Invasion Assay

Material:

Falcon 24 brunns vävnadskulturplatta

Falcon Cell Culture Insert:8μm porstorlek, 24 brunnsformat

Cat# 3097

Matrigel (utspädd iDMEM/F12)

5% Glutaraldehyd i 1XPBS

0.5% Toluidinblått i 2% Na2CO3

Förberedelse av Boydenkammaren:

1. Med hjälp av en steril pincett avlägsnas cellväggsinsatserna från sin förpackning och placeras i brunnarna i en 24-brunnsplatta.
2. Vask insatserna två gånger med 300μl DMEM/F12

(Var försiktig så att du inte sticker i membranet)

1. Sätt 20μl 1:6 utspädd Matrigel (2-3 mg/ml protein) i mitten av varje cellbrunnsinsats. Sprid försiktigt Matrigel över hela membranets yta.
2. Placera de belagda insatserna i inkubatorn för att låta Matrigel stelna i 20-30 minuter.

Förberedelse av celler för analys:

1. Behandla och odla cellerna enligt försöksbetingelserna. Det kan vara önskvärt att synkronisera cellerna till samma tillväxttillstånd.
2. Trypsinering och räkning av celler
3. Trypsa bort trypsinet och resuspendera med nytt medium.
4. Placera 1X105 celler i 200 μl definierat medium i den övre kammaren.
5. Tillsätt 300 μl medium i den nedre kammaren.
6. Kulturera i cirka 20 timmar.

Tiden varierar för olika cellinjer och kan vara upp till 48 timmar för mindre invasiva celler.

Fixering och färgning:

1. Efter odling, sug upp mediet från den nedre kammaren
2. Häll i 0,5 ml 5 % glutaraldehyd i 1XPBS, inkubera i 10 minuter. @ R.T
3. Aspirera in glutaraldehydlösningen, tvätta varje brunn 3 gånger med D.W
4. Häll 0,5 ml av 0,5 % toluidinblå färgningslösning i den nedre kammaren, inkubera i 10-20 min @ R.T
5. Aspirera lösningen från både övre och nedre kammaren, tvätta nedre kammaren 3 gånger med D.W
6. Torka försiktigt av den övre kammarens inre yta med en bomullspinne. (Var försiktig så att du inte trycker för hårt, då kan membranet hoppa ut.) Invaderade celler kommer att befinna sig i mitten av membranets botten.
7. Räkna antalet celler med q 20X objektiv i mikroskopet. Räkna minst 3 fält per membran.