Abstract
Det beskrivs hur en kvantitativ modell för fenylalaninmetabolism hos människor har tagits fram. Modellen baseras på de kinetiska egenskaperna hos rent rekombinant humant fenylalaninhydroxylas och på uppskattningar av hastigheterna in vivo för fenylalanintransaminering och proteinnedbrytning. Beräknade värden för steady-state-koncentrationen av fenylalanin i blodet, hastigheten för clearance av fenylalanin från blodet efter en oral belastning av aminosyran och toleransen för fenylalanin i kosten stämmer alla väl överens med data från såväl normala som fenylketonuriska patienter och obligatoriska heterozygoter. Dessa beräknade värden kan vara till hjälp vid beslut om vilken grad av begränsning av fenylalaninintaget som är nödvändig för att uppnå ett tillfredsställande kliniskt resultat hos klassiska patienter och hos patienter med mildare former av sjukdomen.
Det inledande och hastighetsbegränsande steget i den kompletta katabolismen av fenylalanin till CO2 och vatten är dess hydroxylering till tyrosin, en reaktion som katalyseras av fenylalaninhydroxyleringssystemet. Systemet är komplext och består av fenylalaninhydroxylas (PAH), pterinkoenzymet tetrahydrobiopterin (BH4) och flera enzymer som tjänar till att regenerera BH4, dvs, dihydropteridinreduktas och pterin-4α-karbinolamin-dehydratas (1, 2).
Och även om fenylalanins bensenring inte kan brytas utan att först hydroxyleras i para-positionen, kan aminosyrans alanin-sidekedja metaboliseras även i avsaknad av ringhydroxyleringssteget. Denna alternativa väg inleds genom transaminering av fenylalanin till fenylpyruvat följt av omvandling av den senare föreningen till metaboliter som fenyllaktat, fenylacetat och o-hydroxifenylacetat. Produkterna från transaminasvägen utsöndras i urinen. Stegen i dessa alternativa vägar för fenylalaninmetabolism beskrivs i figur 1.
Inledningsvis bör det noteras att ett tidigare försök att genomföra en sådan analys handikappades av bristen på uppgifter om de kinetiska egenskaperna hos mänskligt PAH och mänskligt fenylalanintransaminas. När det gäller det sistnämnda enzymet visste man inte ens med säkerhet vem som är ansvarig för aktiviteten in vivo. Eftersom in vitro-bevisen visade att fenylalanin är ett utmärkt substrat för mitokondriellt aspartataminotransferas antogs det att detta är det transaminas som är inblandat. Eftersom egenskaperna hos den mänskliga motsvarigheten inte var kända användes dessutom de kinetiska egenskaperna hos motsvarande råttenzym (12). Hur problemet med det mänskliga transaminaset hanterades i den aktuella analysen kommer att diskuteras nedan.
Kinetiska egenskaper hos rekombinant humant PAH finns nu tillgängliga (16, 17). PAH:s kinetik är något komplicerad av det faktum att fenylalanin inte bara fungerar som substrat för enzymet utan även som en aktivator (se ref. 1 och referenser där). Eftersom en tidigare analys av PAH:s kinetiska beteende baserad på en tvåsidig modell med ordnad bindning av fenylalanin vid både en katalytisk plats och en regulatorisk plats kunde redogöra på ett adekvat sätt för många märkliga aspekter av enzymets kinetiska beteende (18), användes en liknande tvåsidig, ordnad bindningsmodell i den nuvarande analysen. Den faktiska hastighetsekvation som användes (19) visas i ekv. 2, där Km är den koncentration av fenylalanin som ger halva maximala hastigheten och Ka är den koncentration av fenylalanin som ger halva maximala aktiveringen i ett experiment där PAH preinkuberades med varierande koncentrationer av fenylalanin. För denna analys användes följande kinetiska konstanter som bestämts med ren rekombinant human PAH vid 37 °C med BH4 som koenzym: Km för fenylalanin, 0,51 mM, och Ka för fenylalanin som aktivator, 0,54 mM (D. Kowlessur och S.K., opublicerade uppgifter). Ett ungefärligt värde på Vmax för mänsklig PAH (16) (troligen en underskattning) beräknades från den initiala minskningshastigheten för serumfenylalaninnivåerna (0,9 μmol/ml per h) hos kontrollpersoner efter att de hade fått en oral belastning av l-p-fenylalanin som var tillräcklig för att öka deras serumfenylalaninnivåer med ≈17-faldigt (20). 
2 Såsom anges ovan förbigicks det tidigare problemet med identiteten av det enzym hos människan som är ansvarigt för fenylalanintransaminering i den aktuella analysen. Det antogs att den viktigaste vägen för nettouttaget av fenylalanin hos klassiska PKU-patienter är via transaminering. Som redan nämnts är t.ex. urinutsöndringen av fenylalanin endast ≈11 % av den mängd som transamineras, och i slutet av det första levnadsåret kan man uppskatta att den mängd fenylalanin som bortskaffas genom inkorporering i protein endast är ≈25 % av den mängd som bortskaffas genom transaminering. Det bör noteras att med den nuvarande metoden för att uppskatta hastigheten för fenylalanintransaminas, som är baserad på hastigheten för clearance av fenylalanin från blodet, inkluderas mindre reaktioner för bortskaffande av fenylalanin, t.ex. urinutsöndring och inkorporering i protein, i uppskattningen av transaminasaktiviteten, vilket resulterar i en liten överskattning av denna aktivitet.
För att kunna vara användbar i den nuvarande analysen behövs värden för Km och Vmax för transaminaset. Försök gjordes att extrahera ett Km-värde för fenylalanintransaminering från resultaten av fenylalaninbelastningstester som utförts på klassiska PKU-patienter (21). Det tillvägagångssätt som användes för att uppskatta ett värde för Vmax för det mänskliga transaminationsenzymet var att använda uppgifter om summan av alla metaboliter som härrör från transaminering (dvs. fenylpyruvat, fenylyllaktat och o-hydroxifenylacetat) som utsöndras av en grupp klassiska PKU-patienter som en funktion av deras fenylalaninnivåer i plasma. Den maximala mängden som utsöndrades, uttryckt som mmol/mol kreatinin, var 1 370, en nivå som verkade plana vid plasmafenylalaninnivåer mellan 1 200 och 2 400 μmol/liter (22).
Försök att omvandla detta värde till en transaminationshastighet försvåras av det breda åldersspannet, ≈2 år till ≈18 år, i det patientprov som användes i studien. För denna analys antogs att patienternas genomsnittliga kroppsvikt var 50 kg och att den dagliga kreatininutsöndringen var 2 g/24 h (23). Ytterligare ett antagande gjordes att utsöndringen av metaboliter som härrör från transaminaser sker med linjär hastighet under 24 timmar och återspeglar bildningshastigheten för dessa metaboliter. Det antogs också att dessa föreningar balanserar med alla kroppsvätskekomponenter utom tät broskbindvävnad och ben, som tillsammans utgör 15 % av det totala kroppsvattnet (24), vilket ger en fördelningsvolym för tillgängligt vatten på 500 ml/kg kroppsvikt. På grundval av dessa antaganden beräknades den maximala transaminationshastigheten till 0,043 μmol/ml per timme.
En ytterligare produkt från fenylalaninmetabolismen som åtminstone delvis härstammar från fenylpyruvat och som inte mättes i Langenbecks et al. studie (22) är fenylacetylglutamin (PAG). Det finns belägg för att PAG kan bildas från fenylacetat, som härrör från fenylpyruvat genom oxidativ dekarboxylering (25). Det har också föreslagits att fenylacetat och därmed PAG kan bildas från fenylalanin genom en väg som inte inbegriper transaminering, utan i stället inbegriper dekarboxylering till fenyletylamin följt av oxidation av aminen till fenylacetat (26). Upptäckten att den mängd fenyletylamin som utsöndras hos PKU-patienter är liten även efter att oxidationen av aminen blockerats genom administrering av en hämmare av aminoxidas (27) tyder dock på att, som tidigare diskuterats (12), dekarboxylering av fenylalanin är en kvantitativt sett mindre viktig väg för fenylalaninmetabolismen, liksom för bildandet av PAG.
Mängden PAG som utsöndras av normala individer är 250-500 mg/dag; PKU-patienter utsöndrar dubbelt så mycket (28). För att beräkna den mängd PAG som bildas via transaminasvägen gjordes det konservativa antagandet att endast den ”extra” mängd som patienterna utsöndrar härrör från fenylpyruvat. Om man antar att den genomsnittliga extra mängden PAG som utsöndras är 350 mg/dag och gör samma antaganden som beskrivs ovan, innebär denna utsöndring en bildningshastighet för PAG på 0,020 μmol/ml per timme, vilket innebär att bildningshastigheten för alla transaminerade produkter uppgår till 0,063 μmol/ml per timme.
Med användning av detta värde för Vmax användes resultaten av det fenylalaninbelastningstest som utförts på klassiska PKU-patienter (21) för att beräkna ett värde på 1.37 ± 0,14 mM (medelvärde ± SD, n = 3) för Km för fenylalanintransaminas.
Då PAH- och transaminasaktiviteterna i den aktuella analysen beräknas som en funktion av fenylalaninnivåerna i blodet är det viktigt att dessa nivåer återspeglar vävnadsnivåerna av aminosyran. I detta sammanhang har fenylalaninnivåerna i levervävnad från en PKU-patient (29) och i lever- och njurvävnad från hyperfenylalanemiska råttor (30) rapporterats vara jämförbara med motsvarande nivåer i blodet.
Den tredje termen i ekv. 2, nettoproteinnedbrytningshastigheten, uppskattades utifrån data från Waterlow och Jackson (31), som visar att i fastande tillstånd, det tillstånd under vilket fenylalaninbelastningstestet utförs, netto proteinnedbrytning (dvs, mängden nedbrutet protein minus den syntetiserade mängden) är lika med 0,30 g/kg kroppsvikt per 12 timmar. Eftersom skelettmuskulaturen utgör ≈40 % av kroppsmassan (24) och proteinkatabolismen i denna vävnad spelar en viktig roll för leveransen av aminosyror till periferin, togs proteinnedbrytningen i skelettmuskulaturen som den dominerande händelsen i den proteinnedbrytning som sker under fasta.
Mänsklig skelettmuskulatur innehåller ≈46 μmol fenylalanin/g vävnad (32). På grundval av detta värde och konstaterandet att muskeln hos vuxna människor innehåller 19,8 % protein (33) kan man uppskatta att muskeln innehåller 232 μmol fenylalanin/g muskelprotein. Om detta värde tas som representativt för kroppens proteinlager skulle det indikera att ≈70 μmol fenylalanin/kg kroppsvikt per 12 h skulle frigöras under fastan. På grundval av samma antaganden som de som gjordes ovan vid uppskattningen av fenylalanintransamineringens hastighet skulle det sistnämnda värdet översättas till en nettoproteinnedbrytningshastighet per timme (och frisättning av fenylalanin från denna process) på 0,012 μmol/ml per timme. Eftersom substratet för denna reaktion, dvs. kroppens proteinförråd, troligen skulle förbli relativt konstant under en kort fastandeperiod, antogs proteinnedbrytningen följa en kinetik av nollordning.
Substituerar man de uppskattade värdena för de kinetiska konstanterna för de tre reaktioner som visas i ekv. 1 får man ekv. 3: 
3
RESULTAT OCH DISKUSSION
Den generella giltigheten av ekv. 3 kan bedömas på flera sätt. För det första, med användning av uttrycket för hastigheten för den PAH-katalyserade reaktionen, inklusive de kinetiska konstanter som visas i ekvationen, beräknades basalhastigheten för hydroxyleringsreaktionen till 0,010 μmol/ml per h. Detta värde stämmer väl överens med följande rapporterade värden för normala försökspersoner på grundval av experiment där försökspersoner infunderades med l-phenylalanin: 0,013 μmol/ml per h; 0,008 μmol/ml per h (34); 0,012 μmol/ml per h (5); 0,010 μmol/ml per h (6). Ett värde på 0,020 μmol/ml per h hittades i den senaste studien när försökspersonerna fick en infusion av l-phenylalanin (6). De angivna in vivo-värdena för omvandlingen av fenylalanin till tyrosin rapporterades alla som μmol/h per kg. De räknades om till μmol/ml per timme på grundval av samma antaganden som tidigare använts, dvs. att volymfördelningen av metaboliter som fenylalanin är 500 ml/kg kroppsvikt. Dessa resultat visar att den beräknade hastigheten för hydroxylering av fenylalanin stämmer väl överens med de experimentellt bestämda hastigheterna.
Ett annat test av modellens giltighet är att beräkna steady-state-nivån av fenylalanin i blodet för både kontrollpersoner och PKU-heterozygoter som antas ha 50 % av den normala PAH-aktiviteten, samt t1/2 för clearance av en belastning av fenylalanin (dvs, den tid som krävs för att den ursprungliga koncentrationen av fenylalanin ska minska till hälften av sitt ursprungliga värde) från blodet för dessa två grupper. Fenylalaninnivån i steady-state för kontroller, beräknad enligt ekv. 3 (genom att sätta termen ”-dPhe/dt” lika med noll och beräkna fenylalaninkoncentrationen), är 0,059 mM och för försökspersoner med 50 % kvarvarande PAH-aktivitet är den 0,079 mM, vilket är 1,34 gånger högre än kontrollnivån. Även om värdet 0,059 mM för normala försökspersoner stämmer väl överens med det accepterade värdet 0,058 ± 0,015 mM (medelvärde och SD) (35), förefaller värdet 0,079 mM för heterozygoter, som kan förväntas ha 50 % av den normala PAH-nivån, vara för lågt. Förhållandet mellan fenylalaninnivåerna i blodet för kontroller och för obligatoriska PKU-heterozygoter har rapporterats ligga i intervallet 1,57-1,61 (36-38) snarare än förhållandet 1,34 som förutspåddes av modellen.
Detta beräknade värde ger upphov till möjligheten att PKU-heterozygoter kan ha mindre än 50 % av kontrollens PAH-aktivitet. Genom att ersätta ett värde på 40 % av kontrollens PAH-aktivitet för heterozygoter i ekv. 3 får man en steady-state fenylalaninkoncentration på 0,093 mM; med användning av detta värde och värdet på 0,058 mM för kontrollerna får man en kvot på 1,60, vilket ligger nära det intervall som rapporterats för heterozygoter och kontroller (se ovan). I detta avseende bör det noteras att den kvarvarande PAH-aktiviteten i leverbiopsiprover som hittades för sex HPA-obligatoriska heterozygoter varierade mellan 5,8 och 31 % av kontrollvärdena (39). Dessa resultat gav den första indikationen på att HPA-heterozygoter har betydligt mindre än 50 % av kontrollaktiviteten. Två efterföljande större studier av föräldrar till patienter med PKU överensstämde med dessa tidigare resultat: en studie rapporterade ett medelvärde på 29,3 % av kontrollerna (n = 9) (40) och en annan ett medelvärde på 28,1 % (n = 8) (41).
Modellen förutspår också t1/2-värden för clearance av fenylalanin från blodet för både normala personer och heterozygoter som överensstämmer med faktiska kliniska resultat. För normala personer erhålls ett värde på 65 min, vilket är lägre än det rapporterade medelvärdet på 89 min men väl inom intervallet 60-120 min (10). För heterozygoter med 50 och 40 % kvarvarande PAH-aktivitet är t1/2-värdena beräknade från Eq. 3 144 respektive 180 min, jämfört med ett rapporterat medelvärde på 159 min .
Hänvisning har tidigare gjorts till en rapport om två HPA-patienter vars oförmåga att metabolisera fenylalanin tycktes vara ett resultat av en brist på transaminas (11) och till de bevis som talar emot denna slutsats (12). Den aktuella modellen ger ytterligare en anledning att betrakta detta påstående med skepsis. Fig. 2 visar tidsförloppet för försvinnandet av 1 mM fenylalanin från plasma från en kontrollperson (kurva A) samt från en person som saknar transaminas men har normala nivåer av PAH (kurva B). Som framgår är de två hastigheterna nästan lika stora, vilket gör det ytterst osannolikt att uttalad HPA kan orsakas av brist på transaminas. Orsaken till att de två hastigheterna är så gott som identiska är att hastigheten för fenylalaninets försvinnande vid total avsaknad av PAH (kurva D) är mycket liten, eftersom den initiala hastigheten endast är 2,6 % av den för en kontroll med normala PAH-nivåer. I figur 2 (kurva C) visas också hastigheten för bortskaffande av fenylalanin hos en individ med 40 % av den normala PAH-nivån, ett underskott av PAH-aktivitet som, som diskuterats ovan, kan representera genomsnittet för PKU-heterozygoter.
Beräknade elimineringshastigheter för en belastning av fenylalanin för kontroller och för individer med olika genotyper. A, kontroller; B, person med noll transaminasaktivitet; C, person med 40 % av kontrollens PAH-aktivitet; D, person med 0 % av kontrollens PAH-aktivitet.
Nyligen klassificerades PKU-patienter genom att de tilldelades fenotypkategorier på grundval av deras tolerans för fenylalanin i kosten. Patienter med klassisk PKU tolererar mindre än 20 mg/kg fenylalanin per dag för att hålla blodets fenylalaninnivåer på den accepterade nivån 0,3 mM, de med ”måttlig PKU” tolererar 20-25 mg/kg per dag och de med ”mild PKU” tolererar 25-50 mg/kg per dag (42).
För att se om dessa toleransvärden för fenylalanin i kosten är samstämmiga med de förutsägelser som görs med Eq. 3 antogs att intaget av den tillåtna mängden fenylalanin fördelades jämnt på tre ”måltider”. För klassiska PKU-patienter med ett intag av fenylalanin på 15 mg/kg per dag skulle varje måltid innehålla 5 mg/kg per dag och lägga till 0,06 μmol/ml till baslinjevärdet på 0,30 μmol/ml för en total fenylalaninnivå i plasma på 0,30 + 0,06 = 0,36 μmol/ml. Om detta värde sätts in i ekv. 3 (med antagandet att Vmax för en klassisk PKU-patient är lika med noll) är -dPhe/dt lika med 0,001 μmol/ml per timme, dvs. vid denna fenylalaninnivå är hastigheten för fenylalaninets försvinnande via transaminationsreaktionen knappt högre än hastigheten för fenylalaninets inträde i plasmapoolen via nettoproteinnedbrytning. Därför förutsäger Eq. 3 att dessa PKU-patienter skulle kunna tolerera ett fenylalaninintag på 15 mg/kg per dag.
Beräknat på samma sätt skulle ”måttliga PKU”-patienter med en tolerans för fenylalanin i kosten på 25 mg/kg per dag behöva en kvarvarande PAH-aktivitet som motsvarar 15 % av vildtypens för att metabolisera det i 3.På samma sätt skulle patienter med ”mild PKU” med en tolerans för fenylalanin i kosten på 50 mg/kg per dag behöva en kvarvarande PAH-nivå på 25 % av vildtypnivån för att metabolisera det tillsatta fenylalaninet på cirka 3 timmar.Dessa resultat tyder på att Eq. 3 kan förklara toleransen för fenylalanin i kosten hos dessa olika patientgrupper.
Det skulle vara användbart att försöka korrelera dessa uppskattningar av den kvarvarande PAH-aktiviteten för ”mild PKU”- och ”måttlig PKU”-patienterna med den kvarvarande hydroxylasaktivitet som uppmätts in vitro för de muterade PAH-arter som patienterna har. För närvarande hindras dock ett sådant försök av att det finns för mycket spridning i in vitro-data. Flera patienter som klassificerats som ”måttligt PKU” (42) har visat sig hysa följande tre muterade former av PAH (med deras in vitro kvarvarande PAH-aktiviteter uttryckta som en procentandel av vildtypaktiviteterna inom parentes): L348V (25 %), R261Q (30 %, 47 %) och R158Q (10 %) (43). Man kan se att dessa värden varierar med nästan fem gånger. Som tidigare diskuterats (2, 43) tenderar i allmänhet in vitro-skattningar av resterande hydoxylasaktivitet hos PAH-mutanter att vara högre än de som observerats i leverbiopsier. Åtminstone en anledning till denna tendens är att in vitro PAH-aktiviteter vanligen mäts genom att använda mättande koncentrationer av fenylalanin och BH4, vilket gjordes för mutant R261Q (44). Med tanke på denna situation är det möjligt att resterande PAH-aktiviteter som uppskattas med hjälp av Eq. 3 kan visa sig vara en bättre återspegling av in vivo-aktiviteterna än de som mäts in vitro.
Denna modell för fenylalaninmetabolism är relevant för den slutsats som Thompson och hans kollegor (45, 46) drar på grundval av resultat som erhållits genom att infundera försökspersoner med deuteriummärkt fenylalanin och tyrosin, att klassiska PKU-patienter har en ”väsentlig” PAH-aktivitet som är lika stor som omkring 76 % av kontrollpersonernas. Denna häpnadsväckande höga fenylalaninhydroxylerande aktivitet tillskrevs tyrosinhydroxylas (45). Som redan diskuterats visar de resultat som sammanfattas i figur 2 att i avsaknad av PAH rensas en dos fenylalanin från blodet med mindre än 3 % av den hastighet som ses hos kontrollpersoner. Den nuvarande analysen tyder inte på att det finns någon alternativ väg hos människor som kan göra sig av med stora mängder fenylalanin. Nyligen har van Spronsen et al. (34) påpekat ett potentiellt metodologiskt problem med den metod som Thompson och medarbetare använde sig av.
Sammanfattningsvis är de kvantitativa resultat som erhållits med modellen för PAH-metabolism samstämmiga med data som indirekt avspeglar PAH:s aktivitet in vivo, t.ex. steady-state-fenylalaninnivåer i blodet, clearance-hastigheterna (konventionellt uttryckta som t1/2-värden) av fenylalanin från blodet efter en belastning av fenylalanin, och tolerans för fenylalanin via kosten. Modellen har potential att kvantitativt uppskatta den kvarvarande PAH-aktiviteten från alla dessa värden, särskilt från de uppmätta hastigheterna för clearance av en belastning av fenylalanin. De beräknade resterande PAH-nivåerna eller de värden som härleds från dem kan vara till hjälp vid beslut om hur sträng dietrestriktionen av fenylalanin måste vara för att uppnå den önskade fenylalaninnivån i blodet. I tabell 1 sammanfattas t1/2-värdena och steady-state-fenylalaninnivåerna i blodet som beräknats med hjälp av ekvation 3 (under förutsättning att inget intag av fenylalanin sker under testperioden) för olika nivåer av kvarvarande PAH-aktivitet, samt jämförbara värden från relevanta kliniska data.
- Se inline
- Se popup
Steady-state fenylalaninblodnivåer och t
-värden för clearance av fenylalnin beräknade från Eq. 3 för olika nivåer av PAH
Fotnoter
-
↵* Till vem förfrågningar om tryckning ska riktas. e-post: kaufman{at}codon.nih.gov.
ABBREVIATIONS
PAH, fenylalaninhydroxylas; PKU, fenylketonuri; HPA, hyperfenylalaninemi; PAG, fenylacetylglutamin