Abstract
Se descrie derivarea unui model cantitativ al metabolismului fenilalaninei la om. Modelul se bazează pe proprietățile cinetice ale fenilalanin-hidroxilazei umane recombinante pure și pe estimări ale ratelor in vivo de transaminare a fenilalaninei și de degradare a proteinelor. Valorile calculate pentru concentrația de echilibru a fenilalaninei din sânge, rata de eliminare a fenilalaninei din sânge după administrarea orală a aminoacidului și toleranța alimentară a fenilalaninei sunt în concordanță cu datele obținute de la pacienți normali, precum și de la pacienți fenilcetonurici și heterozigoți obligatorii. Aceste valori calculate pot ajuta la luarea unei decizii cu privire la gradul de restricție a aportului de fenilalanină care este necesar pentru a obține un rezultat clinic satisfăcător la pacienții clasici și la cei cu forme mai ușoare ale bolii.
Etapa inițială și limitatoare de viteză în catabolismul complet al fenilalaninei la CO2 și apă este hidroxilarea acesteia la tirozină, reacție catalizată de sistemul de hidroxilare a fenilalaninei. Sistemul este complex, fiind alcătuit din fenilalanină hidroxilază (PAH), coenzima pterină tetrahidrobiopterină (BH4) și mai multe enzime care servesc la regenerarea BH4, și anume, dihidropteridin reductaza și pterina 4α-carbinolamina dehidrataza (1, 2).
Deși inelul benzenic al fenilalaninei nu poate fi rupt fără a fi mai întâi hidroxilat în poziția para, catena laterală alanină a aminoacidului poate fi metabolizată chiar și în absența etapei de hidroxilare a inelului. Această cale alternativă este inițiată prin transaminare a fenilalaninei în fenilpiruvat, urmată de conversia acestui din urmă compus în metaboliți cum ar fi fenilctatul, fenilacetatul și o-hidroxifenilacetatul. Produșii căii transaminazelor sunt excretați în urină. Etapele acestor căi alternative de metabolizare a fenilalaninei sunt prezentate în figura 1.
De la început, trebuie remarcat faptul că o încercare anterioară de a efectua o astfel de analiză a fost împiedicată de lipsa datelor privind proprietățile cinetice ale HAP uman și ale fenilalaninei transaminazei umane. Într-adevăr, pentru cea din urmă enzimă, nici măcar identitatea celei responsabile de această activitate in vivo nu era cunoscută cu certitudine. Deoarece dovezile in vitro au indicat faptul că fenilalanina este un substrat excelent pentru aspartat aminotransferaza mitocondrială, s-a presupus că aceasta este transaminaza implicată. În plus, deoarece proprietățile omologului uman nu erau cunoscute, au fost utilizate proprietățile cinetice ale enzimei corespunzătoare de șobolan (12). Modul în care a fost tratată problema transaminazei umane în prezenta analiză va fi discutat mai jos.
Proprietățile cinetice ale HAP umane recombinante sunt acum disponibile (16, 17). Cinetica HAP este oarecum complicată de faptul că fenilalanina servește nu numai ca substrat pentru enzimă, ci și ca activator (a se vedea ref. 1 și referințele din acestea). Deoarece o analiză anterioară a comportamentului cinetic al HAP bazată pe un model cu două situsuri, cu legare ordonată a fenilalaninei atât la un situs catalitic, cât și la un situs de reglare, ar putea explica în mod adecvat multe aspecte particulare ale comportamentului cinetic al enzimei (18), în analiza de față a fost utilizat un model similar cu două situsuri, cu legare ordonată. Ecuația de viteză reală utilizată (19) este prezentată în Ecuația 2, în care Km este concentrația de fenilalanină care dă o viteză semimaximă, iar Ka este concentrația de fenilalanină care dă o activare semimaximă într-un experiment în care HAP a fost preincubată cu diferite concentrații de fenilalanină. Pentru prezenta analiză, au fost utilizate următoarele constante cinetice, determinate cu HAP uman recombinant pur la 37°C cu BH4 ca și coenzimă: Km pentru fenilalanină, 0,51 mM, și Ka pentru fenilalanină ca activator, 0,54 mM (D. Kowlessur și S.K., date nepublicate). O valoare aproximativă a Vmax pentru HAP uman (16) (probabil o subestimare) a fost calculată pornind de la rata inițială de scădere a nivelurilor serice de fenilalanină (0,9 μmol/ml pe oră) la subiecții de control după ce aceștia au primit o încărcătură orală de l-fenilalanină care a fost suficientă pentru a le crește nivelurile serice de fenilalanină de ≈17 ori (20). 
2 După cum s-a indicat mai sus, problema anterioară a identității enzimei la om care este responsabilă de transaminare a fenilalaninei a fost ocolită în prezenta analiză. S-a presupus că principala cale de eliminare netă a fenilalaninei la pacienții cu PKU clasică este prin transaminare. De exemplu, după cum s-a menționat deja, excreția urinară de fenilalanină este de numai ≈11% din cantitatea care este transaminată și, la sfârșitul primului an de viață, se poate estima că cantitatea de fenilalanină eliminată prin încorporare în proteine este de numai ≈25% din cea eliminată prin transaminare. Trebuie remarcat faptul că, în cazul prezentei metode de estimare a ratei transaminazei fenilalaninei, care se bazează pe rata de eliminare a fenilalaninei din sânge, reacțiile minore de eliminare a fenilalaninei, cum ar fi excreția urinară și încorporarea acesteia în proteine, sunt subsumate în estimarea activității transaminazei, ceea ce duce la o mică supraestimare a acestei activități.
Pentru a fi utile în prezenta analiză, sunt necesare valori pentru Km și Vmax ale transaminazei. S-au făcut încercări de a extrage o valoare Km pentru transaminația fenilalaninei din rezultatele testelor de încărcare cu fenilalanină efectuate pe pacienți cu PKU clasică (21). Abordarea adoptată pentru estimarea unei valori pentru Vmax pentru enzima transaminantă umană a fost aceea de a utiliza date privind suma tuturor metaboliților derivați din transaminare (adică fenilpiruvatul, fenilctatul și o-hidroxifenilacetatul) excretați de un grup de pacienți cu PKU clasică în funcție de nivelurile plasmatice de fenilalanină. Cantitatea maximă excretată, exprimată în mmol/mol de creatinină, a fost de 1,370, nivel care părea să se stabilizeze la niveluri plasmatice de fenilalanină cuprinse între 1,200 și 2,400 μmol/litru (22).
Tentativele de a converti această valoare într-o rată de transaminare sunt complicate de gama largă de vârste, de la ≈2 ani la ≈18 ani, din eșantionul de pacienți utilizat în studiu. Pentru prezenta analiză, s-a presupus că greutatea corporală medie a pacienților a fost de 50 kg și că excreția zilnică de creatinină a fost de 2 g/24 h (23). S-a presupus, de asemenea, că excreția metaboliților derivați din transaminaze are loc la o rată liniară pe parcursul perioadei de 24 de ore și reflectă rata de formare a acestor metaboliți. S-a presupus, de asemenea, că acești compuși se echilibrează cu toate compartimentele de lichide corporale, cu excepția țesutului conjunctiv cartilaginos dens și a oaselor, care, împreună, reprezintă 15 % din totalul apei corporale (24), ceea ce dă un volum de distribuție a apei accesibile de 500 ml/kg de greutate corporală. Pe baza acestor ipoteze, rata maximă de transaminare a fost calculată ca fiind de 0,043 μmol/ml pe oră.
Un produs suplimentar al metabolismului fenilalaninei care este derivat, cel puțin parțial, din fenilpiruvat și care nu a fost măsurat în studiul lui Langenbeck și colab. (22) este fenilacetilglutamina (PAG). Există dovezi că PAG poate fi formată din fenilacetat, care este derivat din fenilpiruvat prin decarboxilare oxidativă (25). S-a propus, de asemenea, că fenilacetatul și, prin urmare, PAG, se poate forma din fenilalanină pe o cale care nu implică transaminare, ci implică decarboxilarea în feniletilamină urmată de oxidarea aminei în fenilacetat (26). Cu toate acestea, constatarea faptului că cantitatea de feniletilamină excretată la pacienții cu PKU este mică chiar și după ce oxidarea aminei a fost blocată prin administrarea unui inhibitor al aminoxidazei (27), indică faptul că, așa cum s-a discutat anterior (12), decarboxilarea fenilalaninei este o cale cantitativ minoră pentru metabolismul fenilalaninei, precum și pentru formarea PAG.
Cantitatea de PAG excretată de indivizii normali este de 250-500 mg/zi; pacienții cu PKU excretă de două ori această cantitate (28). În scopul calculării cantității de PAG formată prin intermediul căii transaminazelor, s-a pornit de la ipoteza conservatoare că doar cantitatea „în plus” excretată de pacienți provine din fenilpiruvat. Luând cantitatea medie suplimentară de PAG excretată ca fiind de 350 mg/zi și făcând aceleași ipoteze prezentate mai sus, această excreție se traduce printr-o rată de formare a PAG de 0,020 μmol/ml pe oră, ceea ce aduce rata de formare a tuturor produselor transaminate la 0,063 μmol/ml pe oră.
Cu utilizarea acestei valori pentru Vmax, rezultatele testului de încărcare cu fenilalanină efectuat pe pacienții cu PKU clasică (21) au fost utilizate pentru a calcula o valoare de 1.37 ± 0,14 mM (medie ± SD, n = 3) pentru Km al fenilalaninei transaminazei.
Pentru că în prezenta analiză, activitățile HAP și transaminazei sunt calculate în funcție de nivelurile de fenilalanină din sânge, este important ca aceste niveluri să reflecte nivelurile tisulare ale aminoacidului. În acest sens, s-a raportat că nivelurile de fenilalanină din țesutul hepatic de la un pacient cu PKU (29), precum și din țesutul hepatic și renal de la șobolani hiperfenilalanemici (30) sunt comparabile cu nivelurile corespunzătoare din sânge.
Cel de-al treilea termen din ecuația 2, rata de degradare netă a proteinelor, a fost estimat pe baza datelor lui Waterlow și Jackson (31), arătând că în stare de post, starea în care se efectuează testul de încărcare cu fenilalanină, degradarea netă a proteinelor (de ex, cantitatea de proteine descompuse minus cantitatea sintetizată) este egală cu 0,30 g/kg de greutate corporală pe 12 h. Deoarece mușchiul scheletic constituie ≈40% din masa corporală (24) și catabolismul proteic din acest țesut joacă un rol major în livrarea de aminoacizi către periferie, degradarea proteinelor în mușchiul scheletic a fost considerată ca fiind evenimentul predominant în degradarea proteinelor care are loc în timpul postului.
Mușchiul scheletic uman conține ≈46 μmol fenilalanină/g țesut (32). Pe baza acestei valori și a constatării că mușchiul uman adult conține 19,8% proteine (33), se poate estima că mușchiul conține 232 μmol fenilalanină/g de proteină musculară. Dacă această valoare este considerată reprezentativă pentru depozitele de proteine corporale, aceasta ar indica faptul că ≈70 μmol fenilalanină/kg de greutate corporală pe 12 h ar fi eliberată în timpul perioadei de post. Pe baza acelorași ipoteze ca și cele făcute mai sus pentru estimarea ratei de transaminare a fenilalaninei, ultima valoare s-ar traduce printr-o rată orară de degradare netă a proteinelor (și de eliberare a fenilalaninei din acest proces) de 0,012 μmol/ml pe oră. Deoarece substratul pentru această reacție, și anume rezervele corporale de proteine, ar rămâne probabil relativ constant în timpul unei perioade scurte de post, s-a presupus că degradarea proteinelor urmează o cinetică de ordin zero.
Substituind valorile estimate pentru constantele cinetice pentru cele trei reacții prezentate în Ecuația 1 se obține Ecuația 3: 
3
REZULTATE ȘI DISCUȚII
Valabilitatea generală a Ecuației 3 poate fi evaluată în mai multe moduri. În primul rând, cu ajutorul expresiei pentru viteza reacției catalizate de HAP, incluzând constantele cinetice prezentate în ecuație, viteza bazală a reacției de hidroxilare a fost calculată ca fiind de 0,010 μmol/ml pe h. Această valoare este în concordanță cu următoarele valori raportate pentru subiecții normali pe baza experimentelor în care subiecții au fost perfuzați cu l-fenilalanină: 0,013 μmol/ml pe h; 0,008 μmol/ml pe h (34); 0,012 μmol/ml pe h (5); 0,010 μmol/ml pe h (6). O valoare de 0,020 μmol/ml pe h a fost găsită în ultimul studiu atunci când subiecții au fost perfuzați cu l-fenilalanină (6). Ratele in vivo citate pentru conversia fenilalaninei în tirozină au fost toate raportate ca μmol/h pe kg. Acestea au fost convertite în μmol/ml pe oră pe baza acelorași ipoteze utilizate anterior, și anume că volumul de distribuție al metaboliților precum fenilalanina este de 500 ml/kg de greutate corporală. Aceste rezultate arată că rata calculată de hidroxilare a fenilalaninei este în concordanță cu ratele determinate experimental.
Un alt test al validității modelului este calcularea nivelului de fenilalanină din sânge în stare de echilibru, atât pentru subiecții de control, cât și pentru heterozigoții PKU, despre care se presupune că au 50% din activitatea normală a HAP, precum și t1/2 pentru eliminarea unei sarcini de fenilalanină (i.e, timpul necesar pentru ca concentrația inițială de fenilalanină să scadă la jumătate din valoarea sa inițială) din sânge pentru aceste două grupuri. Nivelul de fenilalanină în stare de echilibru pentru martori, calculat din Ecuația 3 (prin stabilirea termenului „-dPhe/dt” egal cu zero și calcularea concentrației de fenilalanină), este de 0,059 mM, iar cel pentru subiecții cu 50% activitate reziduală HAP este de 0,079 mM, de 1,34 ori mai mare decât nivelul martorilor. Deși valoarea de 0,059 mM pentru subiecții normali este în concordanță cu valoarea acceptată de 0,058 ± 0,015 mM (medie și SD) (35), valoarea de 0,079 mM pentru heterozigoți, care ar putea fi de așteptat să aibă 50% din nivelul normal de HAP, pare a fi prea mică. Raportul dintre nivelurile de fenilalanină din sânge pentru martori și pentru heterozigoții PKU obligatorii a fost raportat ca fiind în intervalul 1,57-1,61 (36-38), mai degrabă decât raportul de 1,34 care a fost prezis de model.
Această valoare calculată ridică posibilitatea ca heterozigoții PKU să aibă mai puțin de 50% din activitatea HAP normală. Înlocuind o valoare de 40% din activitatea HAP de control pentru heterozigoți în Ecuația 3, se obține o concentrație de fenilalanină în stare de echilibru de 0,093 mM; cu utilizarea acestei valori și a valorii de 0,058 mM pentru martori, se obține un raport de 1,60, care este apropiat de intervalul raportat pentru heterozigoți și martori (a se vedea mai sus). În acest sens, trebuie remarcat faptul că activitatea reziduală a HAP în probele de biopsie hepatică descoperite pentru șase heterozigoți HPA obligați a variat între 5,8 și 31% din valorile de control (39). Aceste rezultate au oferit primul indiciu că heterozigoții HPA heterozigoți au o activitate semnificativ mai mică de 50 % din activitatea de control. Două studii ulterioare mai mari ale părinților pacienților cu PKU au fost în concordanță cu aceste rezultate anterioare: un studiu a raportat o valoare medie de 29,3% din controale (n = 9) (40) și un altul a raportat o valoare medie de 28,1% (n = 8) (41).
Modelul prezice, de asemenea, valori t1/2 pentru eliminarea fenilalaninei din sânge atât pentru persoanele normale, cât și pentru heterozigoți, care sunt în concordanță cu rezultatele clinice reale. Pentru persoanele normale, se obține o valoare de 65 min, care este mai mică decât valoarea medie raportată de 89 min, dar se încadrează bine în intervalul de 60-120 min (10). Pentru heterozigoții cu 50 și 40% activitate reziduală a HAP, valorile t1/2 calculate din Ecuația 3 sunt de 144 și respectiv 180 min, comparativ cu o valoare medie raportată de 159 min .
S-a făcut referire anterior la un raport despre doi pacienți HPA a căror incapacitate de a metaboliza fenilalanina părea a fi rezultatul unui deficit de transaminază (11) și la dovezile împotriva acestei concluzii (12). Modelul de față oferă un motiv suplimentar pentru a privi această afirmație cu scepticism. Fig. 2 prezintă evoluția în timp a dispariției fenilalaninei 1 mM din plasma unui subiect de control (curba A), precum și a unui subiect lipsit de transaminază, dar cu niveluri normale de HAP (curba B). După cum se poate observa, cele două rate sunt aproape identice, ceea ce face extrem de improbabil ca HPA pronunțată să poată fi cauzată de lipsa transaminazei. Motivul pentru care cele două rate sunt aproape identice este că rata de dispariție a fenilalaninei în absența totală a HAP (curba D) este foarte mică, rata inițială fiind de numai 2,6 % din cea a unui martor cu niveluri normale de HAP. Fig. 2 (curba C) prezintă, de asemenea, rata de eliminare a fenilalaninei la un individ cu 40% din nivelul normal de HAP, un deficit de activitate a HAP care, așa cum s-a discutat mai sus, poate reprezenta media pentru heterozigoții PKU.
Ratele calculate de eliminare a unei sarcini de fenilalanină pentru martori și pentru indivizi cu diferite genotipuri. A, martori; B, subiect cu activitate transaminazică zero; C, subiect cu 40% din activitatea HAP de control; D, subiect cu 0% din activitatea HAP de control.
Recent, pacienții cu PKU au fost clasificați prin atribuirea lor la categorii de fenotipuri pe baza toleranței lor la fenilalanina din alimentație. Pacienții cu PKU clasică tolerează mai puțin de 20 mg/kg de fenilalanină pe zi pentru a-și menține nivelul de fenilalanină din sânge la nivelul acceptat de 0,3 mM, cei cu „PKU moderată” tolerează 20-25 mg/kg pe zi, iar cei cu „PKU ușoară” tolerează 25-50 mg/kg pe zi (42).
Pentru a vedea dacă aceste valori de toleranță alimentară la fenilalanină sunt coerente cu predicțiile făcute de Ecuația 3, s-a presupus că aportul cantității admise de fenilalanină a fost împărțit în mod egal în trei „mese”. Pentru pacienții PKU clasici cu un aport de fenilalanină de 15 mg/kg pe zi, fiecare masă ar conține 5 mg/kg pe zi și ar adăuga 0,06 μmol/ml la valoarea de bază de 0,30 μmol/ml, pentru un nivel total de fenilalanină plasmatică de 0,30 + 0,06 = 0,36 μmol/ml. Înlocuind această valoare în Ecuația 3 (presupunând că Vmax pentru un pacient cu PKU clasică este egal cu zero), -dPhe/dt este egal cu 0,001 μmol/ml pe oră, adică, la acest nivel de fenilalanină, viteza de dispariție a fenilalaninei prin reacția de transaminare depășește cu puțin viteza de intrare a fenilalaninei în fondul plasmatic prin degradarea netă a proteinelor. Prin urmare, ecuația 3 prezice că acești pacienți cu PKU ar putea tolera un aport de fenilalanină de 15 mg/kg pe zi.
Calculat în același mod, pacienții cu „PKU moderată” cu o toleranță alimentară la fenilalanină de 25 mg/kg pe zi ar avea nevoie de o activitate reziduală a HAP egală cu 15% din cea a tipului sălbatic pentru a o metaboliza în 3.5 h. În mod similar, pacienții cu „PKU ușoară” cu o toleranță alimentară la fenilalanină de 50 mg/kg pe zi ar avea nevoie de un nivel rezidual de HAP de 25% din nivelul tipului sălbatic pentru a metaboliza fenilalanina adăugată în aproximativ 3.5 h. Aceste rezultate indică faptul că Ecuația 3 poate explica toleranța la fenilalanina alimentară observată la aceste grupuri diferite de pacienți.
Ar fi util să încercăm să corelăm aceste estimări ale activității reziduale a HAP pentru pacienții cu „PKU ușoară” și „PKU moderată” cu activitatea hidroxilazei reziduale măsurată in vitro pentru speciile mutante de HAP găzduite de pacienți. Cu toate acestea, în prezent, o astfel de încercare este îngreunată de faptul că există prea multă dispersie în datele in vitro. Astfel, s-a demonstrat că mai mulți pacienți clasificați ca având „PKU moderată” (42) au găzduit următoarele trei forme mutante de HAP (cu activitățile reziduale in vitro ale HAP exprimate ca procent din activitățile de tip sălbatic, prezentate în paranteză): L348V (25%), R261Q (30%, 47%) și R158Q (10%) (43). Se poate observa că aceste valori variază de aproape 5 ori. După cum s-a discutat anterior (2, 43), în general, estimările in vitro ale activității reziduale de hidoxilază a mutanților HAP tind să fie mai mari decât cele observate în biopsiile hepatice. Cel puțin un motiv pentru această tendință este faptul că activitățile HAP in vitro sunt de obicei măsurate prin utilizarea unor concentrații saturate de fenilalanină și BH4, așa cum s-a făcut pentru mutantul R261Q (44). Având în vedere această situație, este posibil ca activitățile reziduale ale HAP estimate cu ajutorul ecuației 3 să se dovedească a fi o mai bună reflectare a activităților in vivo decât cele măsurate in vitro.
Acest model al metabolismului fenilalaninei este relevant pentru concluzia la care au ajuns Thompson și colegii săi (45, 46), pe baza rezultatelor obținute prin perfuzia subiecților cu fenilalanină și tirozină marcate cu deuteriu, că pacienții cu PKU clasică au o activitate HAP „substanțială” care este egală cu aproximativ 76% din cea a subiecților de control. Această activitate de hidroxilare a fenilalaninei uimitor de ridicată a fost atribuită tirozinei hidroxilază (45). După cum s-a discutat deja, rezultatele rezumate în Fig. 2 arată că, în absența HAP, o doză de fenilalanină este eliminată din sânge la mai puțin de 3% din rata observată la martori. Analiza de față nu indică faptul că la om există vreo cale alternativă care poate elimina cantități mari de fenilalanină. Recent, van Spronsen și colab. (34) au semnalat o potențială problemă metodologică a metodei utilizate de Thompson și colaboratorii.
În concluzie, rezultatele cantitative obținute cu modelul pentru metabolismul HAP sunt coerente cu datele care reflectă indirect activitatea in vivo a HAP, cum ar fi nivelurile de fenilalanină din sânge în stare de echilibru, ratele de eliminare (exprimate în mod convențional ca valori t1/2) a fenilalaninei din sânge după o încărcătură de fenilalanină și toleranța alimentară la fenilalanină. Modelul are potențialul de a estima cantitativ activitatea reziduală a HAP din oricare dintre aceste valori, în special din ratele măsurate de eliminare a unei încărcături de fenilalanină. Nivelurile de HAP reziduale prezise sau valorile derivate din acestea pot fi utile pentru a lua decizii cu privire la cât de strictă trebuie să fie restricția alimentară de fenilalanină pentru a obține nivelul dorit de fenilalanină în sânge. Tabelul 1 rezumă valorile t1/2 și nivelurile de fenilalanină în sânge la starea de echilibru calculate din Ecuația 3 (presupunând că nu se consumă fenilalanină în timpul perioadei de testare) pentru diferite niveluri de activitate reziduală a HAP, precum și valorile comparabile din datele clinice relevante.
- Vezi în linie
- Vezi popup
Nivelurile de fenilalanină în sânge în stare staționară și valorile t
pentru clearance-ul fenilalaninei calculate din Ec. 3 pentru diferite niveluri de HAP
Notele de subsol
-
↵* Către cine trebuie adresate cererile de retipărire. e-mail: kaufman{at}codon.nih.gov.
ABREVIERI
PAH, fenilalanină hidroxilază; PKU, fenilcetonurie; HPA, hiperfenilalaninemie; PAG, fenilacetilglutamină