Aristoteles undervisade Alexander (356-323 f.Kr.) innan denne år 336 f.Kr. ärvde Makedoniens tron och började utvidga det imperium som hans far hade vunnit genom erövringar. Senare kom trädgården vid Lyceum i Aten att innehålla växter som anhängare till Alexanders arméer bidrog med. Teofrastos baserade många av sina växtbeskrivningar på redogörelser som han fick från resenärer som hade besökt avlägsna regioner i Alexanders rike. Biblioteket i Alexandria, som Dioskorides troligen använde, öppnades under Alexanders general Ptolemaios I Soter (ca 367 f.Kr. – ca 283 f.Kr.). Ptolemaios I var en nära personlig vän till Alexander och kan ha varit en studiekamrat som undervisades av Aristoteles. Han blev Egyptens härskare 323 f.v.t. efter Alexanders död. Det egentliga arbetet med att planera och övervaka biblioteket delegerades till Demetrius av Phaleron (ca 350-ca 280 f.v.t.), en elev till Theofrastus vid Lyceum.

Alexander styrde Makedonien som regent från 340 f.v.t., medan hans far, Filip II, ledde en stor makedonsk armé som invaderade Thrakien, det land som gränsar till Makedonien i öster. Senare bråkade Alexander med Filip och lämnade Makedonien, men 336 f.Kr. mördades Filip och Alexander, 20 år gammal, blev Alexander III av Makedonien, senare kallad Alexander den store. När nyheten om Filips död spreds såg människorna i de länder som erövrats av makedonerna en chans att ta sin frihet, och Alexander var tvungen att agera. Han började med att avrätta alla sina motståndare inom Makedonien och återupprättade sedan det makedonska styret i Grekland, Trakien och Illyrien.

Efter att ha lämnat den erfarne generalen Antipater (ca 398-319 f.v.t.) för att upprätthålla ordningen på hemmaplan ledde Alexander 334 f.v.t. en stor styrka in i Mindre Asien, som det första steget i sin imperiala expansion. Makedonierna besegrade en stor persisk armé, säkrade Mindre Asiens kust, och 333 f.Kr. bekämpade och besegrade de en annan persisk armé, den här ledd av den persiske kungen Dareios III. Alexanders styrkor kämpade sig sedan söderut genom Syrien och Fenicien. På våren 331 f.Kr. gick makedonierna in i Egypten. Efter några månader återvände de till Tyrus, där de fick förstärkningar från Europa och fortsatte österut. De besegrade perserna ännu en gång vid Gaugemala, öster om floden Tigris, ockuperade Babylon och intog sedan Susa och persernas huvudstad Persepolis, och Alexander utropades till kung av Asien. Makedonierna återupptog sedan jakten på Dareios, som de fann döende av sår som tillfogats av en av hans egna adelsmän – som senare tillfångatogs av makedonierna och straffades på Alexanders order. De pressade sig österut in i Centralasien och nådde Tian Shanbergen i västra Kina, där en statyett av en grekisk soldat har hittats i en begravningsplats.

År 326 f.v.t. bjöd Alexander in hövdingarna från det som nu är norra Pakistan att underkasta sig hans styre. Några gick med på det, men andra motsatte sig makedonierna och övervann först efter intensiva strider där Alexander sårades. De makedonska soldaterna, som längtade efter att återse sina hem och familjer, motsatte sig Alexanders plan att tränga längre in i Indien och övertalade honom att vända om. De nådde Babylon, där Alexander dog den 11 juni 323 f.Kr. i Nebukadrezar II:s palats. Historikerna är osäkra på orsaken till hans död, men det är mest troligt att den berodde på sjukdom. Om ytterligare en månad skulle Alexander ha fyllt 33 år. Som följande karta visar sträckte sig hans imperium på sin höjdpunkt från Makedonien i väster till Indusdalen i öster och från Svarta havets och Kaspiska havets södra stränder till Egypten. Imperiet började falla sönder några år efter Alexanders död och bröts upp i många oberoende riken.

Alexander hade varit elev till Aristoteles, och även om den unge mannens utbildning avbröts var han mycket intelligent och Aristoteles hade utövat ett starkt inflytande på hans utveckling. Aristoteles uppmuntrade alla sina elever att observera och undersöka naturen, och Alexander var mycket intresserad av växter och djur. Ett stort följe av lärda följde honom när han ledde sina arméer. De mätte avstånd, förberedde kartor, studerade okända religioner och även flora och fauna. När de stötte på okända växt- eller djurarter skickade Alexander exemplar tillbaka till Europa, många av dem till Lyceum i Aten för att uppmärksammas av Aristoteles själv. Han samlade in den information han kunde om lokala växtbaserade behandlingar och praktiserade medicin och behandlade personligen en del av de skador och sjukdomar som drabbade hans soldater.

År 332 f.Kr. grundade Alexander staden Alexandria på platsen för Rhakotis, en egyptisk fiskehamn. Han avsåg att staden skulle bygga en bro mellan Greklands och Egyptens kulturer, men han stannade där bara några månader efter att bygget påbörjats, och han återvände aldrig. Efter Alexanders död lyckades Ptolemaios I få hans kropp förd till staden. Biblioteket i Alexandria byggdes som en kopia av Lyceum, med en gång med pelargångar och trädgårdar. Det fanns föreläsningssalar, läsrum och en gemensam matsal, och biblioteket låg bredvid och i tjänst hos Musaeum, som var ett tempel som användes som en akademisk institution – och ursprunget till ordet museum. Bibliotekets föreståndare fick i uppdrag att samla all information i världen. Bibliotekets representanter deltog i bokmässor i Aten och Rhodos, och när ett fartyg anlände till hamnen skulle alla böcker som det förde med sig beslagtas och kopieras, varvid biblioteket behöll originalen och återlämnade kopiorna till skeppsmäklaren. Detta är det bibliotek där Pedanius Dioscorides kan ha studerat. En stor del av biblioteket brändes oavsiktligt ner 48 f.Kr. under ett inbördeskrig, och även om en filial av biblioteket, det så kallade dotterbiblioteket, fortsatte att fungera söder om staden, förstördes även den 391 f.Kr. när den romerske kejsaren Theodosius I (347-395) beordrade att alla hedniska tempel skulle förstöras.