2.19.2.3.3.3 Elutionsförhållanden

Effektiva elutionslösningar bör helst störa interaktionerna mellan analyt och antikropp utan att påverka de immobiliserade Abs negativt. En förskjutare är en högkoncentrerad korsreagerande molekyl som kan framkalla en biospecifik desorption. Förskjutningsmolekylerna konkurrerar med de bundna analytmolekylerna, och det stora överskottet av förskjutningsmolekyler säkerställer en kvantitativ desorption av analyten. För att förskjutningsmedlet ska fungera optimalt måste det uppfylla flera kriterier: (1) hög korsreaktivitet med de immobiliserade antikropparna, (2) en retentionstid som skiljer sig avsevärt från analyternas, eftersom det stora överskottet orsakar en framträdande topp som lätt kan störa detektionen av analyterna, (3) god stabilitet och hög renhet, eftersom föroreningar i så låga halter som 0,01-0,1 % kan störa kromatogrammet, och (4) lågt pris, icke-toxiska egenskaper, avsaknad av riktiga prover och låg detekterbarhet i jämförelse med analyterna. Dessutom krävs en stor volym elueringslösning, vilket innebär att rekoncentrationen måste ske på ett klassiskt SPE-stöd före analysen. Följaktligen föredras elueringsförhållanden som möjliggör fullständig återvinning av målanalyten med en liten elueringsvolym.

Chaotropa joner används vanligen för eluering av stora molekyler, t.ex. proteiner. Dessa joner stör vattenstrukturen runt stora molekyler, dvs. antikroppar och målmolekyler, vilket leder till att de hydrofoba interaktionerna i stora molekylstrukturer och mellan analyten och antikroppen bryts. De vanligaste chaotropa jonerna är klorid-, jodid-, perklorat- och tiocyanatjoner i koncentrationer mellan 1,5 och 8 mol l-1. De olika vattenlösningar som framgångsrikt kan användas för desorption av proteiner från IS har dock visat sig vara oförmögna att desorbera små molekyler. Desorptionen av proteinet är förmodligen huvudsakligen baserad på förändringar i det bundna proteinets struktur (partiell denaturering) och inte på förändringar i strukturen hos de immobiliserade antikropparna. Därför krävs mycket strängare villkor för eluering av små molekyler, som inte är känsliga för denaturering. Med en temperaturökning från 4 till 43 °C kan dessutom dissociationskonstanten för interaktioner mellan antikroppar och analyter öka med två storleksordningar. Denna metod är inte tillräckligt effektiv för att användas för eluering av små molekyler. Elution med lösningar med lågt pH utförs ofta för att desorbera små molekyler från IS, men det krävs tre pH-enheter från antikroppens isoelektriska punkt. Med denna typ av eluering (förskjutning av pH utan att ändra jonstyrkan) undviker man att skada labila antikroppar. En olägenhet är att det fortfarande krävs stora volymer för fullständig desorption, vilket minskar de anrikningsfaktorer som är förknippade med extraktionsförfarandena.

En effektiv eluering av små molekyler från en IS kan åstadkommas med en minskad volym av en blandning av vatten och organiskt modifieringsmedel. Som exempel visar figur 6 elueringsprofilen för två herbicider, isoproturon och atrazin, efter perkolation av ett vattenprov som är spetsat med varje analyt på motsvarande IS. Flera lösningsmedel för eluering (metanol, etanol och ACN) blandade med vatten utvärderades.

Figur 6. Elutionsprofiler för atrazin, isoproturon, 2,4,6-triklorfenol och pentaklorfenol från motsvarande IS med hjälp av elutionslösningar som innehåller ökande mängder av ett organiskt lösningsmedel i försurat eller icke försurat vatten efter perkolation av vattenprover som är spetsade med varje analyt. ACN: acetonitril; MeOH: metanol; EtOH: etanol; AA: ättiksyra; TFA: trifluoroättiksyra.

De resulterande elueringsprofilerna är starkt beroende av lösningsmedlets karaktär. De tre testade lösningsmedlen möjliggör fullständig eluering av båda analyterna. ACN uppvisar dock den högsta elutionsstyrkan: den lägsta halten av detta lösningsmedel ger fullständig eluering av båda analyterna. En ACN-halt på 40 % och 60 % är tillräcklig för att återvinna isoproturon respektive atrazin, medan 60 % och 80 % metanol krävs. I detta fall verkar lösningsmedlets elutionsstyrka vara relaterad till dess hydrofoba karaktär, eftersom ACN (Hildebrand-löslighetsparameter δ = 24,3 MPa1/2) är mindre polärt än etanol (δ = 26,0 MPa1/2) och metanol (δ = 29,7 MPa1/2). Dessa resultat tycks tyda på att interaktionerna mellan herbiciderna och motsvarande antikroppar i första hand är hydrofoba till sin natur. Närvaron av opolära lösningsmedel minskar den hydrofoba bindningskomponenten i interaktionen mellan antikropp och analyt. Det påverkar dock också stabiliteten hos de hydrofoba bindningarna, vilket bibehåller antikroppens tertiärstruktur, och resulterar i att antigenet frigörs. Dessa exempel på eluering av atrazin eller isoproturon från motsvarande IS visar att en effektiv eluering erhålls genom att direkt tillsätta en stor mängd metanol eller ACN, 70-80 %, i elueringsfraktionen. Denna stora mängd organiska modifieringsmedel gör det möjligt att minska volymen av elutionsfraktionen så mycket som möjligt, vilket gör det möjligt att koncentrera analyten i eluatet. Man måste se till att valet av bindningsmetod är förenligt med dessa elutionsförhållanden. Användningen av icke-kovalent bindning förhindrar möjligheten att applicera en så stor mängd modifieringsmedel utan att riskera att störa bindningen mellan antikroppar och sorbent. Användningen av en sol-gel-process för immobilisering av antikroppar begränsar också möjligheten att använda en stor mängd organiskt lösningsmedel. Det har visats att en stor mängd organiska modifieringsmedel, t.ex. antikroppar, orsakar urlakning av antikroppar från sol-gelmatrisen.8

En kombination av organiskt lösningsmedel och organisk syra är ibland nödvändig. I figur 6 visas också elueringsprofilen för 2,4,6-triklorfenol och pentaklorfenol från en anti-pentaklorfenol IS med hjälp av en hydroorganisk blandning med och utan tillsats av en syra till elueringslösningen. Triklorfenol kunde återvinnas fullständigt med hjälp av antingen vatten/ACN (20:80, v/v) eller vatten/ACN (30:70, v/v) som surgjorts vid pH 3 med hjälp av trifluoroättiksyra (TFA). När försurning uppnåddes med 1 % (v/v) ättiksyra (AA) var en blandning innehållande endast 30 % ACN effektiv för eluering. Däremot var det omöjligt att eluera pentaklorfenol, som har en högre affinitet för PAbs än triklorfenol, med ren ACN eller ACN försurad med TFA. Desorptionen kunde endast uppnås med vatten/ACN 20:80 (v/v) innehållande 1 % AA (v/v).

I de flesta off-line-förfaranden, inklusive de som rekommenderas med hjälp av kommersiella IS för engångsbruk, uppnås därför desorptionen med en hög procentandel av ett organiskt lösningsmedel, ibland vid lågt pH.

Slutsatsen är att valet av elueringsbetingelser först och främst beror på affiniteten mellan antikropparna och analyterna. Det beror också på analytens karaktär, på grund av förhållandet mellan elektroniska och hydrofoba interaktioner som är involverade i interaktionerna mellan antigen och antikroppar. Slutligen beror det på strategin för immobilisering av antikropparna; icke-kovalent bindning förhindrar användningen av stora mängder organiska lösningsmedel.