Resultat och diskussion
Två vägar för Pt-oxidation i E. coli. Genetiska studier har visat att enzymet C-P-lyas, som kodas av phn-operonet, kan oxidera Pt (26). I en nyligen genomförd studie (9) blev vi dock förvånade över att observera att vissa E. coli phn-mutanter fortfarande kunde oxidera Pt. Undersökning av genotypen hos dessa stammar tydde på att phoA-locus kan vara inblandat i Pt-oxidationen. För att testa denna hypotes direkt undersökte vi E. coli-stammar som skiljde sig åt enbart i phn- och phoA-lokusen med avseende på deras förmåga att oxidera Pt, vilket visades av deras förmåga att växa på medier med Pt som enda P-källa. Eftersom fosfat krävs för tillväxt kan organismer inte växa på detta medium om de inte har förmågan att oxidera Pt till fosfat. Stammar som antingen var phoA + eller phn + växte på Pt-medium (oavsett om det andra locuset var muterat eller inte), medan stammar med mutationer i både phn och phoA inte gjorde det (fig. 1). Därför har E. coli två vägar för oxidation av Pt: en som är phn-beroende och en som är phoA-beroende.
Till stöd för denna hypotes upptäckte vi Pt-beroende H2-produktion både in vitro och in vivo. In vitro-analyser utfördes aerobt i förseglade flaskor med hjälp av höggradigt renad BAP. Efter inkubation analyserades headspace för H2 och den vattenhaltiga delen analyserades för fosfat. Som framgår av figur 2B producerades stökiometriska mängder fosfat och H2 från Pt i närvaro av BAP, medan varken fosfat eller H2 producerades i kontrollreaktioner som innehöll antingen BAP eller enbart Pt.
Produkterna av den BAP-katalyserade Pt-oxidationen är fosfat och molekylärt H2. A) De protonavkopplade 31P-kärnmagnetresonansspektrumen och toppositionerna anges för 5 mM Pt och 5 mM fosfatkontroller, samt för en reaktion över natten som inledningsvis innehöll 5 mM Pt plus 500 μg renad BAP. En topp för oreagerad Pt och en ny fosfat-topp är tydliga i spektrumet för den enzymatiska reaktionen, men inga andra produkter producerades. Den lilla förskjutningen av fosfatpikens position mellan kontrollen och den BAP-katalyserade reaktionsprodukten beror på små pH-skillnader: tillsats av fosfatstamlösning till analysen ökade höjden på Pi-toppen men gav inte upphov till några extra toppar. Protonkopplade spektrum är helt förenliga med denna tolkning (data visas inte). (B) BAP-katalyserad Pt-oxidation producerar stökiometriska mängder fosfat och molekylärt H2. In vitro-reaktioner som innehöll de angivna komponenterna inkuberades över natten vid 37 °C i förseglade flaskor. Huvudrumsatmosfären analyserades sedan för H2 genom gaskromatografi med termisk konduktivitetsdetektion, medan den vattenhaltiga fasen analyserades för fosfat med hjälp av malakitgröntest. Reaktioner (3 ml) genomfördes i 50 mM Mops (pH 7,0) med 50 mM Pt (pH 7,0) och 387 μg renad BAP, enligt uppgift. Kontroller i tre exemplar som innehöll antingen BAP eller enbart Pt utfördes, men varken fosfat eller H2 detekterades under dessa förhållanden. Resultaten in vivo visar mängden H2 som produceras under tillväxt av WM3924 (Δlac X74, Δphn 33-30, ΔhypABCDE) i 0,4 % glukos/Mops-buljong som innehåller 2,5 μmol av den angivna P-källan. Eftersom denna nivå av P (500 μM) är tillväxtbegränsande förväntas P-källan vara helt assimilerad när kulturerna når mättnad. Efter tillväxt över natten vid 37 °C i förseglade flaskor undersöktes H2 i headspace genom gaskromatografi med termisk konduktivitetsdetektion. Både in vitro- och in vivo-experimenten genomfördes aerobt (dvs. O2 var närvarande under Pt-oxidationen).
Mätning av H2 in vivo kompliceras av det faktum att E. coli har flera hydrogenaser som både kan producera och konsumera H2. För att kringgå detta problem konstruerade vi en ΔhypABCDE-mutant, som inte kan producera några aktiva hydrogenaser på grund av sin oförmåga att mogna prekursorproteinerna (32). Hyp-mutanten, som odlades aerobt i förseglade rör, producerade också ungefär stökiometriska mängder H2 i kulturer som odlades med tillväxtbegränsande nivåer av Pt, medan inget H2 upptäcktes i kulturer som odlades med begränsande nivåer av fosfat eller fosfatestern fosfoserin (Fig. 2B ).
Pt-oxidation är inte en gemensam egenskap för alla alkaliska fosfataser. Effektiv Pt-oxidation verkar vara en unik egenskap hos E. coli alkalisk fosfatas. Varken Bacillus subtilis, som är känd för att producera flera mycket aktiva fosfataser (33), eller P. stutzeri, som är känd för att producera ett fosfatas som skiljer sig från BAP (i stammar som saknar Pt-dehydrogenas-systemet) (A. K. White, S. Neuhaus, M. M. Wilson och W. W. M., opublicerade data), kan använda Pt som enda P-källa (Fig. 3A ), även om båda organismerna växer på medier med fosfoserin som enda P-källa (data visas inte). De fosfataser som produceras av dessa organismer är således oförmögna att oxidera Pt med en hastighet som är tillräcklig för att stödja tillväxten. Vi testade också kommersiella preparat av kalvdjursfosfatas (CIP) och alkaliskt räkfosfatas (SAP) med avseende på deras förmåga att producera fosfat från Pt (fig. 3B ). Även om små mängder fosfat producerades av de eukaryota fosfataserna efter inkubation över natten var det bara E. coli BAP som kunde katalysera reaktionen med betydande hastighet. Detta resultat är särskilt förvånande eftersom de eukaryota enzymerna faktiskt är mycket bättre fosfataser, med specifika aktiviteter som är upp till 40 gånger högre än BAP (27). Dessa enzymer delar alla betydande homologi (25-35 % identitet) med E. coli BAP; dessutom är de flesta av resterna på den aktiva platsen, inklusive Ser-102 (som bildar en kovalent fosfoenzymintermediär under fosfatasreaktionen), bevarade (27).
Pt-oxidation är unik för E. coli alkaliskt fosfatas. (A) Förmågan hos B. subtilis och P. stutzeri att oxidera Pt, vilket visades genom tillväxt på medier med Pt som enda P-källa, testades enligt beskrivningen i fig. 1. Ingen av organismerna växte på Pt-mediet, medan båda organismerna växte på fosfatmedium. Trots att båda organismerna har aktiva fosfataser kan alltså ingen av dem oxidera Pt i tillräcklig omfattning för att stödja tillväxten. P. stutzeri WM3617 (ΔptxA-htxP, Δphn) innehåller mutationer som eliminerar de två karakteriserade Pt-oxidationsvägarna för denna organism men som inte påverkar fosfatasuttrycket (9, 10). (B) BAP (alkaliskt fosfatas från E. coli), SAP (alkaliskt fosfatas från räkor; Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland) och CIP (fosfatas från kalvtarm; Sigma) testades för Pt-oxidation enligt ovan. Vi använde 56 μg av det angivna fosfataset i varje analys, vilket motsvarar 3 BAP-, 32 SAP- och 65 CIP-fosfatasenheter, mätt genom hydrolys av pNPP. Trots de eukaryota enzymernas mycket högre fosfatasaktivitet var det endast BAP som katalyserade Pt-oxidation med betydande hastighet. Medelvärdet av två försök är plottat.
Det verkar rimligt att Pt-oxidation katalyseras av BAP genom en mekanism som liknar den som används för fosfatesterhydrolys (fig. 4A ). Följaktligen kan Pt hydrolyseras av BAP med hydridanjonen som formell avgångsgrupp. Till stöd för denna idé kan en phoA-mutant där Ser-102-restigen på den aktiva platsen har ändrats till alanin inte använda Pt som enda P-källa, vilket tyder på att denna aminosyra krävs för fosfatesterhydrolys (27) och för Pt-oxidation (fig. 4B ). Även om direkt hydridöverföring från ett substrat till en vattenproton är biokemiskt oöverträffad är denna reaktion termodynamiskt rimlig med tanke på den starkt reducerande potentialen hos fosfat-Pt-paret (E o′ = -0,650 V). Den H-producerande reaktionen är således ganska gynnsam: ΔG o′ = -46,3 kJ/mol (beräknat från redoxpotentialen i ref. 34). Om den hydrolytiska modellen för Pt-oxidation visar sig vara korrekt skulle det vara en mycket ovanlig enzymatisk reaktion. Studier har visat att BAP också kan hydrolysera fosfodiester (35), fosfoamider (36), sulfatester (37) och tiofosfat (38). Dessa reaktioner sker dock med hastigheter som är betydligt långsammare än Pt-hydrolysreaktionen trots att de involverar mycket bättre avgångsgrupper. De är inte heller redoxreaktioner. Den analoga reaktionen som innefattar hydrolys av alkylfosfonsyror katalyseras inte av BAP, vilket visas både biokemiskt (39) och genom Δphn-stammarnas oförmåga att använda dessa föreningar som enda P-källor (13).
Pt-oxidation med BAP kan ske genom hydrolys med hydridanjonen som avgående grupp. (A) Den kemiska mekanismen för fosfatesterhydrolys av BAP innebär nukleofil angrepp av en aktiverad serinrest (Ser-102) på fosfatestern för att bilda en fosfoserinenzymintermediat. Alkoxidavgångsgruppen får snabbt en proton från lösningen för att bilda motsvarande alkohol. Det verkar troligt att Pt-oxidation sker med hjälp av en liknande mekanism med hydridanjonen som avgående grupp. (B) Ser-102:s roll i Pt-oxidationen testades genom att undersöka om en mutant med en Ser-102-Ala-mutation i phoA-genen kunde växa på Pt-medier, enligt beskrivningen i fig. 1. Mutanten lyckades inte växa på Pt-medium, vilket visar att den aktiva platsen Ser-102 krävs för Pt-oxidation. Värdstammen var BW14893 (Δlac X74, ΔphoA532, Δphn 33-30), WM3610 och WM3611 bär integranter i enstaka kopior av plasmiderna pKY1 och pKY2, som kodar för vildtypen av phoA-genen (phoA+) respektive phoA-S102A-mutanten (Ser-102-Ala).
Pt-dehydrogenas (PtxD) hade varit det enda in vitro-karaktäriserade enzym som visats katalysera Pt-oxidation (11). Även om detaljerna i BAP-reaktionen ännu inte har klarlagts är de kemiska mekanismerna för de två enzymerna klart skilda. Medan PtxD kräver NAD som elektronacceptor för redoxreaktionen, kräver den reaktion som katalyseras av BAP inga exogena elektronacceptorer utan utnyttjar reaktionens stora termodynamiska drivkraft för att producera en starkt reducerad produkt (H2) från vatten i en i huvudsak irreversibel reaktion (beräknad K eq = 1,1 × 108). Alla andra kända H2-producerande reaktioner fungerar mycket närmare kemisk jämvikt och är vanligtvis reversibla. Dessutom innehåller alla andra kända hydrogenaser antingen Fe eller Ni, eller båda, i sina aktiva platser (40). Denna observation omfattar det så kallade ”metallfria” H2-bildande metylentetrahydrometanopterindehydrogenaset från metanogena arkéer, som man nu vet att det också innehåller Fe (41). BAP innehåller däremot inga redoxaktiva metaller, även om både Zn och Mg krävs för hydrolytisk aktivitet (27). Behandling av BAP med chelatorer hämmar Pt-oxidationen, vilket tyder på att metaller spelar en roll i Pt-reaktionen (data visas inte).
Finalt sett tyder de in vivo-data som presenteras här på att Pt-oxidationsreaktionen är biologiskt relevant. Observationen att många bakterier har enzymer avsedda för Pt-oxidation visar att egenskapen är under starkt selektivt tryck i mikrobiella populationer (4, 5, 9, 42). Med detta faktum i åtanke är det intressant att notera att även om de eukaryota enzymerna är mycket bättre fosfataser är de oförmögna att oxidera Pt. Denna observation ger upphov till möjligheten att E. coli BAP kanske inte har utvecklats för att vara det mest effektiva fosfataset utan snarare för att vara ett fosfatas med förmåga att hydrolytisera Pt. Denna idé stämmer överens med den märkliga observationen att E. coli BAP uttrycks i mycket hög grad (upp till 6 % av det totala cellproteinet) under fosfatstarkningsförhållanden (28). Den traditionella förklaringen till detta fenomen är att något okänt BAP-substrat måste vara dåligt hydrolyserat och därför kräva enorma mängder enzym för att stödja konkurrenskraftiga tillväxthastigheter. Eftersom det finns liten skillnad i de uppmätta hydrolyshastigheterna för en mängd olika fosfatester-substrat (39, 43) verkar det dock osannolikt att detta dåliga substrat skulle kunna vara en fosfatester. Däremot är hastigheten för Pt-hydrolys betydligt lägre än hastigheten för fosfatesterhydrolys, vilket tyder på att Pt kan vara det substrat som förklarar den extrema phoA-uttrycksnivå som observerats i fosfatfatfatfatförsörjd E. coli.
Det är uppenbart att många detaljer i BAP-reaktionen med Pt fortfarande återstår att klarlägga. Ytterligare studier av denna unika reaktion kommer sannolikt att bidra inte bara till vår förståelse av P-redoxkemi och fosforylöverföringsreaktioner utan också till vår kunskap om hydridöverföring, H2-producerande reaktioner och den roll som reducerade P-föreningar spelar i naturen.