MYC-amplifiering minskar överlevnaden vid flera olika maligniteter hos människor

En av de viktigaste TF:erna som reglerar däggdjurscellernas cellproliferation är det virala myelocytomatos-onkoproteinet (MYC), vars funktion är bevarad över evolutionära hierarkier27,28,29,30,31. Fysiologiskt sett följs MYC-reglerad proliferation av program för differentiering av linjer som antagoniserar MYC för att avsluta proliferationen20. Vi analyserade MYC-förändringar genom två tillvägagångssätt. För det första analyserade vi kopianummerförändringar (CN) vid MYC-lokuset med hjälp av TCGA- och ICGC-data som är tillgängliga via cBioPortal-plattformen och fann frekventa amplifikationer och förstärkningar av MYC (fig. 1a). Vi fick sedan tillgång till TCGA pan-cancer (PANCAN) data som innehåller 11 000 patienter från 33 av de vanligaste tumörerna och analyserade dem via Xena Browser. MYC var starkt amplifierad i alla dessa maligniteter8,10. I båda datamängderna fastställdes MYC CN-förändringar med hjälp av GISTIC-poängmetoden, där värdena -2,-1,0,1,2 representerade homozygot deletion, heterozygot deletion, diploid, lågnivåamplifiering eller högnivåamplifiering32. Därefter utförde vi överlevnadsanalyser med hjälp av GISTIC-poäng som förutsäger lågnivådeletion/vildtyp MYC, jämfört med förstärkning/amplifiering med hjälp av PANCAN-dataset. MYC-amplifiering korrelerade med minskad total överlevnad (p < 9,784 × 10-11, n = 2628) jämfört med fall med MYC CN WT/lågnivådeletioner (n = 1352) (fig. 1b). Vi analyserade sedan korrelationen mellan GISTIC-poäng på MYC-locus vs. MYC mRNA-uttryck och patientöverlevnad. Det fanns en stark korrelation (spearman r = 0,3339, p < 0,0001, n = 9697) mellan MYC GISTIC score och MYC mRNA-uttryck (fig. 1c). Höga (n = 1762) jämfört med låga (n = 1776) MYC mRNA-nivåer var associerade med minskad (p < 5,609 × 10-8) total överlevnad (fig. 1d). MYC är således en viktig onkogen i många mänskliga maligniteter och identifiering av mekanismer för att motverka MYC i cancer skulle kunna ha terapeutiska tillämpningar. MYC-funktionen är bevarad över evolutionära hierarkier27,28,29,30,31. Protozoernas enkla livscykel kräver MYC för att generera dotterceller som liknar föräldracellerna vid varje celldelning27,29. Evolutionen från encelliga organismer till flercelliga organismer ledde till intensiv användning av energi för att öppna kromatinet och exponera naket DNA som gör det möjligt för linje TFs att binda och aktivera hundratals terminala differentieringsgener som styr cellens öde och specialisering i olika cellskikt. Denna process kräver inte aktivt prolifererande celler. Därför är MYC-medierad proliferation potent antagoniserad i detta skede33,34 (fig. 1e). Denna form av potent MYC-antagonism är också nödvändig för existensen av multi-cellularitet29,35. Överbevisande nog ökar infektion av flercelliga organismer med protozoaparasiter omvandlingen av infekterade celler till proliferativa celler genom komplexa mekanismer som aktiverar MYC-proteinet och undertrycker differentierings-TFs27,29,36.

Till skillnad från normala celler genomgår maligna celler proliferation utan terminaldifferentiering (fig. 1e, f). Denna avvikande process är starkt beroende av stabilisering av MYC och dess co-proteiner som modulerar celltillväxt och celldelning17,20,37,38,39. Genetiska och epigenetiska förändringar säkerställer att en ihållande proliferation av linjefixerade progenitorer sker utan slutlig differentiering i cancerceller (fig. 1e)7. För det första uppnås en ihållande proliferation genom konsekvent uppreglering och kromosomvinster av det genetiska lokus som kodar för MYC-genen i alla mänskliga maligniteter (fig. 1a). MYC-amplifiering förutsäger dålig total överlevnad (LogRank p-värde = 9,784 × 10-11, n = 3980) (fig. 1a, b). I studier som använder genetiskt konstruerade musmodeller (GEMM) eller xenograftmodeller av cancer, upprätthåller antagonisering av MYC tumörregression över flera tumörer39,40,41. Shachaf et al. utvecklade till exempel en transgen musmodell som villkorligt uttrycker MYC i hepatocyter med hjälp av tetracyklin-kontrollerat uttryck39. Inaktivering av Myc inducerade regression av murin HCC som ökade differentieringen av hepatocyter och hepatobiliära celler, förlust av HCC-markören α-fetoprotein och undertryckt proliferation39. I en xenograft PDAC-modell riktade Zhang et al. in sig på MYC-MAX dimerisering med en liten molekyl (10058-F4) som stör MYC:s transkriptionella aktivitet40. Tillägg av 10058-F4 till gemcitabin ledde till en drastisk dämpning av tumörigenesen jämfört med behandling med en enda substans40. Med hjälp av en Kras-driven musmodell för lungcancer riktade Soucek et al. in sig på MYC med hjälp av en dominant negativ mutant av MYC:s dimeriseringsdomän som stör MYC:s bindning till det kanoniska E-box-responselementet ”CACGTG” för Myc, vilket hämmar MYC:s transaktiveringsaktivitet41. Hämning av MYC-transaktivering ökade mössens överlevnad genom att stoppa tillväxten av lungcancer41.

Från ett översättningsperspektiv finns det olika utmaningar i försöket att direkt inrikta sig på MYC farmakologiskt42. Den viktigaste utmaningen är att proliferation är en egenskap hos normala progenitorer och att en sådan behandling skulle kunna ha ett dåligt terapeutiskt index20. Dessutom har tumörer heterogena genetiska bakgrunder som bidrar till en bibehållen MYC-aktivitet. För att förstå mekanismer som motverkar överdriven MYC-verksamhet är det därför nödvändigt att definiera de evolutionärt bevarade fysiologiska metoder genom vilka normala progenitorer motverkar MYC för att stänga av intensiv proliferation och hur dessa kan återställas i cancer.

Avsluta proliferation genom att aktivera apoptos är giftigt för normala celler som delar sig

För att bibehålla sammanhållning och integritet mellan olika celltyper har flercelliga organismer utvecklat ett system av kontroller och balanser som kollektivt kallas apoptos43,44. Apoptosens master TFs p53 (TP53) och dess kofaktor p16 eller p14ARF (CDKN2A) spelar avgörande roller genom att stoppa prolifererande celler för att möjliggöra reparation av skador, eller genom att initiera ett ordnat självmord om sådana skador inte kan repareras45,46. Under embryogenesen är uttrycket av p53 nedreglerat, kanske för att embryonala stamceller förnyar sig själva utan att exponentiellt föröka sig47,48,49. Funktionella studier av differentiellt uttryck av p53 med hjälp av reporterassays visade högre uttryck vid senare utvecklingsstadier och minskat uttryck i terminalt differentierade celler48. Under celldelningen är p53-vägar kraftfullt antagonistiska mot MYC-vägar för att stoppa proliferationen så att skadade celler kan repareras; irreparabla celler genomgår självdestruktion genom irreversibel apoptos för att skydda integriteten hos hela organismen43. Eftersom p53-knockout (KO)-möss har en normal utveckling och är inte förstorade50 visar detta att apoptosvägarna inte är de dominerande mekanismerna som lineage-progenitorerna använder för att avsluta exponentiell proliferation. Möss som uppvisar dubbel KO av Trp53 och Phosphatase and tensin homolog (Pten) utvecklar således gliomtumörer genom att de inte lyckas motverka MYC, men denna fenotyp observeras endast i Trp53 och Pten dubbel knockout45,46. I PDAC är den vanligaste genmutationen KRAS (~92 %). GEMM där muterad KRAS (KC-möss) uttrycks i pankreasceller utvecklar PDAC i 30-40 % av fallen vid ~8-12 månaders ålder51. Genom att lägga till muterad Trp53 till ovanstående GEMM (KPC-möss) ökar PDAC-penetransparensen och minskar överlevnaden till ~5 månader, medan KC-möss med Ink4a-deletion överlever i ~2-3 månader52,53. Möss med enbart mutant Trp53 utan mutant Kras utvecklar inte PDAC53. I musmodeller för äggstockscancer har det däremot visats att inaktivering av Trp53 resulterar i invasiva tumörer, men tumörutvecklingen påskyndas hos möss med samtidig inaktivering av Brca1 och Trp5354.

TP53 och CDKN2A är ofta bi-alleliskt inaktiverade i alla maligniteter hos människor (fig. 2a). Sådan inaktivering har stor inverkan på behandlingen7. För att avsluta malign proliferation syftar konventionella kemoterapeutika till att uppreglera p53/p16 genom att inducera cytotoxisk stress som efterliknar fysiologiska aktivatorer av denna väg55. Eftersom maligna celler och normala celler existerar i samma miljö har en sådan behandling ett ogynnsamt terapeutiskt index, eftersom dessa gener är muterade/fysiskt otillgängliga i maligna celler, men intakta i normala celler. Flera metoder för att återaktivera apoptos i cancerbehandling har undersökts, men det har varit svårt att lösa denna grundläggande fråga om terapeutiskt index56. Framsteg inom genomisk teknik visar att när TP53/CDKN2A-gener är vildtyp, som i testikelcancer, ger behandling med cytotoxisk kemoterapi (t.ex. cisplatin) kompletta svar som ökar den totala och sjukdomsfria överlevnaden57 (fig. 2a och b). Maligniteter med hög grad av TP53/CDKN2A-inaktivering uppvisar inte dessa reaktioner, vilket leder till resistens mot flera apoptosbaserade behandlingar (bred kemoresistens och radioresistens) (fig. 2a, b, e, f)7. Även olika tumörtyper med ursprung i samma organ reagerar bättre på behandling om apoptosgenerna är intakta. Till exempel förekommer TP53- och CDKN2A-mutationer i ~70 respektive 90 % av PDAC58 (fig. 2a). Den totala femårsöverlevnaden vid PDAC är ~9 % även om man inkluderar patienter som behandlas med kemoterapi eller kombinationsbehandlingar och/eller kirurgi59,60. Pankreatiska neuroendokrina tumörer (PNET) däremot har i allmänhet inte TP53-mutationer, uppvisar endast minimala deletioner av CDKN2A61 och har en femårsöverlevnad på >50 % när de behandlas med apoptosinducerande terapi62. På samma sätt uppvisar glioblastoma multiform (GBM) en mängd olika kliniska, histopatologiska och molekylära egenskaper och har TP53-mutationer i ~30 % av de primära fallen och ~65 % av de sekundära GBM63,64. Gliomceller med WT TP53 är känsliga för cytotoxisk stress som induceras av kliniskt tillgängliga kemoterapeutiska medel jämfört med celler med transkriptionellt tystade muterade TP5365,66,67. I den Trp53-inducerade musmodellen för PDAC (KPC) gör dessutom genetisk inaktivering av en allel av Myc den terapeutiska responsen känslig för gemcitabin40. Vi analyserade därför genomiska data genom att jämföra de tio bästa maligniteterna med en förhöjd frekvens av TP53/CDKN2A-förändringar (TP53/CDKN2A-high) med de tio nedersta maligniteterna med lågfrekventa TP53/CDKN2A-förändringar (TP53/CDKN2A-low) (fig. 2b, c). Vi fann att 7/10 av TP53/CDKN2A-high cancerformerna hade en minskad sjukdomsfri och total överlevnad när dessa gener muterades (Fig. 2b; Tabell S1) (p-värden < 0,05). Konsekvent fanns det även i TP53/CDKN2A-låg fall en minskning av den sjukdomsfria och totala överlevnaden när dessa gener förändrades (p-värden < 0,05) (fig. 2c; tabell S1). Således är graden av förändringar i apoptosgener lägre i botbara maligniteter (testikelcancer/pediatrisk ALL) jämfört med högrefraktära/behandlingsresistenta cancerformer (PDAC/HCC) (fig. 2g). Under fysiologisk mognad inducerar WT TP53 irreversibel apoptos av ohälsosamma celler för att bevara hela organismens integritet (fig. 2h). Däremot muterar onkogen utveckling mediatorer för apoptos vilket leder till resistens mot apoptosinduktion (fig. 2h).

Genetiska och epigenetiska förändringar av differentieringsgener i cancer

De mest aggressiva mänskliga maligniteterna är dåligt differentierade13. Medan differentiering bidrar till dålig överlevnad vid flera olika maligniteter hos människor är de mekanismer som ligger till grund för differentieringshinder i maligna celler oftast oklara, men ny kunskap håller på att växa fram5,6,7. Vi identifierade viktiga lineage master TFs för utvecklingen av äggstocken, bukspottkörteln och levern med hjälp av publicerade studier av lineage conversion eller studier med transgena musmodeller6,68,69,70,71,72,73,74 (tabell 1). Programmen för celldifferentiering och linjetillhörighet dikteras av denna handfull master TFs och deras kofaktorer. Även om flera kofaktorer har viktiga roller är de viktigaste av dessa transkriptionella koaktivatorer och corepressorer som använder ATP för att remodellera kromatin för att slå på eller stänga av målgener33,34,75. Följaktligen analyserade vi de genetiska förändringarna i lineage TFs, deras koaktivatorer och corepressorer i OVC, PDAC och HCC (tabell 1).

Då maligna celler inte helt kan undertrycka differentiering, eftersom det är ett kontinuum längs vilket alla celler existerar, inaktiveras master TFs som specificerar engagemanget i olika lineage nästan aldrig helt och hållet genom mutationer, utan är ofta haploinsufficienta (fig. 3a; tabell 1). Denna dosreduktion är tillräcklig för att stoppa framstegen längs differentieringskontinuumet vid dess mest proliferativa punkter5,6,7. Till exempel var FOXL1-förlust vanligt förekommande i OVC (fig. 3a), och frekvensen av FOXL1-förlust var högst i dåligt differentierade OVC (fig. 3b). Detta mönster var liknande för GATA4 i PDAC och HCC, även om dessa maligniteter hade ett litet antal patienter som överlevde bortom stadierna I och II (fig. 3b, c). Vi identifierade viktiga interaktionspartners som är koaktivatorer och corepressorer för olika linjespecifika TFs (tabell 1) genom litteraturanalys och data som deponerats i UniProt-databasen (http://www.uniprot.org/). För att förstärka den avstannade differentieringen hittades koaktivatorerna ofta inaktiverade och borttagna (tabell 1; fig. 4a), vilket gynnar repression av nedströmsgener som är måltavlor för viktiga TFs. Nya bevis tyder nu på att sådana förändringar försämrar de vägar som medierar terminal differentiering6,7,76. Tidiga upptäckter av funktionerna hos dessa koaktivatorenzymer visade att deras roll i fysiologin var att använda ATP för att mobilisera histon-DNA-interaktioner så att naket DNA exponerades, vilket gjorde det möjligt för TF att binda till och aktivera målgener33,34,75,77. Denna process är bevarad i evolutionen från jäst78, en av de enklaste metazoerna, till homo sapiens77. Inaktivering av dessa gener i cancer kan vara ett försök att försämra koaktivatorernas förmåga att exponera DNA för master TFs som aktiverar nedströmsgener. En viktig ledtråd till denna hypotes är att de master-TF:erna för linjefördelningen är selektiva när det gäller användningen av specifika koaktivatorer för att förmedla aktivering av linjefördelningsgener (tabell 1). En annan ledtråd är att maligna celler tenderar att förlora en allel av linjespecificerande TFs, en händelse som kan vara tillräcklig för att möjliggöra linjebindning men otillräcklig för terminal differentiering6,7 (fig. 3a; tabell 1). Till exempel kräver leverprogenitorer samarbete mellan GATA4 och FOXA1 för att rekrytera koaktivatorer (t.ex. ARID1A) och förmedla aktivering av hepatocytdifferentieringsgener. I HCC är heterozygot förlust av GATA4 vanligt förekommande (68 %, n = 366, fig. 3a; tabell 1) och inaktiverande mutationer i ARID1A vanliga (44 %, n = 366, fig. 4a; tabell 1)6. Leverdifferentieringen är nedsatt och proliferationen förstärkt i lever med Gata4- eller Arid1a-leverbetingad haploinsufficiens6,76,79. Dessutom aktiverar återinförande av GATA4 i GATA4-bristfällig HCC, eller ARID1A i ARID1A-muterad men GATA4-intakt HCC, hundratals gener för hepatocytepitel-differentiering6. De viktigaste TF:erna i bukspottkörtelns könslinje är GATA4 och GATA680,81. Kopieringsförluster av en allel av dessa faktorer ses i PDAC, och funktionsförlustmutationer i koaktivatorer har också observerats (tabell 1; figurerna 3a och 4a). PDAC uppvisade dock också en hög förekomst av amplifiering eller förstärkning av GATA4 och GATA6, vilket tyder på att dessa TF:er i vissa fall kan ge en tillväxtfördel till cancerceller i bukspottkörteln. I OVC förloras ofta en allel av de ovariala master TFs FOXL182,83 (80 %, fig. 3a; tabell 1 n = 316), medan koaktivatorer, t.ex. ARID3A och ARID3B, ofta är inaktiverade (tabell 1; fig. 4a). I kärnan av malign omvandling ökar alltså differentieringshindret rutinmässigt den maligna spridningen och uppnås genom haploinsufficiens av master TFs och inaktivering av de koaktivatorer som de använder. Denna förståelse skulle kunna leda till behandlingar som syftar till att återaktivera framåtriktad differentiering, som ett alternativ till apoptos, som ett sätt att avsluta malign proliferation.

Corepressorenzymer: nya mål för differentieringsåterställande onkoterapi

En enhanceosom består av multiproteinkomplex som samarbetar för att aktivera gener av en viss härstamning84,85, t.ex, hepatiska enhanceosomer aktiverar hepatocytgener6, medan pankreas- och ovarieförbättringsosomer aktiverar pankreas86 respektive ovariegener87. Genetisk störning av detta samarbete kan förskjuta innehållet i dessa proteinhubbar bort från koaktivatorer till corepressorer som i stället undertrycker könsgener76,88,89. Sådan repression möjliggörs ytterligare av den inneboende slutna kromatinstatusen hos terminal-differentieringsgener, vilket står i kontrast till det inneboende öppna kromatinet hos proliferations- och tidig-differentieringsgener6,7,90.

För att exponentiell proliferation ska kunna ske frikopplat från framåtriktad differentiering krävs en hög grad av corepressor-aktivitet för epigenetisk tystning av linjerings-differentieringsgener. Följaktligen observeras ofta avvikande corepressoraktivitet i maligna celler, där hundratals terminala differentieringsgener har en ackumulering av aktiva corepressorer6,89. Till skillnad från koaktivatorer, som ofta inaktiveras genom genetiska mutationer/deletioner6, är corepressorer ofta antingen vildtyp eller amplifierade i maligna celler (tabell 1; fig. 4b). DNA-metyltransferas 1-enzym (DNMT1) är en corepressor för master TF och även det underhållsmetyltransferas som rekapitulerar CpG-metylering på den nysyntetiserade DNA-strängen när cellerna genomgår delningscykler91,92,93. I TCGA PANCAN-data är höga nivåer av DNMT1 associerade med dålig överlevnad (p < 0,00001, n = 5145), jämfört med fall med låga DNMT1-nivåer (n = 5199) (fig. 5a). Detta tyder på en viktig roll för detta enzym i många mänskliga cancerformer. Därför har flera studier utvecklats under det senaste decenniet där man har försökt utveckla terapeutiska interventioner som är inriktade på DNMT1 i cancerterapi94,95,96,97,98,99,100,101,102. Ubiquitin-like, containing PHD and RING finger domains, 1, (UHRF1), samarbetar nära med DNMT1 vid reglering av DNA-metylering103,104. Vi analyserade UHRF1:s uttrycksnivåer i PANCAN-dataset och fann att höga UHRF1-uttrycksnivåer (p < 0,0001, n = 5150) starkt förutsade dålig överlevnad jämfört med låga nivåer (n = 5189) (fig. 5b), vilket illustrerar betydelsen av dessa metyleringsgener i mänsklig cancer.

DNMT1-depletion utan cytotoxicitet har terapeutiska fördelar även vid myelodysplastiskt syndrom (MDS) och akut myeloisk leukemi (AML) som innehåller defekter i p53-systemet102,105, och flera kliniska prövningar pågår för att utvärdera DNMT1-depletion mer allmänt i cancerbehandling (även om decitabin och 5-azacytidin som används för att depletera DNMT1 har farmakologiska begränsningar som kan undergräva deras förmåga att depletera-DNMT1 från solida tumörer) (tabell 2). Vid akut promyelocytisk leukemi (APL) uppnås fullständiga remissioner genom en kombination av arsenik med retinsyra för att hämma corepressorer som rekryteras på leukemifusionsproteinet PML-RARA106,107. Eftersom co-repressorer inte är muterade och har avvikande aktivitet i cancer är de tillräckliga och logiska molekylära mål som kan engagera terminala differentieringsgener för p53-cellcykelutgångar7,89,99,100,102,105,108,109,110,111 (tabell 2; fig. 5c, d).

Flera andra corepressorer har också undersökts som potentiella molekylära mål för epigenetisk behandling av cancer. Exempelvis är histondeacetylasenzymer (HDAC) viktiga corepressorer som rekryteras till TF-hubbar i många mänskliga maligniteter och är kända epigenetiska suppressorer av genuttryck5,6,88,89. I många prekliniska studier har HDAC-enzymer undersökts som potentiella inducerare av celldifferentiering94,95. Ett problem med att rikta in sig på HDACs är dock deras pleiotropa cellulära funktioner – även on-target-aktivitet kan således ge oavsiktliga bieffekter. Andra vanliga corepressorer som uppregleras i många mänskliga maligniteter är lysin-demetylasenzymer som KDM1A (fig. 4b). Olika studier har visat att differentiering induceras genom farmakologisk inriktning av KDM1A och relaterade kliniska prövningar pågår för närvarande112,113,114,115,116. Med hjälp av en in vivo-screening av pan-cancer med hög genomströmning visade Carugo et al. nyligen en koppling mellan corepressorn WDR5 och en hållbar MYC-medierad proliferation av PDAC117. Att störa WDR5 genom inhiberingsanalyser ledde till stoppad tumörprogress och ökad överlevnad i PDX-musmodeller av PDAC117. I denna systematiska översikt har vi dokumenterat ytterligare corepressorer som rekryterats till master TF-hubbarna i många mänskliga maligniteter som kräver ytterligare genetisk och farmakologisk validering som kandidatmolekylära mål som ökar differentieringen. Dessa inkluderar HES1, BAZ1A/B, BAZ2A, EED, SUZ12 och UHRF1 (fig. 4b, 5b; tabell 1). Dessutom fann man att uppreglering av dessa corepressorer var kopplad till avancerade kliniska patologiska stadier, vilket tyder på en direkt effekt på differentieringsundertryckning. HES1 var till exempel den mest frekvent uppreglerade corepressorn i OVC (fig. 4b), och OVC i stadium III och IV hade högre HES1-vinster jämfört med stadium I och II (fig. 4c). Således kan HES1-hämningsbehandling vara avgörande för differentieringsbehandling av OVC. Detta mönster sågs också för BAZ1B i PDAC och KDM1B i HCC (fig. 4b, d, e). Dessa observationer tyder på att i dessa maligniteter kan inriktning på dessa nyckelenzymer för differentieringsinduktion ge ytterligare terapeutiska strategier som kringgår defekter i p53-systemet.