Abstract
În lucrarea de față se prezintă o descriere detaliată a ultrastructurii celulelor secretorii ale insulelor pancreatice ale peștelui pisică sud-american Rhamdia quelen Rhamdia quelen. Sunt oferite dovezi în sprijinul afirmației că granulele α constau dintr-o porțiune centrală și una exterioară cu densități și solubilități electronice diferite, că celulele δ sunt cel mai probabil celule α modificate morfologic, dar viabile, și că granulele β posedă, probabil, o substructură repetitivă și, prin urmare, pot reprezenta o formă intracelulară de stocare cristalină a insulinei.
1. Introducere
Insulelele de Langerhans au fost descoperite la iepure de către Langerhans în 1869. Cu toate acestea, au fost raportate de Stannius și Blockmann la teleoameni cu aproximativ 20 de ani mai devreme și, prin urmare, sunt, de asemenea, deși mai puțin frecvent, denumite corpii lui Stannius sau Blockmann. Insuleții de Langerhans sunt de origine endodermică și la majoritatea teleostelor se găsesc sub formă de corpuri mici împrăștiate în porțiunea exocrină a pancreasului.
Peștele nu are un pancreas discret. Țesutul pancreatic exocrin poate fi găsit împrăștiat de-a lungul tractului intestinal. Structura acinară a pancreasului exocrin este foarte asemănătoare cu cea a mamiferelor și cuprinde celule cu o citoplasmă foarte întunecată, bazofilă . La peștii care se hrănesc în mod activ, acestea conțin un număr mare de granule secretorii strălucitoare, eozinofilice. S-a putut distinge insulița pancreatică endocrină de Langerhans, iar țesutul cuprinde celule α (care produc peptide asemănătoare glucagonului), celule β (care produc insulină) și celule d (care produc somatostatină) . La mamifere și la om, cele mai multe dintre descrierile microscopice electronice anterioare ale insulelor pancreatice umane adulte au fost scurte, iar porțiuni minore din publicații sunt dedicate în principal descrierilor tumorilor celulelor β sau articolelor de studiu care discută morfologia comparativă a insulelor din mai multe specii .
Pancreasul peștilor nu se dovedește adesea a fi o sursă facilă de țesut pentru studiul microscopic electronic. Pancreasul principal al peștilor este asemănător atât din punct de vedere anatomic, cât și din punct de vedere al dezvoltării cu pancreasul mamiferelor, în timp ce la alte specii de pești sunt evidente diferențe majore. La peștele zebră adult, pancreasul principal conține mai multe insulițe principale înconjurate de țesut exocrin. O coadă de insulițe unice înglobate în țesut exocrin și grăsime se întinde în direcția caudală de-a lungul intestinului. În schimb, celulele β de la tilapia (un alt pește teleostean sensibil la glucoză) se află în insulele Langerhans situate de-a lungul mezenterului, care nu sunt înconjurate de țesut exocrin . Rhamdia quelen este o specie de teleoste și este o specie importantă pentru acvacultură în climatele subtropicale. R. quelen se găsesc din sudul Mexicului până în centrul Argentinei, iar creșterea acestei specii se răspândește spre sudul Braziliei .
În studiul de față analizăm ultrastructura insulelor de Langerhans și descriem în detaliu diferitele tipuri de celule secretorii la somnul sud-american R. quelen.
2. Materiale și metode
Patru R. quelem de crescătorie două femele și doi masculi ( g; cm) de la Centro Nacional de Desarrollo Acuícola (CENADAC) din regiunea de nord-est a Argentinei și populate în bazine de 200 L unde au fost aclimatizate timp de două săptămâni înainte de necropsie. Peștii au fost crescuți cu apă dulce filtrată, menținută la 25°C, cu o rată de schimbare a apei de 100% pe zi. Fotoperioada a fost ajustată la 12 ore de întuneric și 12 ore de lumină. Ei au fost hrăniți manual de patru ori pe zi cu o dietă comercială (Ganave). Peștii au fost eutanasiați cu benzocaină (500 ppm) și necropsiați, iar probele de grăsime care se extind caudal de-a lungul intestinului au fost fixate în formol tamponat 10%, încorporate în parafină și colorate cu hematoxilină și eozină (H&E).
Fragmente mici de țesut au fost tăiate în blocuri de 1 mm și fixate imediat în glutaraldehidă tamponată cu fosfat (pH 6.9 la 4°C), spălate în soluție Millonig și postfixate în tetroxid de osmiu 1%; blocurile de țesut au fost apoi deshidratate într-o serie gradată de etanol-acetonă, imersate în oxid de propilenă și încorporate în Durcupan ACNI (Fluka Chemie A.G., Elveția). Secțiuni subțiri au fost tăiate cu un ultramicrotom LKB și dublu colorate cu acetat de uranil și citrat de plumb înainte de a fi examinate la un microscop electronic Jeol JEM-8T (Jeol, Tokyo, Japonia).
3. Rezultate
3.1. Microscopia luminoasă
R. quelen au pancreasul împrăștiat în țesutul adipos care înconjoară canalul biliar comun; acesta se află într-o regiune aproximativ triunghiulară delimitată superior de stomac, anterior de ficat și inferior de splină și vezica biliară. Fiecare insuliță de Langerhans este compusă din țesut de insuliță relativ pur, înconjurat de pancreas exocrin (figura 1). Nu au fost observate diferențe între masculi și femele.
3.2. Microscopie electronică
Celulele β, care ocupă de obicei interiorul insulelor, au fost frecvent, dar nu întotdeauna, separate de pancreasul exocrin de către celulele α situate periferic (figura 2). Aspectul ultrastructural al celulelor β a fost identic în probele obținute de la cei patru pești. Granulele β distincte erau conținute în saci cu membrană netedă și aveau dimensiuni și forme variabile. Au fost vizibile cristale dreptunghiulare, pătrate, hexagonale și neregulat poligonale. Au fost prezente forme rotunde, dar mai rar (figurile 2-5). Fiecare granulă era alcătuită din una sau mai multe forme cristaline sau nestructurate de dimensiuni și forme variabile. Alegerea fixatorului nu a părut să influențeze structura internă a granulelor β. În limitele membranei învelitoare, zona periferică a cristalelor părea goală sau conținea un precipitat fin floculent, indiferent de fixatorul utilizat. La măriri mai mari, o substructură repetitivă era uneori vizibilă în acele cristale orientate corect în raport cu planul de secțiune (figurile 6 și 7). Numeroasele mitocondrii au fost dispersate în întreaga celulă și au apărut sub formă de structuri filamentoase rotunjite sau pline. Acestea erau mai mari și mai numeroase decât cele din celulele β, dar de obicei mai mici decât cele din celulele acinare pancreatice. Numeroasele criste mitocondriale erau, în cea mai mare parte, orientate transversal, iar granulele mitocondriale erau prezente, dar nu proeminente. Cisternele reticulului endoplasmatic granular erau de obicei scurte sau veziculare (figurile 2-4). Reticulul endoplasmatic granular și ribozomii liberi nu erau o caracteristică atât de proeminentă a celulelor β ca în cazul celulelor acinare sau β. Acele celule β cu puțini granule secretorii în mod normal erau mai bogat înzestrate cu ribozomi și cu reticulul endoplasmatic granular, care avea atunci o configurație mai frecvent cisternală (figura 5).
Complexul Golgi a fost mai proeminent după fixarea cu aldehidă, iar structurile componente au fost mai dilatate (figura 2). După utilizarea acestor fixatori, materialul amorf dens a fost ocazional vizibil în interiorul veziculelor Golgi și poate reprezenta granule imature sau precursori ai granulelor β-secretoare. Nucleii celulelor β erau de obicei sferici și cu contur relativ neted. Membrana celulară a celulelor de insuliță adiacente era în strânsă apoziție cu desmosomii, deși nu era frecvent unită de aceștia. La joncțiunea a trei sau mai multe celule, membranele limitatoare erau adesea convolute, cu interdigitații tortuoase ale celulelor (figurile 2 și 9). Incluziunile citoplasmatice multivesiculare asemănătoare cu ceroidul erau vizibile în majoritatea celulelor β (figurile 2, 7, 9 și 8). Apariția ș i frecvența acestor incluziuni nu au fost afectate în mod semnificativ de utilizarea primară a acidului osmic sau a aldehidei ca fixator ș i nu a existat nici o relație aparentă între prezența acestor granule ș i dovezile morfologice de activitate fiziologică a celulelor. Ultrastructura celulelor α a fost aceeași în toate cele patru probe de țesut. Dimensiunea și forma acestor celule și a nucleelor lor nu au fost semnificativ diferite de cele ale celulelor β normale (figurile 2 și 7). Deși ocazional se găsea o celulă α cu un nucleu de formă neregulată sau cu un nucleu crestat, acest lucru nu a apărut cu o frecvență suficientă pentru a servi ca un criteriu de diferențiere util. Granulele citoplasmatice ale celulei α au fost conservate prin fixare primară cu osmiu sub forma unor corpuri dense, sferice, de dimensiuni variabile, și erau conținute în saci cu membrană netedă, care se potrivesc ușor (figurile 7 și 9). Aceștia erau mai mari decât granulele β, dar considerabil mai mici decât granulele de zimogen din celulele acinare (figura 2). Mitocondriile subțiri și alungite erau moderate ca număr și mai mici decât cele ale celulelor β și aveau criste care erau de obicei orientate transversal. Reticulul endoplasmatic granular avea adesea o configurație cisternală și era mai abundent decât în celulele β (figura 9). Complexul Golgi, atunci când era vizibil, era de proporții moderate. Materialele amorfe dense din veziculele și cisternele Golgi, probabil precursorii granulelor secretorii, erau mai frecvente în celulele α decât în celulele β (figura 10). Corpurile ceroide, deși frecvent vizibile, au fost mai puțin numeroase decât în celulele β (figurile 2 și 3). Prin urmare, sacii în care sunt situați granulele α păreau a fi complet plini și s-a concluzionat că granulele constau dintr-un miez dens interior rotunjit și o manta exterioară mai puțin densă din punct de vedere electronic, care era absentă după fixarea cu osmiu (figurile 3 și 9) și, prin urmare, probabil, mai solubilă. Nu a fost vizibilă nicio substructură consistentă în cadrul porțiunilor interioare sau periferice ale granulelor α. În niciun moment nu au fost observate celule care ar putea fi interpretate ca forme de tranziție între celulele α și celulele β. Granulele α, incluzând atât porțiunile exterioare, cât și cele interioare mai dense, erau comparabile ca dimensiune totală cu „granulele δ”. Mai mult, sunt prezente celule intermediare care conțineau granule de ambele tipuri, sugerând că celulele δ erau, de fapt, celule α modificate (figura 10). Celulele δ au fost vizualizate, deși aproape întotdeauna situate printre celulele α, și au fost identificate și distinse ultrastructural de celulele α pe baza densității electronice mai mici și a dimensiunii totale mai mari a granulelor lor secretorii. Mai mult, sunt prezente celule intermediare care conțineau granule de ambele tipuri, sugerând că celulele δ erau de fapt celule α modificate (figura 11).
Deși a existat o relație inversă între numărul de granule secretorii și proeminența complexului Golgi și a reticulului endoplasmatic granular, nu s-a observat un model de eliberare a granulelor α sau β. O membrană bazală subțire și cantități variabile de țesut conjunctiv separau de obicei insulele pancreatice de celulele acinare adiacente (figura 2). Ocazional, însă, nicio membrană bazală nu a intervenit între insuliță și celulele acinare, care au fost atunci separate doar de un spațiu interstițial îngust. Celulele endoteliale capilare fenestrate au fost întotdeauna separate de acestea cel puțin de membrana bazală capilară (figura 9). Alte elemente de susținere, inclusiv componentele colagenului și ale țesutului elastic, erau, de asemenea, uneori prezente. Nu au fost observate diferențe între masculi și femele.
4. Discuții
Celulele β din pește se disting ușor de celulele α prin morfologia granulelor secretorii. Prezența frecventă a subunităților unghiulare și substructura aparent repetitivă sugerează o natură cristalină pentru granulele β. Încercările de a rezolva și de a măsura dimensiunile unei rețele cristaline nu au avut încă succes. Atunci când granulele secretorii au fost vizualizate în vecinătatea complexului Golgi, subunitățile cristaline nu au fost de obicei observate. Prin urmare, este tentant să se speculeze că granulele necristaline sau materialul amorf din cadrul complexului Golgi reprezintă o formă chimică sau fizică diferită a insulinei sau a complexului proteic al insulinei decât subunitățile cristaline ale granulelor. Nu se știe dacă aceste forme morfologice diferite din cadrul granulelor β au solubilități diferite și, probabil, modele diferite de eliberare ca răspuns la cererea fiziologică. Granulele secretorii nu au fost observate în cisternele sau veziculele din reticulul endoplasmatic granular. Se presupune că, la fel ca în cazul altor celule secretoare de proteine, complexul Golgi are rolul de a concentra sau „împacheta” produsul sintetizat în reticulul endoplasmatic granular. Ar rezulta în mod logic că sacii cu membrană netedă în care sunt conținuți granulele secretorii sunt derivați din membranele Golgi mai degrabă decât din reticulul endoplasmatic granular.
Celele α cu granulele lor secretorii mari, rotunjite și dense sunt destul de asemănătoare cu celulele α din alte specii. Deși granulele celulelor α variază foarte mult în dimensiune, cele mai multe celule păreau să posede un sortiment de granule de dimensiuni diferite, excluzând astfel o subclasificare a acestui tip celular, așa cum a fost sugerat pentru alte specii . Până în acest moment, nu au fost publicate date fiziologice care să susțină existența „celulei δ” în insulele pancreatice ale peștilor. Diferiți protagoniști au susținut existența celulelor δ cu date bazate pe examinări la microscopia optică a argintului capricios, a acidului fosfotungstic-hematoxilină și a altor coloranți de granule sau pe studii la microscopia electronică a țesuturilor slab conservate. Micrografiile prezentate aici susțin opinia considerată de Bloom în 1931 și, ulterior, de Gomori în 1941, conform căreia celulele δ ar putea reprezenta celule α modificate.
Tranziția de la granula α tipică, cu porțiuni interioare dense și exterioare mai puțin dense, la o granula δ de aproximativ aceeași dimensiune, cu densitate uniformă, dar diminuată, este adesea însoțită de o pierdere treptată a integrității morfologice sau a intensității de colorare a mitocondriilor, a complexului Golgi și a componentelor membranoase ale reticulului endoplasmatic granular. Nucleii intacți și care par viabili, precum și persistența unui număr mic de ribozomi liberi și de corpuri ceroide sugerează că așa-numitele celule δ sunt viabile chiar și în stadiul final presupus al acestei tranziții, adică atunci când granulele secretorii nu mai sunt vizibile, iar toate organitele citoplasmatice, altele decât granulele ceroide și ribozomii, sunt absente. În lipsa unor date fiziologice care să atribuie o funcție celulelor δ și în absența unor dovezi morfologice mai convingătoare pentru un tip celular separat, se speră că prezentarea de aici a unei tranziții probabile de la celulele α la celulele δ va fi acceptată ca fiind cea mai probabilă explicație a celei de-a treia celule granulare a Bloom la om . Semnificația acestor celule α viabile, dar alterate, nu este cunoscută. Deși celulele α și β, singure sau în grupuri mici, pot fi observate în interiorul acinilor și canalelor, în nici unul dintre cele patru eșantioane pancreatice studiate nu au fost observate forme intermediare între celulele acinare și cele ale insulelor sau cele ale canalelor și ale insulelor, așa cum au sugerat Nakamura și Yokote (4).
Conflict de interese
Autorii declară că nu există niciun conflict de interese în ceea ce privește publicarea acestei lucrări.
Recunoștințe
L. A. Romano a primit burse de cercetare de productivitate de la Consiliul Brazilian de Cercetare, CNPq (Procesul nr. PQ 301002/2012-6).
.