitoare vor fi necesare pentru a determina dacă descoperirea noastră de cili multipli pe CE reflectă CE care au suferit o senescență proliferativă și asociată cu eșecul citocinezei și poliploidiei nucleare .

S-a demonstrat recent că CE din retina de șoarece în curs de dezvoltare se bazează pe PrC pentru a stabiliza conexiunile vaselor în timpul remodelării plexului vascular în regiunile cu stres de forfecare scăzut până la intermediar . Cilii endoteliali detectează fluxul în embrionii de pește zebră, participă la recrutarea de celule murale la vasele fentate arterial și sunt necesare pentru morfogeneza vasculară normală . Numărul și diametrul colateralelor scade începând cu vârsta mijlocie . Această rarefiere indusă de vârstă este puternic accelerată de deficiența eNOS/NO indusă genetic sau farmacologic sau de prezența unor factori de risc vascular . Tensiunea de forfecare crescută induce remodelarea spre exterior a colateralelor în urma unei obstrucții arteriale acute sau cu evoluție lentă . Șoarecii Pkd1+/- și pacienții cu boală polichistică renală autosomal dominantă prezintă disfuncție endotelială eNOS/NO . Va fi important să se examineze în studiile viitoare dacă PrC colaterale participă la una sau mai multe dintre funcțiile de mai sus, utilizând knockdown-ul specific CE al policistinei-1, deoarece: 1) deficiența acesteia duce la alterarea funcției ciliare, 2) policistina-1 împreună cu policistina-2 participă la detectarea fluxului de către PrC, 3) formele mutante ale oricăreia dintre proteine cauzează boala polichistică de rinichi , 4) există dovezi că VHL, independent de rolul său în degradarea Hif1α, împreună cu GSK3β sunt necesare pentru menținerea structurală a ciliului , și 5) proteina Rabep2, care este necesară pentru colaterogeneză, este un nou substrat al GSK3β, se localizează în complexul ciliu-corp bazal, iar eliminarea acesteia duce la o ciliogeneză defectuoasă . De asemenea, vor trebui examinate și alte abordări pentru a interfera cu prezența și funcția ciliilor, de exemplu, prin eliminarea altor proteine ciliare, cum ar fi Pkd2 și Ift88.

În contrast cu arteriolele distale, care au SMC-uri rare și discontinue în diverse țesuturi, inclusiv în retină (nu am reușit să identificăm studii în creier) , SMC-urile au fost continue pe colaterale. Am speculat că aceasta poate fi o creștere adaptivă a grosimii peretelui pentru a echilibra creșterea stresului circumferențial al peretelui cauzată de conversia specificată de Bernoulli a energiei cinetice a fluxului în energie potențială crescută (presiune transmurală) ca o consecință a convergenței fluxului în colaterale. Ar fi interesant să se examineze dacă compoziția și cantitatea de matrice extracelulară, care ar putea ajuta SMC să echilibreze stresul crescut al peretelui în colaterale, diferă în colaterale față de arteriole. De remarcat că, în ciuda acoperirii lor crescute de SMC, colateralele au mai puțin și nu mai mult tonus în comparație cu arteriolele de dimensiuni similare și nu au capacitate de reacție miogenică – caracteristici unice suplimentare ale vaselor colaterale .

Mediul hemodinamic perturbat, pro-oxidativ în care rezidă celulele murale colaterale ne-a determinat să examinăm dacă expresia genelor implicate în inflamație, proliferare celulară, îmbătrânire și angiogeneză diferă pentru colaterale față de arteriolele distale. Colateralele au prezentat niveluri crescute de ARNm pentru gena inflammasomului pro-inflamator și pro-apoptoză, Pycard, genele pro-proliferative, Ki67, Pdgfb și Angpt2, gena anti-proliferativă, Dll4, și gena markerului CE de tip arterial diferențiat, Ephrinb2. Cu toate acestea, expresia genelor inhibitoare ale ciclului celular, p21, p27 și p53, nu a fost diferită, la fel ca și alte gene asociate cu proliferarea, oprirea ciclului celular și îmbătrânirea (p16Ink4a, Ampk, Sirt1, telomeraza). Nu au existat diferențe nici în ceea ce privește expresia altor gene asociate cu proliferarea CE și/sau SMC (Vegfa, Flk1, Clic4, Pdgfa, Flt1) și care sunt necesare (în cazul primelor trei gene) pentru formarea colateralelor în timpul dezvoltării sau implicate în specificarea diferențierii și quiescenței CE și SMC (Tgfb, Angpt1). Expresia crescută de către colaterale a genelor pro-proliferare de mai sus este în concordanță cu măsurătorile noastre de tortuozitate, care sugerează că celulele murale colaterale au o rată de proliferare mai mare, în comparație cu alte vase arteriale: tortuozitatea colaterală a fost evidentă în prima zi după naștere, a continuat să crească până la vârsta mijlocie, iar apoi a scăzut. Aceasta din urmă a avut loc în același timp în care colateralele cunosc un declin al numărului și diametrului odată cu îmbătrânirea avansată . Aceste constatări susțin ipoteza conform căreia rarefierea colaterală asociată vârstei este cauzată de senescența proliferativă și apoptoza ulterioară a CE și SMC colaterale din cauza creșterii ratei de proliferare de-a lungul vieții, cauzată de mediul hemodinamic perturbat și de conținutul scăzut de oxigen din sânge în care se află colateralele (figura 9).

Colateralele au prezentat, de asemenea, o activitate crescută a eNOS, care, conform studiilor anterioare, se opune rarefierii colateralelor cauzate de îmbătrânire și de alți factori de risc vascular . NO derivat din eNOS inhibă stresul oxidativ, inflamația, proliferarea, adeziunea leucocitelor, agregarea plachetară și îmbătrânirea celulară și promovează relaxarea SMC . Deoarece stresul de forfecare este un stimulent apropiat pentru NO derivat din eNOS, creșterea eNOS/NO în colaterale, cu mediul lor de stres de forfecare scăzut și perturbat, poate diminua efectul factorilor care promovează rarefierea colaterală (figura 9). De asemenea, expresia menținută a factorilor de transcripție sensibili la stresul de forfecare al CE, Klf2 și Klf4, în colaterale, în ciuda fluxului lor scăzut și oscilant, care inhibă expresia acestor factori în altă parte în vasculatura arterială cu flux perturbat , poate acționa ca factori suplimentari de „echilibrare” sau specializări colaterale, împreună cu eNOS crescut, CE aliniate, mai puțini cili, acoperire robustă a SMC și creșterea ephrin-B2 și Dll4. Expresia KLF2 și KLF4, care reglează negativ proliferarea, inflamația și angiogeneza, stimulează eNOS și sunt brusc reduse la locurile de stres de forfecare scăzută și perturbată, nu au fost diferite în colaterale față de DMA. În mod interesant, PrC promovează expresia Klf2, Klf4 și eNOS .

O limitare a studiilor de mai sus este că ARN-ul a fost obținut din vasele disecate, care sunt compuse din ECs, SMCs și, deși mai puțin, pericite, fibroblaste și celule mieloide rezidente. Sunt necesare studii care să utilizeze separarea tipurilor de celule și examinarea unei game mai largi de gene și a nivelurilor lor proteice respective. Cu toate acestea, dificultatea de a diseca manual colateralele și arteriolele distale în numărul necesar, efectul tehnicilor de disociere celulară asupra nivelurilor de bază ale ARN și proteinelor, absența unor modele de culturi celulare de CE și SMC „colaterale” și lipsa deocamdată a unei gene marker specifice colateralei, împiedică utilizarea acestor abordări. Cu toate acestea, trebuie remarcat faptul că expresia mai multor gene examinate este specifică sau îmbogățită pentru CE, de exemplu, Flk1, Angpt1, Angpt2, Ephrinb2, DLL4, eNOS, Clic4, Klf2 și Klf4. Cu toate acestea, analiza transcripției genice nu reflectă întotdeauna modificările la nivelul proteinelor sau a funcției; astfel, investigarea markerilor de stres oxidativ, inflamatori, de proliferare sau de senescență la nivel proteic poate reflecta mai bine diferențele în caracteristicile celulare.

.