Cultura celulară, amplificarea și purificarea virusului pentru experimentele SHAPE-MaP și SPLASH

Celulele Madin-Darby Bovine Kidney (MDBK) și Madin-Darby canine kidney (MDCK) au fost cultivate în Minimum Essential Medium (Merck), suplimentat cu 2 mM l-glutamină și 10% FCS. Stocurile de virus WSN (H1N1) au fost produse prin infectarea celulelor MDBK cu virusul gripal la o multiplicitate de infecție (MOI) de 0,01. Stocurile virale ale virusurilor Udorn (H3N2) și PR8 (H1N1) (PR8) au fost produse prin infectarea celulelor MDCK la o MOI de 0,001 în prezența a 0,8 μg ml-1 de tripsină tratată cu n-Tosil-l-fenilalanină clorometilcetonă (TPCK) (Merck). Virușii au fost colectați 2 zile după infectare. Virușii au fost purificați prin ultracentrifugare: mai întâi, mediul de cultură celulară infectat a fost clarificat prin centrifugare la 4 000 r.p.m. timp de 10 minute la 4 °C, urmată de centrifugare la 10 000 r.p.m. timp de 15 minute la 4 °C. Virusul a fost apoi purificat prin centrifugare pe o pernă de zaharoză de 30 % la 25 000 r.p.m. timp de 90 de minute la 4 °C într-un rotor SW 32 (Beckman Coulter). Pelerina de virus purificată a fost resuspendată într-un tampon de resuspensie (0,01 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,1 M NaCl, 0,0001 M EDTA). Menționăm că nici structurile terțiare ale virionului, nici cele ale ARN-ului nu sunt perturbate prin ultracentrifugare30,31,32.

SHAPE-MaP

SHAPE-MaP a fost realizat conform procotolurilor publicate17; anhidrida 1-metil-7-nitroizatoică (1M7) a fost sintetizată din anhidrida 4-nitroizatoică așa cum a fost descrisă anterior33. Pentru experimentele cu ARN transcris in vitro, fiecare segment de ARN viral a fost sintetizat dintr-un șablon de ADN liniar cu ajutorul kitului HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit (New England Biolabs). Produsele au fost verificate în ceea ce privește dimensiunea și puritatea pe un gel de electroforeză pe gel de poliacrilamidă de 3,5 % (PAGE)-urea. Probele de ARN viral gol au fost pregătite prin purificarea particulelor WSN pe perna de zaharoză, așa cum s-a descris anterior. Virusurile purificate au fost tratate cu 250 μg ml-1 de proteinază K (Roche) în tampon de proteinază K (10 mM Tris-HCl, pH 7,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% SDS) timp de 40 min la 37 °C. Înainte de modificare, probele de ARN transcris in vitro și de ARN viral gol au fost pliate la 37 °C timp de 30 de minute în tampon de pliere (100 mM HEPES-NaOH, pH 8,0, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2). 1M7 (dizolvat în dimetilsulfoxid anhidru (DMSO; Merck)) a fost adăugat la o concentrație finală de 10 mM la ARN pliabil și probele au fost incubate timp de 75 s la 37 °C. Modificările in virio au fost efectuate prin adăugarea de 1M7 direct la virusul purificat. Capacitatea reactivilor SHAPE-MaP de a pătrunde în particulele virale a fost testată inițial, așa cum s-a descris anterior34 , prin efectuarea de extensii de amorsă marcate cu 32P pe ARN extras din virusul tratat cu reactiv SHAPE-MaP, utilizând o amorsă de țintire a segmentului NA (5′-AATTGGTTCTCCAAAGGAGACG-3′). În paralel cu probele tratate cu 1M7, probele de control au fost tratate cu DMSO. reactivul SHAPE-MaP de anhidridă n-metilisatoică (NMIA; Thermo Fisher Scientific) a fost, de asemenea, testat în virio. Experimentele cu NMIA au fost efectuate așa cum a fost descris pentru 1M7, cu excepția virionilor purificați care au fost tratați cu NMIA timp de 45 min.

Prepararea bibliotecilor de secvențiere a fost efectuată așa cum a fost descrisă anterior17 , în conformitate cu fluxul de lucru randomer. Pe scurt, după tratamentul cu 1M7 sau de control, ARN-ul a fost purificat cu ajutorul kitului RNA Clean & Concentrator-5 (Zymo Research). ARN-ul a fost transcris invers cu ajutorul Random Primer Mix (New England Biolabs) cu SuperScript II (Invitrogen) în tampon MaP (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 75 mM KCl, 6 mM MnCl2, 10 mM ditiotreitol și 0,5 mM deoxinucleozid trifosfat). Kitul Nextera XT DNA Library Prep (Illumina) a fost utilizat pentru a pregăti bibliotecile de ADN. Produsele finale de amplificare PCR au fost selectate în funcție de dimensiune cu ajutorul Agencourt AMPure XP Beads (Beckman Coulter) și au fost evaluate calitativ cu ajutorul kitului Agilent DNA 1000 (Agilent Technologies) pe un sistem Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies). Pentru WSN, ARN viral gol și ARN transcris in vitro, bibliotecile au fost secvențiate (2 × 150 perechi de baze (bp)) pe un sistem HiSeq 4000 (Illumina); pentru virusurile PR8 și Udorn, bibliotecile au fost secvențiate (1 × 150 bp) pe un sistem NextSeq 500 (Illumina).

SPLASH

Eșantioanele SPLASH au fost pregătite așa cum au fost publicate anterior24,35, cu unele modificări, pentru câte două replici pentru fiecare dintre virusurile WSN, PR8 și Udorn și o singură replică pentru fiecare dintre virusurile H3N2 reasortate. Virusul purificat a fost incubat cu 200 μM de EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin (Thermo Fisher Scientific) și 0,01% digitonină (Merck) timp de 5 minute la 37 °C. Virusul a fost împrăștiat pe o farfurie cu 6 godeuri, acoperit cu o placă de sticlă, așezat la gheață și iradiat timp de 45 de minute cu ajutorul unei lămpi UVP Ultra Violet Product Handheld UV Lamp (Thermo Fisher Scientific). Virusul reticulat a fost tratat cu proteinază K și ARN viral a fost extras cu TRIzol (Invitrogen). O parte aliquotă de ARN viral extras a fost utilizată pentru a detecta încorporarea biotinei cu ajutorul unui kit Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module Kit (Thermo Fisher Scientific) pe o membrană de nailon Hybond-N (GE Healthcare Life Sciences). Restul ARN-ului viral extras a fost fragmentat cu ajutorul modulului de fragmentare a ARN-ului NEBNext Magnesium (New England Biolabs) și selecționat pentru fragmente mai scurte de 200 nt cu ajutorul kitului RNA Clean & Concentrator-5. Probele au fost îmbogățite pentru ARN viral biotinilat utilizând margele Dynabeads MyOne Streptavidin C1 (Thermo Fisher Scientific); ligarea de proximitate pe margele și inversarea legăturii încrucișate cu psoralen au fost efectuate conform celor publicate anterior24,35. Bibliotecile de secvențiere au fost pregătite cu ajutorul kitului comercial SMARTer smRNA-Seq Kit (Clontech Laboratories). Selecția finală a dimensiunii a fost realizată prin rularea bibliotecilor de secvențiere amplificate prin PCR pe un gel PAGE 6% (Thermo Fisher Scientific) în Tris/acid boric/EDTA (TBE), selectând ADN de 200-300 bp. Bibliotecile au fost secvențiate 1 × 150 bp pe un sistem NextSeq 500.

Procesarea citirilor de secvențiere SHAPE-MaP

Lecturile de secvențiere au fost tăiate pentru a elimina adaptorii folosind Skewer v0.2.2 (ref. 36). Profilele de reactivitate SHAPE-MaP au fost generate cu ajutorul pipeline-ului publicat ShapeMapper237, care aliniază citirile la genomul de referință și calculează ratele de mutație la fiecare poziție nucleotidică. Ratele de mutație sunt apoi convertite în valorile reactivității SHAPE-MaP definite astfel:

unde mutr1M7 este rata de mutație a nucleotidelor în proba tratată cu 1M7 și mutrDMSO este rata de mutație în proba tratată cu DMSO. Toate reactivitățile SHAPE-MaP au fost normalizate la o scală aproximativă de 0-2 prin împărțirea valorilor reactivității SHAPE-MaP la reactivitatea medie a celor 10% nucleotide cele mai reactive după excluderea valorilor aberante (definite ca nucleotide cu valori ale reactivității care sunt >1,5 intervalul interquartil). Reactivitățile SHAPE-MaP ridicate indică regiuni mai flexibile (adică monocatenare) de ARN, iar reactivitățile SHAPE-MaP scăzute indică regiuni de ARN mai constrânse din punct de vedere structural (adică perechi de baze).

Procesarea citirilor de secvențiere SPLASH

Lecturile de secvențiere au fost tăiate pentru a elimina adaptorii folosind Skewer v0.2.2 (ref. 36). STAR v.2.5.3 (ref. 38) a fost utilizat pentru a alinia citirile la genomul de referință al virusului corespunzător (tabelul suplimentar 2). Numai citirile chimerice în care cel puțin 20 nt s-au aliniat la segmentele de referință au fost utilizate în procesarea ulterioară (parametrul STAR: -chimSegmentMin 20). Lecturile chimerice au fost deduplicate utilizând șirurile CIGAR și pozițiile de aliniere. Șirurile CIGAR din fiecare aliniere de citire au fost procesate pentru a găsi coordonatele de început și de sfârșit de citire. Coordonatele citirilor chimerice au fost utilizate pentru a produce o matrice de interacțiuni de secvențe în software-ul R. Loci discreți din matrice au fost selectați și ajustați individual cu o curbă gaussiană bazată pe intensitatea de suprapunere a citirilor pentru a defini o fereastră de interacțiune; ferestrele de interacțiune ale lociilor cu suprapunere complexă au fost separate în ferestre individuale. Lățimea ferestrei de interacțiune a fost utilizată pentru a determina coordonatele de început și de sfârșit ale fiecărei interacțiuni; numărul de citiri care se aflau în interiorul (sau parțial în interiorul) acestei regiuni a fost utilizat ca o măsură a frecvenței interacțiunii. Pentru generarea de figuri, primele 20 de interacțiuni din fiecare virus au fost vizualizate cu ajutorul pachetului circlize v.0.4.5 (ref. 39) în R v.3.5.1. Setul complet de loci de interacțiune este furnizat în tabelul suplimentar 2. Pentru validarea qPCR a lociilor de interacțiune, probele încrucișate cu psoralen au fost pregătite și îmbogățite așa cum s-a descris anterior, dar cu un timp de fragmentare mai scurt (3 față de 4 min) pentru a genera fragmente de ARN mai lungi. ARN-ul a fost poliadenilat cu Poly(A) Polymerase (Takara Bio), iar ADN-ul complementar a fost generat cu ajutorul SmRNA dT Primer (Takara Bio) și PrimeScript Reverse Transcriptase (Takara Bio) în conformitate cu instrucțiunile producătorului. S-a efectuat o qPCR de 50 de cicluri în conformitate cu instrucțiunile producătorului pe un instrument StepOnePlus (Applied Biosystems) folosind Brilliant II SYBR Green QPCR Master Mix with ROX (Agilent Technologies) și perechi de primer pentru a testa interacțiunile între segmente. Secvențele primerilor sunt prezentate în tabelul suplimentar 3. După 50 de cicluri de amplificare qPCR, produsele au fost rezolvate prin 8% PAGE (29:1 acrilamidă/bis-acrilamidă, tampon TBE 1×) și vizualizate cu transiluminare cu lumină albastră.

Prediciuni ale structurii ARN

Argitmul IntaRNA v.2.3.1 (ref. 40) a fost utilizat pentru a prezice capacitatea interacțiunilor ARN-ARN de a apărea în regiunile identificate în timpul analizei SPLASH, utilizând opțiunile Exact mode (-mode E) și no seed constraint (-noSeed). Reactivitățile SHAPE-MaP au fost incluse în modelarea interacțiunilor ARN-ARN (-tShape și -qShape). Seturile de date permutate au fost generate prin amestecarea aleatorie a partenerilor de interacțiune specifici identificați de SPLASH și prin evaluarea energiilor ΔG de interacțiune cu ajutorul IntaRNA. Semnificația diferenței dintre distribuțiile de probabilitate ale energiilor ΔG asociate cu interacțiunile ARN intermoleculare identificate de SPLASH față de seturile de date permutate a fost calculată cu ajutorul testului Wilcoxon rank-sum din software-ul R. Predicțiile structurii IntaRNA au fost apoi utilizate pentru a ajusta regiunile de interacțiune la nucleotidele implicate în împerecherea de baze. În cazul în care datele SHAPE-MaP nu au fost disponibile (PR8 reassortanți cu virusuri H3N2), preplierea fiecărui șir de ARN („accesibilitate”) a fost dezactivată în IntaRNA (-qAcc = N -tAcc = N). Pentru validarea în raport cu structurile cunoscute, datele privind structura secundară a ARN au fost extrase din baza de date RNA3Dhub41 , pe baza structurilor de microscopie electronică criogenică ale ribozomului 80S42 (PDB: 6EK0) și ale complexului spliceosomal al triplei mici ribonucleoproteine nucleare U4/U6.U543 (EMDB: EMD-2966). Secvențele ARN de referință au fost corectate pentru a se potrivi cu secvențele bovine (MDBK) pentru ARN ribozomal și ARN nuclear mic U4/U6, așa cum a fost descris anterior44. Pentru predicțiile structurii intramoleculare a ARN-ului, a fost utilizat pachetul ViennaRNA v.2.0 (ref. 45). Comanda RNAfold a fost utilizată pentru a prezice structurile secundare de ARN și funcțiile de partiție pentru fiecare segment. Reactivitățile SHAPE-MaP au fost incluse ca restricții pseudoenergetice. S-a utilizat o analiză de corelație cu fereastră mediană glisantă de 50 nt între profilurile de reactivitate SHAPE-MaP ex virio și in virio pentru a determina gradul de corelație SHAPE-MaP între ARN transcris T7 și ARN asociat cu vRNP. Am constatat că nu a existat nicio corelație >150 nt; prin urmare, am stabilit constrângerea maximă a distanței de împerechere pentru predicțiile privind structura și funcția de partiție la 150 nt. Pentru predicțiile structurii intramoleculare, am stabilit ca nucleotidele din cadrul regiunii promotoare să fie monocatenare.

Cultura de celule pentru ingineria inversă a virusurilor gripale

Celele MDCK și celulele de rinichi embrionar uman (HEK 293T) au fost obținute dintr-o colecție existentă în cadrul Departamentului de Microbiologie și Imunologie, Universitatea din Melbourne. Celulele MDCK au fost cultivate în mediul Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Sigma-Aldrich), iar celulele HEK 293T au fost cultivate în DMEM (Thermo Fisher Scientific). Ambele medii au fost suplimentate cu 10% FCS inactivat termic, 2 mM l-glutamină, 2 mM piruvat de sodiu, 24 μg ml-1 de gentamicină, 50 μg ml-1 de streptomicină și 50 UI ml-1 de penicilină. Coculturile de celule MDCK și de celule HEK 293T pentru transfecție au fost stabilite în Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific) cu 50 μg ml-1 de streptomicină și 50 UI ml-1 de penicilină.

Construcția virusurilor gripale cu inginerie inversă

Segmente genetice individuale din virusurile PR8, Udorn, Mem71 (H3N2), PC73 (H3N2) și Wyo03 (H3N2) au fost transcrise invers și clonate în plasmide pHW200046. Virusurile obținute prin genetică inversă conțineau fie o genă PR8, Udorn, Mem71, PC73 sau Wyo03 PB1, fie o genă NA de tip sălbatic sau modificată, într-un fond genetic care cuprinde șase segmente din virusul PR8 (PB2, PA, HA, NP, M și NS). Gena NA modificată (Wyo03UdSub) a fost derivată din Wyo03 și a purtat 4 substituții față de secvența Udorn-NA: nucleotidele G943A; C938U; U933C; și G923A. Trei dintre aceste patru modificări de nucleotide au fost silențioase, iar cea de-a patra (A534G) a dus la o modificare conservatoare de la lizină la arginină (K172R). Fragmentele complementare care încorporează aceste modificări au fost generate prin PCR și au fost unite printr-o altă rundă de PCR folosind primeri specifici segmentului care conțin situsuri de restricție BsmBI47 ; produsul a fost clonat în vectorul de expresie pHW2000 pentru salvarea virusului. Secvențele primerilor sunt prezentate în tabelul suplimentar 3. Virusurile salvate au fost amplificate în ouă de găină embrionate de 10 zile. Lichidul alantoidian infecțios a fost titrat pentru conținutul de virus prin formarea de plăci în celule MDCK48 și a fost depozitat la -80 °C.

Determinarea cineticii de replicare virală a virusurilor obținute prin inginerie inversă

Caracteristicile de replicare ale virusurilor obținute prin inginerie inversă au fost determinate prin infectarea celulelor MDCK la un MOI de 0,01. După 1 h de absorbție (la t = 0 h), inoculul a fost îndepărtat, iar celulele au fost spălate și incubate la 37 °C, 5% CO2 în RPMI 1640 suplimentat cu 2 mM l-glutamină, 2 mM piruvat de sodiu, 24 μg ml-1 de gentamicină, 50 μg ml-1 de streptomicină, 50 UI ml-1 de penicilină și 1 μg ml-1 de tripsină tratată cu TPCK (Worthington Biochemical Corporation). Supernatantele de cultură celulară au fost colectate la diferite momente de timp după infectare și au fost păstrate la -80 °C pentru analiză. Titlurile virale au fost determinate prin formarea de plăci pe monostraturi confluente de celule MDCK.

Inginerie inversă competitivă cu nouă plasmide a virusurilor gripale

Inginerie inversă competitivă a virusurilor gripale a fost realizată folosind o versiune modificată a sistemului de genetică inversă cu opt plasmide26 , așa cum a fost descrisă anterior25. Pe scurt, plasmidele care codifică segmentele de ARN viral PB2, PB1, PA, hemaglutinina (HA), nucleoproteina (NP), proteina matricei (M) și proteina nestructurală (NS) din PR8 au fost co-transfectate cu plasmide care codifică ARN viral de neuraminidază (NA) și ARN viral PB1 concurent, fie din Udorn, Mem71, PC73, fie din Wyo03 de tip sălbatic sau modificat. Fiecare plasmidă (1 µg) a fost amestecată cu reactivul de transfecție FuGENE 6 (Promega) în Opti-MEM și adăugată la o cocultură de celule HEK 293T și MDCK. La șase ore după transfecție, mediul a fost înlocuit cu Opti-MEM suplimentat cu 50 μg ml-1 de streptomicină și 50 UI ml-1 de penicilină. Douăzeci și patru de ore mai târziu, s-a adăugat tripsină tratată cu TPCK (1 μg ml-1), iar supernatantul a fost colectat după alte 42 de ore și depozitat la -80 °C. Pentru a determina frecvențele de încorporare a genelor PB1 concurente, virusurile progenituri din supernatantul de transfecție au fost supuse unui test de placă în celule MDCK. Plăcile alese aleatoriu (aproximativ 36 pe experiment) au fost prelevate prin eșantionare prin agaroză și resuspendate în 0,05% Triton-X100. Sursa segmentelor de gene concurente a fost identificată prin RT-PCR cantitativă specifică pentru fiecare genă în parte cu ajutorul kitului RT-PCR SensiFast probe no-ROX one-step (Bioline). Fiecare reacție de 20 μl a fost realizată folosind 5 μl de suspensie virală culeasă în plăci, 10 μl de 2× SensiFast SYBR No-ROX One-Step mix 2× SensiFast SYBR No-ROX, 0,2 μl de transcriptază inversă, 0,4 μl de inhibitor de RNază Ribosafe, 0,8 μl de fiecare amorsă directă și inversă specifică unei gene de 10 μM și 0,08 μl de fiecare sondă specifică unei gene de 25 μM. Secvențele primerului și ale sondei sunt prezentate în tabelul suplimentar 3. Reacția RT-PCR a fost incubată timp de 10 minute la 45 °C, înainte de a se trece la amplificarea qPCR, în conformitate cu instrucțiunile producătorului. Valorile raportate sunt date combinate din 3-8 experimente independente de transfecție pentru fiecare competiție.

Rezumat de raportare

Informații suplimentare privind designul cercetării sunt disponibile în Rezumatul de raportare al Nature Research legat de acest articol.

.