I.U.B.: 3.4.21.1
C.A.S.: 9004-07-3

Enzymatisk reaktion (bilden öppnas i ett nytt fönster)

Chymotrypsin är ett serinendopeptidas som produceras av acinarcellerna i bukspottkörteln. Chymotrypsin aktiveras efter proteolys av chymotrypsinogen med trypsin. Medan trypsin hydrolyserar vid lysin och arginin, klyver chymotrypsin selektivt peptidbindningar som bildas av aromatiska rester (tyrosin, fenylalanin och tryptofan) (Hedstrom et al. 1992). Två dominerande former av chymotrypsin, A och B, finns i lika stora mängder i nötkreaturs bukspottkörtel. De är mycket likartade proteiner (80 % identiska), men har betydligt olika proteolytiska egenskaper (Hartley 1964, Meloun et al. 1966, Smillie et al. 1968 och Gráf et al. 2004). Informationen nedan gäller främst A-formen av chymotrypsinogen och chymotrypsin.

Historia:

I början av 1900-talet föreslog Vernon att bukspottkörtelpreparat kunde ge upphov till en inneboende aktivator av sina egna enzymer (Vernon 1901). Vernons experiment med mjölkproppning fastställde att det fanns minst två enzymer närvarande och att det ena var stabilare än det andra (Vernon 1902). Denna idé accepterades dock inte allmänt förrän 1934 när Kunitz och Northrop bekräftade förekomsten av ett enzym utöver trypsin och gav det namnet chymotrypsin. De kunde kristallisera chymotrypsin samt den inaktiva prekursorn, chymotrypsinogen (Kunitz och Northrop 1934). År 1938 isolerade Kunitz olika aktiva former av chymotrypsin och betecknade dem som alfa, beta och gamma (Kunitz 1938).

I början av 1940-talet studerade Fruton och Bergmann ytterligare chymotrypsins specificitet och rapporterade om flera nya substrat (Fruton och Bergmann 1942). Jacobsen identifierade snart ytterligare former av chymotrypsin och betecknade dem som delta och pi (Jacobsen 1947). År 1948 karakteriserade Schwert ytterligare molekylvikterna hos chymotrypsin och chymotrypsinogen.

1954 rapporterades de första bevisen för trestegsmekanismen för chymotrypsin som hydrolyserar amid- och estersubstrat av Hartley och Kilby, som ställde hypotesen om närvaron av en acylenzymintermediär, vilket senare visade sig vara sant (Henderson 1970). År 1955 erhöll Laskowski ett andra kristallint chymotrypsinogen och gav det namnet chymotrypsinogen B. År 1964 bestämde Hartley aminosyrasekvensen för chymotrypsin A, som senare förfinades av Meloun et al. 1966. År 1968 bestämde Smillie et al. aminosyrasekvensen för chymotrypsin B, som visade en 80-procentig sekvensidentitet med chymotrypsin A. Under 1970- och 1980-talen gjordes forskning för att bättre förstå verkningsmekanismen och identifiera skillnaderna i aminosyrasekvenserna mellan trypsin och chymotrypsin (Steitz et al. 1969, Cohen et al. 1981, Asbóth och Polgár 1983 och Gráf et al. 1988).

Under 1990-talet renades chymotrypsin från andra källor, bland annat från torsk (Ásgeirsson och Bjarnason 1991) och kamel (Al-Ajlan och Bailey 1997). Man började också undersöka inhibitorer (Baek et al. 1990), och Frigerio et al. klarlade kristallstrukturen för bovint chymotrypsin med en upplösning på 2,0 Å (Frigerio et al. 1992).

Nyare forskning har undersökt veckning och denaturering av chymotrypsin i olika koncentrationer (Ghaouar et al. 2010), chymotrypsins interaktion med substrat av nanopartiklar (You et al. 2006 och Jordan et al. 2009) och öka chymotrypsinets stabilitet genom konjugering till PEG-molekyler (Castellanos et al. 2005 och Rodríguez-Martínez et al. 2009).

Specificitet:

Chymotrypsin aktiveras genom att bindningen mellan arginin och isoleucin (R15 och I16) klyvs av trypsin, vilket leder till strukturella modifieringar och bildande av substratbindningsstället (Sears 2010). Chymotrypsin skiljer sig från trypsin genom att trypsin klyver peptider vid arginin- och lysinrester, medan chymotrypsin föredrar stora hydrofoba rester (Hedstrom et al. 1992). Chymotrypsin katalyserar företrädesvis hydrolys av peptidbindningar som involverar L-isomerer av tyrosin, fenylalanin och tryptofan. Det agerar också lätt på amider och estrarer av mottagliga aminosyror. Chymotrypsins specificitet för stora hydrofoba rester kan förklaras av en hydrofob S1-bindningsficka som bildas av resterna 189 till 195, 214 till 220 och 225 till 228 (Cohen et al. 1981).

Trots att strukturen av trypsin och chymotrypsins S1-plats visar endast en skillnad (vid position 189) har platsriktad mutagenes av trypsin och chymotrypsin inte lyckats byta ut specificiteterna, vilket tyder på att den mekanism genom vilken trypsin och chymotrypsin uppnår substratspecifik katalys inte är helt klarlagd (Steitz et al. 1969 och Gráf et al. 1988).

Molekylära egenskaper:

Chymotrypsin A och B har 80 % sekvensidentitet (Hartley 1964, Meloun et al. 1966, Smillie et al. 1968 och Gráf et al. 2004). Aminosyrorna i den katalytiska triaden (H57, D102 och S195) är starkt konserverade i sekvenserna hos peptidaserna i familj S1 (Gráf et al. 2004). Serinet i position 214 är också mycket konserverat i familjen och har föreslagits som den fjärde medlemmen i den katalytiska triaden (Ohara et al. 1989 och McGrath et al. 1992).

Sammansättning:

De tre aminosyraresterna i den katalytiska triaden (H57, D102 och S195) är essentiella för klyvning av peptidbindningar och stabiliseras av vätebindningar (Sears 2010 och Gráf et al. 2004). G193 och S195 utgör oxyanjonhålet och interagerar med karbonylgruppen i den scissila peptidbindningen och orienterar den för att bilda den tetraedriska intermediären (Rühlmann et al. 1973, Huber och Bode 1978 och Gráf et al. 2004).

Proteinaccessionsnummer: P00766

CATH-klassificering (v. 3.3.0):

• Klass: Huvudsakligen Beta
• Arkitektur: Beta Barrel
• Topologi: Trypsinliknande serinproteas

Molekylvikt:

• 25,6 kDa (Wilcox 1970)

Optimalt pH: 7,8-8,0 (Rick 1974)

Isoelektrisk punkt:

• 8.52 (Chymotrypsinogen, teoretisk)
• 8,33 (Chymotrypsin, teoretisk)

Extinktionskoefficient:

• 51,840 cm-1 M-1 (teoretisk)
• E1%,280 = 20.19 (Chymotrypsinogen, teoretisk)
• E1%,280 = 20.57 (Chymotrypsin, teoretisk)

Residualer på den aktiva platsen:

• Histidin (H57)
• Aspartat (D102)
• Serin (S195)

Aktivatorer:

• Cetyltributylammoniumbromid (Spreti et al. 2008)
• Dodecyltrimetylammoniumbromid (Abuin et al. 2005)
• Hexadecyltrimetylammoniumbromid (Celej et al. 2004)
• Tetrabutylammoniumbromid (Spreti et al. 2001)

Hämmare:

• Hydroximetylpyrroler (Abell och Nabbs 2001)
• Boronsyror (Smoum et al. 2003)
• Courmarinderivat (Pochet et al. 2000)
• Peptidylaldehyder (Lesner et al. 2009)
• Peptider från naturliga källor (Telang et al. 2009, Roussel et al. 2001 och Chopin et al. 2000)
• Peptider som innehåller en onaturlig aminosyra (Legowska et al. 2009 och Wysocka et al. 2008)

Användningar:

• Sekvensanalys
• Peptidsyntes
• Peptidkartläggning
• Peptidfingerprinting

.