Abstract
Bakgrund. Amyloidos är extracellulär utfällning av eosinofilt hyalinmaterial av eget ursprung med speciella färgningsegenskaper och fibrillär ultrastruktur. Makulär amyloidos är begränsad till huden och flera faktorer har föreslagits för dess patogenes. Detektion av DNA från Epstein-Barr-virus (EBV) i denna lesion tyder på att detta virus kan spela en roll i patogenesen för denna sjukdom. Syfte. EBV DNA-detektion gjordes på 30 hudprover med diagnosen makulär amyloidos och 31 friska hudprover i marginalen av borttagna melanocytära nevi med hjälp av PCR. Resultat. Hos patienter som var positiva för betaglobingenen i PCR var BLLF1-genen för EBV-virus positiv hos 23 patienter (8 patienter i fallgruppen och 15 patienter i kontrollgruppen). Det fanns ingen signifikant skillnad i förekomst av EBV-DNA mellan makulära amyloidosgrupper (3,8 %) och kontrollgrupper (23,8 %) (). Slutsats. Resultaten av den här studien visade att EBV inte är inblandat i patogenesen för makulär amyloidos.
1. Introduktion
Amyloidos är den extracellulära avlagringen av en grupp fibrösa proteiner. Det finns en mängd olika metoder för klassificering av amyloidos, men den enklaste metoden är indelning i systemiska och organspecifika (lokaliserade) typer. Huden är en involverad vävnad i båda typerna. Kutan lokaliserad amyloidos är av två typer: (i) keratinisk, som kan vara primär eller sekundär, och (ii) nodulär. Den sekundära typen är sekundär till andra hudförändringar såsom hudtumörer, inflammatoriska hudsjukdomar och fototerapi. Två typer av keratotisk amyloidos har identifierats: makulär och lichen amyloidos, och den senare är vanligare. Vid keratotisk amyloidos är keratinavlagringar med ursprung i basala keratinocyter huvudsakligen CK5-positiva. Keratotisk typ observeras främst i Sydostasien, Sydamerika och Kina. Den har familjära (10 %) och sporadiska former, och den senare är vanligare hos kvinnor . De vanligaste områdena är övre delen av ryggen (interscapularområdet) och extremiteterna (skenben och armar), även om de också har beskrivits i ansiktet, på bålen och på låren . Maculära amyloidoslesioner uppträder vanligen i form av hyperpigmenterade fläckar med obestämda marginaler som består av gråbruna makulaturer, ofta med ett nätliknande eller ribbigt utseende (figur 1). Klåda är ett vanligt symtom innan amyloidos börjar .
Patogenesen för denna sjukdom är inte helt klarlagd, förutom att det deponerade keratinet härrör från keratinocyter . Två patogena mekanismer har föreslagits inklusive apoptotisk (fibrillär) teori och sekretorisk teori . Enligt den apoptotiska teorin följs degenerationen av skadade keratinocyter i det basala lagret av att dessa kolloidkroppar omvandlas av dermala histiocyter och fibroblaster till amyloid i den papillära dermis (figur 2). Enligt den sekretoriska teorin sprids avlagringar av amyloid som härrör från degenererade basala keratinocyter till den papillära dermis genom den skadade lamina densa . Det finns flera etiologiska faktorer som är inblandade i patogenesen för makulär amyloidos: rasfaktorer , genetisk predisposition, miljöfaktorer , kön (kvinna) , kvinnliga hormoner , exponering för solljus , friktion (långvarig nötning) , atopi , autoimmunitet (baserat på association med systemisk lupus erythematosus, dermatomyosit, systemisk skleros, sarkoidos och IgA-nefropati) , och infektion med EBV . EBV, vars förekomst har rapporterats i epidermis vid makulär amyloidos, fungerar sannolikt som en faktor som bidrar till degeneration av keratinocyter .
EbV:s roll i etiopatogenesen av primär kutan amyloidos har utvärderats i endast två tidigare studier, inklusive en enda fallrapport och en fallserie med 27 patienter från Kina . Med tanke på bristen på studier om sambandet mellan EBV och makulär amyloidos, satte vi oss för att utföra en studie i detta avseende i Iran. Kanske kan antivirala medel användas i framtiden för behandling av denna sjukdom vid association med EBV.
2. Material och metoder
I denna fall-kontrollstudie rekryterades 38 prover från makulära amyloidos och 38 prover från frisk hud kring exciderade melanocytära nevi från ålders- och könsmatchade patienter utan makulära amyloidos till den kliniska undersökningen baserat på ett icke-slumpmässigt objektivt orienterat provtagningsförfarande. Inklusionskriterierna omfattade paraffinblock med tillräcklig mängd vävnad i arkiven på patologiavdelningen vid Imam Reza-sjukhuset i Mashhad som diagnostiserats med makulär amyloidos baserat på patologirapport och klinisk presentation. Uteslutningskriterierna omfattade block med ofullständiga uppgifter i arkiven och otillräckliga prover för PCR.
I fallgruppen bekräftades amyloiddepositionen genom optisk mikroskopi och färgning med Kongoröd. I nästa steg preparerades sex 5 μm sektioner från vart och ett av blocken i fall- och kontrollgrupperna under sterila förhållanden med hjälp av steril kniv och placerades i sterila Eppendorf-rör.
2.1. Deparaffinering
Xylol/etanol användes för att avparaffinera de paraffinerade vävnaderna. En ml xylol tillsattes till mikrorör som innehöll vävnadssektioner och inkuberades i rumstemperatur i en halvtimme med konstant skakning. I nästa steg centrifugerades mikrorören i 13 000 rpm i 10 minuter och supernatanten kasserades. Dessa två steg upprepades en gång. Femhundra μL 100 % etanol tillsattes till utfällningen och centrifugerades i 10 m i 13 000 rpm efter flera vändningar av mikroröret, och supernatanten avlägsnades sedan. Detta steg upprepades igen. Slutligen placerades den resulterande fällningen i rumstemperatur för att fullständigt avdunsta etanolen men inte fällningen.
2.2. DNA-extraktion
DNA-extraktion gjordes med hjälp av BIO BASIC INC (Kanada) kit med partinummer 8401-140116. Lysisbuffert-T användes för extraktion. I nästa steg tillsattes 100 μL extraktionsbuffert och 10 μL proteinas K till varje mikrorör och blandades. Vävnadsproverna tillsattes till blandningen och inkuberades vid rumstemperatur i 10 minuter. Därefter inkuberades proverna vid 95 °C i 3 minuter för att inaktivera proteinas K. Hundra μL Universal Buffer NST tillsattes till rören och inverterades 10 gånger. Den erhållna blandningen användes för PCR.
2.3. PCR
I den här studien användes PCR för att påvisa förekomsten av EBV-genom i makulär amyloidos. Efter DNA-extraktion från paraffiniserade block bestämdes kvaliteten på det DNA som extraherats från paraffinininbäddade vävnader med hjälp av betaglobingenenprimer. GH20- och PC04-betaglobingenprimers som användes i den här studien amplifierade ett fragment på 260 bp. Sekvensen för dessa primers var följande: GH20: 5′ GAA GAG CCA AGG ACA GGT AC 3′. PC04: 5′ CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC 3′.De prover som producerade ett fragment på 260 bp med hjälp av de önskade primrarna ansågs gynnsamma för amplifiering av EBV-virusets BLLF1-gen.
Förekomsten av EBV-sekvensen i de extraherade DNA-proverna testades med hjälp av Cinna Gen-kit med partinummer 935701 (Sina Clon, Iran). Detta kit har utformats för att bestämma kvaliteten på EBV-DNA i infekterade prover med hjälp av PCR. Optimerad 1x PCR som en blandning av rekombinant Taq DNA-polymeras, PCR-buffert, MgCl2, dNTPs och primers var det reagens som användes för blandning. Den mycket specifika och repetitiva regionen i BLLF1-genen som kodar för gp 350/220 amplifieras av primers. De kan detektera minst 30 kopior av EBV. Närvaron av 239 bp eller 256 bp fragment indikerar ett positivt testresultat.
Dataanalysen utfördes med hjälp av programvaran SPSS 11.5. Grafer och statistiska tabeller användes för att beskriva data och Chi-square och oberoende -tester användes för att jämföra EBV i friska och patienternas prover. I alla tester ansågs signifikansnivån 0,05.
3. Resultat
Femtio procent av patienterna var män (19/38) och 50 procent var kvinnor (19/38). Tre patienter var i åldersgruppen under 20 år (7,9 %), 5 patienter 20-30 år (13,2 %), 10 patienter 30-40 år (26,3 %), 13 patienter 40-50 år (34,2 %), 4 patienter 50-60 år (10,5 %) och 3 patienter över 60 år (7,9 %). Den lägsta och högsta åldern var 19 respektive 76 år. Det fanns 27 fall av infektion i bålen (71,1 %) och 11 fall i extremiteterna (28,9 %). Studie- och kontrollgruppen var matchade med avseende på ålder () och kön ().
PCR utfördes för betaglobingenen i 76 prover (38 fall och 38 kontroller), vilket var positivt i 61 prover (30 prover i fallgruppen och 31 i kontrollgruppen) och negativt i 15 prover (8 prover i fallgruppen och 7 i kontrollgruppen) (figur 3).
I 61 prover som var positiva för betaglobingenen i PCR var BLLF1-genen från EBV positiv i 23 fall (8 fall i undersökningsgruppen och 15 fall i kontrollgruppen) och negativ i 38 fall (22 fall i undersökningsgruppen och 16 fall i kontrollgruppen) (figur 4).
PCR av BLLF1-genen från EBV var 26,7 % positiv i undersökningsgruppen och 48,4 % positiv i kontrollgruppen. Chi-square testresultat visade ingen korrelation mellan EBV och makulär amyloidos () (tabell 1).
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
4. Diskussion
Amyloidos är känt som extracellulär avlagring av eosinofilt hyalinmaterial av eget ursprung med specifika färgnings- och ultrastrukturella egenskaper. Denna sjukdom kan förekomma i bakgrunden av systemiska sjukdomar eller vara begränsad till huden. Makulär amyloidos är begränsad till huden . EBV kan stimulera utsöndring av amyloidmaterial från keratinocyter eller kan vara en stimulans för degeneration av keratinocyter och omvandling av degenererade keratinocytfilament till amyloid . Nya studier har visat att epitelcellerna spelar en roll för EBV:s fortsatta reproduktion. EBV:s cellytereceptorer som finns i mindre differentierade skivepitel tyder på direkt infektion av epidermala keratinocyter. Infektion kan förekomma i groddjurskikt, men virusreplikation är endast möjlig genom mognad och differentiering av cellerna. Uttrycket av cytokeratin i mänskliga keratinocyter förändras in vitro efter infektion med EBV, vilket leder till att de omvandlas till fibroblaster . Fibroblaster kan fagocytera keratinaggregat och omvandla dem till amyloid .
Drago et al. visade detta samband i Italien 1996. Deras patient var en 30-årig kvinna med en tioårig historia av kliande bruna papler och makulor på bröstet och ryggen med symtom på kroniskt trötthetssyndrom. De kunde visa EBV-genom i epidermala lesioner med hjälp av in situ-hybridiseringsteknik. EBV-genomet visades huvudsakligen i basala epidermala celler samt i celler i högre skikt, särskilt i cytoplasman. Serologiska tester för EBV var också positiva hos patienten. Antiviral behandling med acyklovir och interferon alfa förbättrade hudlesioner och allmänna symtom hos patienten . En annan studie utfördes av Chang et al. på hudvävnad från 27 patienter med diagnosen lichen- och makulaamyloidos i Taiwan 1997. In situ-hybridiseringsmetoden indikerade EBV-DNA i lesioner hos 11 patienter (40,7 %), medan kontrollgruppen (inklusive tre patienter med sekundär kutan amyloidos, två patienter med primär systemisk amyloidos och fyra patienter med kronisk simplex lake) saknade EBV-DNA .
Enligt denna studie fanns det ingen korrelation mellan EBV och makulär amyloidos (). EBV DNA fanns hos 8 patienter med makulär amyloidos och 15 kontroller i vår studie. Skillnaden i detektionsfrekvens av EBV-DNA mellan makulära amyloidos-patienter och kontroller i denna studie med de nämnda studierna kan bero på följande orsaker: 1) Avsaknad av samband mellan makulär amyloidos och EBV-infektion: Det finns ett fåtal studier som presenterar otillräckliga bevis för en definitiv korrelation mellan EBV och makulär amyloidos, så baserat på resultaten av vår studie kunde vi dra denna slutsats. 2) Metodik (PCR jämfört med in situ-hybridisering): Vi använde en känslig metod för att detektera EBV-DNA med positiva och negativa kontroller. Baserat på tidigare studier är PCR lika känslig som in situ hybridisering . Men eftersom vi inte använde in situ-hybridisering kunde vi inte lokalisera den exakta infekterade cellen med EBV i våra kontroller som kan vara cirkulerande B-celler i huden i stället för keratinocyter. Eftersom vi använde positiva och negativa kontroller i vårt PCR-kit för EBV kunde de positiva fallen i vår kontrollgrupp inte vara falskt positiva. 3) Kontroller: Kontrollerna i vår studie var den friska huden runt melanocytära nevi, men kontrollerna i Chang-studien var andra kutana sjukdomar. 4) Typ av kutan amyloidos: I vår studie hade alla patienterna makulös amyloidos, men i de båda tidigare studierna hade de flesta av patienterna lichen amyloidos.
5. Slutsats
Enligt resultaten av den här studien fanns det inget samband mellan EBV och makulär amyloidos. Vi rekommenderar användning av färsk vävnad eller snabbt fryst biopsi stans samt samtidig serologisk undersökning av patienter för anti-EBV-antikroppar för att uppnå mer exakta resultat för jämförande studier av EBV-DNA vid makulös amyloidos. In situ PCR kan också användas för att lokalisera EBV DNA-positiva celler i proverna. Andra gener kan användas för att upptäcka EBV i vävnaden eftersom vissa EBV-prover är muterade för BLLF1-genen som används i den här studien .
Det rekommenderas också att utföra en jämförande studie om detektion av EBV i både involverad och icke-involverad hud hos patienter med makulös amyloidos.
Intressekonflikter
Författarna deklarerar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Författarna uttrycker sin djupa tacksamhet till forskningsdeputerade vid MUMS för finansiellt stöd och godkännande av forskningsförslaget (nr 911283) relaterat till Narges Nazeris avhandling. Finansiellt stöd från forskningsavdelningen vid Mashhad University of Medical Sciences bekräftas.