Introduktion

Natriumazid (NaN3) är ett vitt, färglöst och kristallint pulver och klassas som ett mycket giftigt ämne. Dess toxiska effekter liknar de av cyanid och skadar nerv- och kardiovaskulära system, ögon och hud. Detta giftiga ämne blir aktivt snabbt efter intag och de största effekterna uppträder flera timmar efter intag genom munnen, beroende på den mängd som intagits (1,2). Exponering för NaN3 kan framkalla ett antal symtom inom några minuter, bland annat illamående, kräkningar, huvudvärk, rastlöshet, yrsel, svaghet, snabb andning och snabb hjärtrytm (3). Stora mängder av detta giftiga ämne leder omedelbart till kramper, medvetslöshet, låg hjärtfrekvens och lågt blodtryck samt andningssvårigheter, vilket i slutändan leder till döden (3). Bland de påvisade verkningsmekanismerna hos NaN3 är den mest relevanta hämningen av cytokromoxidas-respiratoriska kedjekomplexet (4). Tidigare studier har visat att NaN3, en hämmare av komplex IV (Cox IV), kan framkalla apoptos i primära kortikala neuroner, vilket är caspase-3-beroende och förknippat med frisättning av cytokrom c (5).

I mitokondriebiosyntesen kan promotorn för den respiratoriska kedjan Cox IV aktiveras av nukleära respiratoriska faktorer (Nrf)-1/2. Samtidigt kan Nrf justeras genom att reglera aktiviteten hos gener som kodar för mitokondriell transkriptionsfaktor A (Tfam) för att indirekt reglera uttrycksnivåerna för andningskedjans gener. Nrf-1/2, Tfam, peroxisome proliferator-activatedreceptor γ co-activator 1-α (Pgc-1α) och andra co-aktivatorer utgör Pgc-1α-signalkaskaden, som har en central roll i ett regleringsnätverk som styr transkriptionskontrollen av mitokondriell biogenes och andningsfunktion. I denna signalkaskad aktiverar Pgc-1α först Nrf-1/2 i stället för att direkt binda till mitokondrie-DNA, och Nrf-1/2 inducerar aktivering av Tfam i kombination med Tfams promotor och utlöser transkription och replikation av mitokondrie-DNA, vilket leder till ökade uttrycksnivåer av mitokondriella proteiner (6). Samtidigt kan Pgc-1α aktiveras av CaN-, Ca2+/kalmodulinberoende proteinkinas (CaMK)-, mitogenaktiverat proteinkinas (MAPK)- och cyklinberoende kinasmedierade signalvägar (7). I denna studie användes PC12-celler för att generera en dopaminneuronmodell, och NaN3:s effekter och mekanism på de Pgc-1α-associerade signalvägarna i PC12-celler undersöktes för att identifiera om NaN3 framkallade toxicitet i odlade PC12-celler och vilka underliggande mekanismer som var inblandade i dessa effekter.

Material och metoder

Material

PC12-celler från feokromocytom PC12-råttor köptes från Cell Bank of Type Culture Collection of the Chinese Academy ofSciences (Shanghai, Kina). NaN3-stocklösning (Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland) löstes upp i steril koksaltlösning för att göra en 1 M-stocklösning, som sedan späddes till önskade koncentrationer före experimentet. Ett kit för TUNEL-apoptosanalys i ett steg (C1090), ett kit för apoptosdetektion med Annexin V-fluoresceinisotiocyanat (FITC) (C1063), ett kit för förstärkt adenosin 5′-trifosfat (ATP) (S0027), JC-1 Mitochondrial Membrane Potential Assay kit (C2006) och Reactive Oxygen Species Assay kit (S0033) tillhandahölls av Beyotime Institute of Biotechnology (Haimen, Kina).

Cellodling och livsduglighetsanalys

PC12-cellerna hölls i Dulbecco’s modifiedEagle’s medium (DMEM; Hyclone; GE Healthcare Life Sciences, Logan,Logan, UT, USA) kompletterat med 10 % serum från fetalt nötkreatur (FBS; Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), Waltham, MA, USA) och 1 % antibiotisk antimykotisk lösning bestående av 10 000 U penicillin och 10 000 U streptomycin. Cellerna inkuberades vid 37 °C i en luftfuktad atmosfär med 5 % CO2 och användes alltid vid 70-80 % konfluens.

Pc12-cellernas livsduglighet bestämdes med hjälp av ett cellräkningskit (CCK-8; Dojindo Molecular Technologies, Inc.,Shanghai, Kina). Cellerna såddes i 96-well-plattor med en täthet på 1×105/well. Efter 24 timmars odling behandlades cellerna med NaN3 (0-80 mM) och inkuberades i 12, 24, 48 och 72 timmar för att upprätta cellskademodellen. Därefter tillsattes 10 µl CCK-8-lösning (Dojindo Molecular Technologies, Inc.) till varje brunn och inkuberades i ytterligare 2 timmar under standardförhållanden (37 °C och 5 % CO2). Absorptionen vid en våglängd på 450 nm bestämdes med ELx808 Absorbance MicroplateReader (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA). Cellviabiliteten beräknades enligt den genomsnittliga optiska densiteten för 6 brunnar. Experimenten utfördes i tre exemplar. Lämpliga koncentrationer av NaN3 för användning i efterföljande experiment fastställdes enligt resultaten av cellviabilitetsanalyserna.

Kärnmorfologi hos DAPI-färgade PC12-celler

PC12-celler exponerades för 0, 10, 20 och 40 mMNaN3 i 24 timmar. För att skilja programmerad celldöd från icke-apoptotisk celldöd färgades kärnorna med 10 µg/ml DAPI (C1005; Beyotime Institute of Biotechnology). Cellerna tvättades två gånger med PBS och fixerades sedan med 4 %paraformaldehyd i rumstemperatur i 30 minuter. Efter tre tvättar färgades de fixerade cellerna med DAPI (1:5 000) i 5 minuter och sköljdes sedan med PBS. Fluorescensbilder togs med ett Leica DMI-fluorescensmikroskop (förstoring ×400).

Mätning av apoptosfrekvens

En Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection kit (Beyotime Institute of Biotechnology) användes för att bestämma cellernas apoptos i enlighet med tillverkarens anvisningar.Experimenten upprepades i tre exemplar och utfördes på följande sätt: Apoptosfrekvensen för kontroll-PC12-celler (0 mMNaN3) och PC12-celler som exponerats för 10, 20 och 40 mMNaN3 i 24 timmar mättes med flödescytometri (FC500; Beckman Coulter, Inc., Brea, CA, USA). Statistiska analyser utfördes med statistikprogrammet SPSS v.13.0 (SPSS, Inc.,Chicago, IL, USA).

Mätning av mitokondriell membranpotential (ΔΨm)

ΔΨm är en viktig parameter för mitokondriell funktion. Den bedömdes med hjälp av färgning med JC-1, en fluorescerande sond. Experimenten upprepades i tre exemplar och utfördes på följande sätt: Kontroll-PC12-celler behandlades med 0 mMNaN3, och experimentella PC12-celler exponerades för 10, 20 och 40 mM NaN3 i 24 timmar. Därefter, enligt tillverkarens protokoll (C2006; Mitochondrial Membrane Potential Assay kit; Beyotime Institute of Biotechnology, Haimen, Kina), inkuberades cellerna med mediet som innehöll JC-1 (1X) vid 37 °C i 20 minuter, cellerna tvättades tre gånger med tvättbuffert och samlades upp med färskt medium utan serum. Samtidigt behandlades den positiva kontrollen med carbonylcyanid3-klorfenylhydrazon (CCCP), en hämmare, (10 µM) vid 37 °C i 20 minuter. Därefter bestämdes den röda/gröna fluorescensen med FCM (FC500; Beckman Coulter, Inc.). Förhållandet mellan röd fluorescensintensitet och grön fluorescensintensitet representerade nivåerna av ΔΨm.

Mätning av produktion av reaktiva syrearter (ROS)

ROS i PC12-celler bedömdes med hjälp av ett kit för test av reaktiva syrearter (S0033; Beyotime Institute of Biotechnology, Haimen, Kina). Intracellulär ROS-generering bedömdes med hjälp av 2′,7′-diklorfluoresceindiacetat (DCFH-DA), en fluorescerande sond. Intracellulär ROS oxiderar DCFH-DA och ger den fluorescerande föreningen 2′,7′-diklorfluorescein (DCF), och DCF-fluorescensintensiteten anses vara parallell med mängden bildad ROS, enligt instruktionerna i ROS-analysutrustningen.Experimenten upprepades i tre exemplar och utfördes enligt följande: Positiv kontroll behandlades med specifik koncentration av Rosup (50 mg/ml), kontroll-PC12-celler behandlades med 0 mMNaN3 och experimentella PC12-celler exponerades för 10, 20 och 40 mM NaN3 i 24 timmar. Dessutom behandlades PC12-cellerna med DCFH-DA (10 mM) löst i serumfritt DMEM (1:1 000) i 20 minuter vid 37 °C och tvättades sedan tre gånger med serumfritt DMEM. Den positiva kontrollen behandlades med Rosup för att inducera ROS-produktion. ROS-produktionen bestämdes med FCM (FC500; Beckman Coulter, Inc.). De genomsnittliga fluorescensintensiteterna (MFI) representerade ROS-nivåerna.

Mätning av cellulärt ATP-innehåll iPC12-celler

Experimenten upprepades i tre exemplar och utfördes på följande sätt: Kontroll-PC12-celler behandlades med 0 mMNaN3, och experimentella PC12-celler exponerades för NaN3 i olika koncentrationer (10, 20 och 40 mM) i 24 timmar. Därefter bestämdes det cellulära ATP-innehållet med hjälp av ett Firefly Luciferase ATP Assay-kit (Beyotime Institute of Biotechnology) enligt tillverkarens protokoll.

Western blot-analys

PC12-celler exponerades för 0, 10, 20 och 40 mMNaN3 i 24 timmar, lyserades i radioimmunutskiljningsanalysbuffert (Beyotime Institute of Biotechnology) som innehöll aproteashämmare och centrifugerades vid 13 362 × g i 10 minuter vid 4 °C för att samla upp supernatanten. Därefter bestämdes proteinkoncentrationerna med hjälp av BCA-kit (Pierce; Thermo FisherScientific, Inc.). Lika stora mängder proteiner (90 µg) utsattes för 10 och 12 % SDS-PAGE och överfördes sedan till polyvinylidenfluoridmembran (0,45 µm) med hjälp av en Semidry Electro-transfer Unit (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Efter blockering med 5 % bovint serumalbumin i TBS innehållande 0.1% Tween-20 (TBST)i 2 timmar i rumstemperatur, inkuberades membranen medprimärantikroppar mot Pgc-1α (Abcam, Cambridge, MA, USA;1:500), Nrf-2 (Abcam; 1:500), Cox IV (Abcam; 1:1 000), Tfam (Abcam;1:1 000), procaspase-3 (Abcam; 1:500), Nrf-1 (Cell SignalingTechnology, Inc, Danvers, MA, USA, 1:500), pan-calcineurin A (CaN; Cell Signaling Technology Inc.; 1:1 000), fosforylerad (p)-CaMKII (Cell Signaling Technology; 1:1 000), p-p38 MAPK (Cell Signaling Technology, Inc.; 1:1 000), p-extracellular signal-regulated kinase(Erk)1/2 (Cell Signaling Technology, Inc.; 1:1 000), B-celllymphoma-2 (Bcl-2)-associerat X-protein (Bax; Santa CruzBiotechnology, Inc., Dallas, TX, USA; 1:200), Bcl-2 (Santa CruzBiotechnology, Inc.; 1:200) och cytokrom c (Santa CruzBiotechnology, Inc.; 1:200) vid 4°C över natten. Membranen tvättades sedan med TBST och inkuberades med häströdperoxidas(HRP)-konjugerade sekundära antikroppar (kanin; kat. nr. A0208; 1:1 000; eller mus; kat. nr. A0216; 1;1,000; båda Beyotime Instituteof Biotechnology) i 1 timme i rumstemperatur. Immunreaktiva band visualiserades med det förstärkta kemiluminiscenssystemet (ClinxScience Instruments Co., Ltd., Shanghai, Kina) och analyserades kvantitativt med Image J version l.32 J (National Institutes ofHealth, Bethesda, MD, USA), och β-actin valdes som belastningskontroll.

Statistisk analys

Alla statistiska analyser utfördes med SPSSstatistical software v.13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). Uppgifterna uttrycks som medelvärde ± standardavvikelse standardfel av medelvärdet. Den statistiska betydelsen av skillnaderna mellan grupperna fastställdes med hjälp av envägsvariansanalys följt av Bonferronis post-hoc-test. P<0,05 ansågs vara en statistiskt signifikant skillnad. Varje experiment upprepades minst tre gånger.

Resultat

NaN3 hämmar tillväxten av PC12-celler

Effekten av NaN3-exponering på PC12-cellernas spridning bedömdes med CCK-8-analys. Cellerna utsattes för olika koncentrationer (0-80 mM) av NaN3 i 12-72 timmar. Tabell I och figur 1A-D visar att cellens livskraft minskade av NaN3 på ett koncentrationsberoende sätt. Nästan 100 % av cellerna dog efter exponering för 80 mM NaN3 i 72 timmar, vilket tyder på att NaN3 tydligt framkallade celldöd och att NaN3:s cytotoxicitet upptäcktes på ett dos- och tidsberoende sätt. Exponering för NaN3 vid en koncentration på 20 mM i 24 timmar orsakade markant celldöd i PC12-cellerna (50 %). Därför användes de celler som odlats i 24 timmar för efterföljande experiment.

Cellmorfologi

Med DAPI-färgning observerades de morfologiska förändringarna hos PC12-celler med hjälp av fluorescensmikroskopi efter exponering för olika koncentrationer av NaN3. Fragmentering av cellkärnor som exponerats för NaN3 i 24 timmar observerades, och cellkärnornas krympning och kromatinkondensering ökade något med koncentrationen av NaN3 i PC12-celler jämfört med kontrollen. I dessa celler var de apoptotiska cellerna mindre och ljusare jämfört med normala celler. Kromatinkondensering och kärnfragmentering observerades också, medan blå kärnor av livskraftiga celler identifierades i kontrollgruppen.Dessutom ökade antalet apoptotiska celler och intensiteten av den gröna fluorescensen i celler som exponerades för NaN3 (Fig. 2).

Apoptotisk hastighetsbestämning med hjälp av annexin V-FITC-färgning

Döda celler eller sent apoptotiska celler som har förlorat cellmembranintegriteten kan färgas med propidiumjodid. På grund av förlusten av denna cellmembranintegritet kan Annexin V-FITC komma in i cytoplasman och kombineras med fosfatidylserin på insidan av cellmembranet, vilket ger grön fluorescens i döda celler.Figur 3 visar att antalet apoptotiska celler var 5,03, 8,02, 43,77 och 78,67 % (P<0,05) i PC12-cellerna efter att de exponerats för NaN3 i olika koncentrationer (0, 10, 20 och 40 mM) under 24 timmar. Dessa resultat bekräftade dessutom att NaN3 inducerade cellapoptos på ett dosberoende sätt.

Förändringar i mitokondriernas membranpotential (ΔΨm)

Mitokondrier anses i allmänhet vara viktiga reglerande organeller som är involverade i cellens livskraft. Därför användes ΔΨm som indikator för mitokondriernas funktion. PC12-celler färgades med JC-1, ett katjoniskt färgämne som uppvisar potentialberoende ackumulering i mitokondrier. Röd fluorescens (J-aggregat), som representerar aktiva mitokondrier med stabil membranpotential, observerades i ett litet antal celler som utsattes för ökande koncentrationer av NaN3. Däremot observerades grön fluorescens (J-monomer), som representerar apoptotiska mitokondrier med skadat ΔΨm, i ett antal celler. Förhållandet mellan röd och grön fluorescens minskade gradvis i kontrollgruppen (fig. 4).

NaN3-inducerad ackumulering av mitokondriell ROS

Det är väl känt att mitokondrier är den primära källan till cellulär ROS, och ROS tjänar en viktig roll vid inaktivering av apoptotisk signalering. Därför undersöktes även ROS:s roll i NaN3-inducerad PC12-celldöd. Fig. 5 visar att fluorescensintensiteten i kontrollceller och celler som exponerats för NaN3 i olika koncentrationer (0, 10, 20 och 40 mM) under 24 timmar var 3,65, 6,99, 18,63 och 39.35, vilket tyder på att NaN3-exponering signifikant ökade produktionen av mitokondriell ROS jämfört med kontrollgruppen (P<0,05). Dessa resultat tyder på att NaN3-induceradapoptos förbättrade produktionen av intracellulära ROS.

NaN3 nedreglerar demitokondriell energiproduktion av cellulärt ATP

För att utvärdera ATP-innehållet i PC12-celler som exponerats för NaN3 bestämdes den relativa luminescensenheten (RLU) kvantitativt med en luminometer. Fig. 6 visar att NaN3hämmade mitokondriell ATP-produktion och minskade gradvis den cellulära ATP-nivån (P<0,05).

Expressionsnivåer av Pgc-1α och apoptosassocierade proteiner i PC12-celler

Pgc-1α-uttrycket på proteinnivå minskade signifikant efter NaN3-exponering jämfört med kontrollen (P<0,05). Dessutom är Nrf-1, Tfam, p-Erk1/2, Nrf-2 och Cox IV välkända nedströmsmål för Pgc-1αdynamiken i olika celltyper (8). I denna studie identifierades att NaN3-exponering signifikant hämmade Pgc-1α-dynamiken på ett dosberoende sätt (P<0,01; fig. 7A).

Det visade sig dessutom att NaN3-exponering höjde uttrycksnivåerna för Bax och cytokrom c, samtidigt som den sänkte uttrycksnivåerna för Bcl-2 och procaspase-3 (P<0,05). Förhållandet mellan Bax/Bcl-2 ökade också betydligt jämfört med kontrollgruppen (P<0,05; fig. 7B).

Proteinuttrycksnivåerna för andra viktiga medlemmar, inklusive CaN, CaMKII, p-CaMKII, p38 MAPK och p-p38 MAPK, bedömdes också. Resultaten visade att NaN3ökade uttrycket av CaN och fosforyleringen av CaMKII och p38 MAPK jämfört med kontrollgruppen, medan uttrycksnivåerna för total CaMKII och p38 MAPK inte ändrades. Dessutom ökade förhållandet mellan p-CaMKII/CaMKII och p-p38/p38 MAPK i NaN3-gruppen signifikant jämfört med kontrollgruppen (P<0,01; fig. 7C).

Diskussion

För att avgöra om NaN3 hämmade PC12-cellernas proliferation jämfördes antalet behandlade celler i den logaritmiska fasen med antalet obehandlade kontrollceller. Celltillväxten hämmades med ~75 % efter 24 timmars exponering för 20 mM NaN3. Därför användes denna koncentration för efterföljande experiment. Apoptos innebär förändringar av den incellulära morfologin, inklusive membranblödning, cellskrumpning, kromatinkondensering, kärnfragmentering och DNA-fragmentering (9). För att dessutom analysera apoptosens kärnmorfologi och apoptosfrekvensen utsattes cellerna för 0, 10, 20 och 40 mM NaN3 i 24 timmar. Efter behandlingen färgades cellerna sedan med DAPI och AnnexinV-FITC/PI, och kärnornas fördelning analyserades. Resultaten bekräftade att NaN3-exponering inducerade apoptos i PC12-celler på ett koncentrationsberoende sätt.

Mitokondrier är involverade i många metaboliska funktioner, inklusive upprätthållande av intracellulärt pH och produktion av ROS, vilket främjar och reglerar cellapoptos (10). De kännetecken som kännetecknar cellapoptos föregås av mitokondriella förändringar, inklusive en förlust av ΔΨm, en minskning av energiproduktionen (ATP) och en ökning av mitokondrialmembranets permeabilitet. Tidigare studier har visat attROS utlöser skador på mitokondriernas andningskedja och leder till förlust av ΔΨm, vilket är de faktorer som förmedlar eller förstärker den neuronala dysfunktionen under neurodegenerationens förlopp och därmed leder till utveckling av neurodegenerativa sjukdomar (11,12).NaN3 är känt för att driva på degeneration och excitotoxicitet genom att öka permeabilitetspotentialen hos mitokondrialmembranet genom lipidperoxidation (13-15), och NaN3 utövar sin primära toxiska verkan genom att hämma funktionen hos cytokromoxidas i mitokondriernas elektrontransportkedja och förhindra ATP-produktion (4). I denna studie användes FCM för att identifiera ΔΨm och ROS-produktion i PC12-celler. Dessutom undersöktes ATP-syntesen i mitokondrier efter exponering för olika koncentrationer av NaN3. Den upplösning av plasmamembranet, ökningen av mitokondriell ROS-produktion och minskningen av det cellulära ATP-innehållet som observerades tyder på att NaN3-exponering inducerade apoptos i PC12-celler.

Mitokondriell celldöd kan aktiveras av flera olika stimuli, bland annat utvecklingsprogram, DNA-skador, stress i det endoplasmatiska retikulumet, brist på tillväxtfaktorer och näringsämnen, virusinfektioner och oxidativ stress (16). Som medlem av den ständigt växande familjen av nukleära samreglerare kan Pgc-1α aktivera en stor uppsättning gener och reglera uttrycksnivåerna för gener som är involverade i energimetabolismen som svar på signalvägar som reglerar termogenes, glukoneogenes, byte av muskelfibertyp och biogenes avmitokondrierna (17).Dessa samreglerare finns och fungerar i stora multiproteinkomplex, där de i stället för att binda till DNA reglerarNrf-1/2 och Tfam och modulerar deras transkriptionella styrka genom att främja de efterföljande biokemiska interaktioner som krävs för induktion eller repression av gentranskription (8). Nrf-1/2 kontrollerar dessutom indirekt uttrycket av mitokondrie-DNA-kodade gener genom att potentiellt inducera de kärnkodade Tfam A, B1 och B2 (Tfam, Tfb1m respektive Tfb2m), som reglerar transkriptionen och replikationen av mitokondriegenomet (18). Tidigare studier har visat att NaN3 är en hämmare av den mitokondriella andningskedjans komplex IV, som ofta påverkas vid primära mitokondriella störningar (19,20).I den här studien undersöktes först uttrycket av Pgc-1α-signalkaskaden, inklusive Pgc-1α-familjens proteiner (Pgc-1α, Nrf-1, Nrf-2 och Tfam) och Cox IV, i PC12-celler för att verifiera om signalhändelserna var involverade i NaN3-induceradapoptos. Resultaten tyder på att den NaN3-induceradeapoptosen var förknippad med uttrycksnivåerna för proteinerna i Pgc-1α-familjen och Cox IV i mitokondriemedierad signalväg. När koncentrationerna av NaN3 ökade minskade uttrycksnivåerna för dessa proteiner betydligt, vilket tyder på att de kan vara inblandade i aktivering och utveckling av apoptos.

omvänt kan komplex IV utlösa apoptos i primära kortikala neuroner, vilket är caspase3-beroende och förknippat med frisättning av cytokrom c (5). Det är väl känt att mitokondrier är viktiga reglerare av cellapoptos. Proteinerna i Bcl-2-familjen är viktiga initiativtagare till den mitokondriella apoptotiska vägen. Denna familj omfattar de proapoptotiska proteinerna Bax, Bcl-2 homologousantagonist/killer och Bcl-2-associated agonist of cell death samt de antiapoptotiska proteinerna Bcl-2 och Bcl-extra large (Bcl-xL). I friska celler är Bax ett inaktivt cytosoliskt protein, men det flyttas till mitokondrierna under apoptos. Det utövar sina pro-apoptotiska effekter genom att bilda en por i mitokondriernas yttermembran, genom vilken cytokrom c frigörs till cytoplasman, vilket leder till aktivering av caspas 3 (21). De antiapoptotiska proteinerna Bcl-2 och Bcl-xL undertrycker Bax funktion genom att bibehålla mitokondriemembranets integritet, vilket förhindrar frisättning av cytokrom cand och aktivering av caspas 3 (22). I den aktuella studien ökade NaN3 nivåerna av proapoptotiska Bax och cytokrom c och minskade nivåerna av antiapoptotiska Bcl-2 ochprocaspas-3, vilket tyder på att NaN3 initierademitokondriell apoptos-signalering i PC12-celler.

Det är dessutom så att uttrycksnivåerna av Pgc-1αco-aktivatorer är mycket inducerbara på transkriptionsnivå via en mängd olika uppströms signalvägar. Pgc-1α-aktivisternas uttryck induceras till exempel av motion och kylexponering under kontroll av stress-signalering via cellulär Ca2+- och cAMP-signalering (cAMP 5′-monofosfat) (23). Transkriptionen av Pgc-1α kan påverkas av CaMK, calcineurin, β-adrenerga receptorer/cAMP och p38MAPK (24-26). Dessutom har p38 MAPK, som tillhör MAPK-familjen, en central funktion vid cellproliferation, differentiering, omvandling och apoptos, eftersom aktivering av apoptos kan inducera Pgc-1α via direkt fosforylering (27). I denna studie undersöktes uttrycksnivåerna för proteiner i Ca2+-signalvägar (pan-calcineurin A och p-CaMKII/CaMKII) och p38 MAPK-vägar (p-p38MAPK/p38 MAPK och p-Erk1/2) för att undersöka effekterna av NaN3 på den intracellulära Ca2+-homeostasen och p38 MAPK. Uppgifterna visade att proteinnivåerna för pan-calcineurin A och förhållandena p-CaMKII/CaMKII och p-p38MAPK/p38 MAPK ökade och att p-Erk1/2-nivån minskade i den NaN3-behandlade gruppen, vilket tyder på att NaN3 utlöste apoptos av PC12-celler på ett dosberoende sätt, och att en sådan aktivering var förknippad med Ca2+- och p38 MAPK-vägarna. Sammantaget bekräftade dessa experimentella resultat att NaN3 kan framkalla apoptos hos PC12-celler genom att aktivera Ca2+- och p38 MAPK-vägarna. Såvitt vi vet avslöjade denna studie för första gången att NaN3 inducerademitokondriemedierad apoptos i PC12-celler genomPgc-1α-associerade signalvägar, inklusiveCa2+/p-CaMKII och p38 MAPK.

Sammanfattningsvis visade denna studie attNaN3 kan inducera apoptos hos PC12-celler. För att klarlägga den underliggande toxiska mekanismen för NaN3-exponering undersöktes uttrycksnivåerna för en rad proapoptotiska proteiner (Bax och cytokrom c) och antiapoptotiska proteiner (Bcl-2, procaspase-3, p-p38 MAPK, p-CaMKII och Pgc-1α). Resultaten bekräftade att proapoptotiska proteiner utövade proapoptotiska effekter på PC12-celler genom aktivering och fosforylering av CaMKII och p38 MAPK, vilket stimulerade aktiveringen av Pgc-1α och procaspase-3 i PC12-celler. Uppgifterna utgör en grund för efterföljande studier som undersöker NaN3:s verkningsmekanismer på molekylär nivå. Framtida studier kan innefatta tillsats av skyddsmedel, till exempel mitokondriell delningshämmare 1, ett derivat av quinazolinon som är en nyligen identifieradmitokondriell delningshämmare, före NaN3-behandling, för att undersöka de neuroprotektiva effekterna av skyddsmedlet när det gäller att dämpa NaN3-induceradapoptos i PC12-celler och för att ytterligare belysa den underliggande mekanismen.

Acknowledgements

Inte tillämpligt.

Finansiering

Denna studie fick ekonomiskt stöd av bidrag från Kinas nationella naturvetenskapliga stiftelse (grantno. 81571848) och Priority Academic Program Development ofJiangsu Higher Education Institutions.

Tillgänglighet av data och material

De dataset som använts eller analyserats under denna studie är tillgängliga från motsvarande författare på rimlig begäran.

Författarnas bidrag

YZ och SZ utformade och designade studien. YZ, JH, HX, TG och YW har samlat in data. YZ, JH och HX analyserade och tolkade data och utarbetade manuskriptet. Alla författare granskade manuskriptet kritiskt och läste och godkände den slutliga versionen av manuskriptet.

Etiskt godkännande och samtycke till deltagande

Inte tillämpligt.

Patientens samtycke till publicering

Inte tillämpligt.

Kompletterande intressen

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.

Förteckning

Abkortningar

Abkortningar:

NaN3	natriumazid
Cox IV	komplex. IV
Tfam	mitokondriell transkriptionsfaktorA
Nrf-1/2	nukleär respiratorisk faktor-1/2
CaN	pan-calcineurin A
Pgc-1α	peroxisome proliferator-activatedreceptor γ co-activator 1-α
PC12	rat feokromocytom
ΔΨm	mitokondriell membranpotential
CCCP	carbonylcyanid3-klorfenylhydrazon
ROS	reaktiva syrearter
FCM	flödescytometri
MAPK	mitogen-aktiverat proteinkinas

	Herbold M, Schmitt G, Aderjan R och PedalI: Dödlig natriumazidförgiftning på ett sjukhus: En olyckshändelse som kan förebyggas. Arch Kriminol. 196:143-148. 1995. (På tyska). PubMed/NCBI
	Marquet P, Clément S, Lotfi H, DreyfussMF, Debord J, Dumont D och Lachâtre G: Analytiska fynd vid ett självmord med natriumazid. J Anal Toxicol. 20:134-138. 1996.Visa artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Chang S and Lamm SH: Human health effectsof sodium azide exposure: En litteraturöversikt och analys. Int JToxicol. 22:175-186. 2003. Visa artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Leary SC, Hills BC, Lyons CN, Carison CG,Michaud D, Kraft CS, Ko K, Glerum DM och Moyes CD: Kronisk behandling med azid in situ leder till en irreversibel förlust av cytokrom c-oxidasaktivitet via dissociation av holoenzymet. J BiolChem. 277:11321-11328. 2002. Visa artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Grammatopoulos TN, Morris K, Bachar C,Moore S, Andres R and Weyhenmeyer JA: AngiotensinII dämpar den kemiska hypoxi-inducerade caspase-3-aktiveringen i primära kortikala neuronalkulturer. Brain Res Bull. 62:297-303. 2004. Visa artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Scarpulla RC: Metabolic control ofmitochondrial biogenesis through the PGC-1 family regulatorynetwork. Biochim Biophys Acta 1813. 1269-1278. 2011.
	Qian G, Guo JB and Li L: The role ofPgc-1α and mitochondrial regulation in cardiovascular disease.Chinese Pharmacol Bull. 29:1-5. 2013.
	Jones AW, Yao Z, Vicencio JM,Karkucinska-Wieckowska A och Szabadkai G: PGC-1 family coactivatorsand cell fate: Roles in cancer, neurodegeneration, cardiovasculardiseasease and retrograde mitochondria-nucleus signaling.Mitochondrion. 12:86-99. 2012. Visa artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Kerr JFR, Winterford CM and Harmon BV:Apoptosis: Its significance in cancer and cancer therapy. Cancer.73:2013-2026. 1994. Visa artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Chan DC: Mitokondrier: Dynamic organellesin disease, ageing and development. Cell. 125:1241-1252. 2006.Visa artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Islam MT: Oxidativ stress ochmitokondriell dysfunktion i samband med neurodegenerativa sjukdomar. NeurolRes. 39:73-82. 2017. Visa artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Chaturvedi RK and Flint BM: Mitochondrialdiseases of the brain. Free Radic Biol Med. 63:1-29. 2013.Visa artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Van Laar VS, Roy N, Liu A, Raiprohat S,Arnold B, Dukes AA, Holbein CD and Berman SB: Glutamatexcitotoxicitet i neuroner utlöser mitokondriell och endoplasmicreticulum ackumulation av Parkin och i närvaro av N-acetylcystein, mitofagi. Neurobiol Dis. 74:180-193. 2015. Visa artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Liu L, Peritore C, Ginsberg J, Shinh J,Arun S and Donmez G: Protective role of SIRT5 against motor deficitand dopaminergic degeneration in MPTP-induced mice model ofParkinson’s disease. Behav Brain Res. 281:215-221. 2015. Visa artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Palomo GM and Manfredi G: Exploring newpathways of neurodegeneration in ALS: Mitokondriernas kvalitetskontroll spelar en viktig roll. Brain Res 1607. 36-46. 2015. Visa artikel : Google Scholar
	Youle RJ och Strasser A: The BCL-2 proteinfamily: Motsatta aktiviteter som förmedlar celldöd. Nat Rev MolCell Biol. 9:47-59. 2008. ViewArticle : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Vercauteren K, Pasko RA, Gleyzer N, MarinoVM and Scarpulla RC: PGC-1-related coactivator: Omedelbart tidig expression och karakterisering av en CREB/NRF-1-bindningsdomän som är associerad med cytokrom c-promotorns ockupation och respiratorisk tillväxt. Mol Cell Biol. 26:7409-7419. 2006. Visa artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Scarpulla RC: Transcriptional paradigms inmammalian mitochondrial biogenesis and function. Physiol Rev.88:611-638. 2008. Visa artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Betts J, Lightowlers RN and Turnbull DM:Neuropathological aspects of mitochondrial DNA disease. NeurochemRes. 29:505-511. 2004. Visa artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Tanji K, Kunimatsu T, Vu TH och Bonilla E:Neuropathological features of mitochondrial disorders. Semin CellDev Biol. 12:429-439. 2001. Visa artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Aluvila S, Mandal T, Hustedt E, Fajer P,Choe JY och Oh KJ: Organization of the mitochondrial apoptotic BAKpore: Oligomerisering av BAK-homodimerer. J Biol Chem.289:2537-2551. 2014. Visa artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Yang E, Zha J, Jockel J, Boise LH,Thompson CB och Korsmeyer SJ: Bad, a heterodimeric partner forBcl-XL and Bcl-2, displaces Bax and promotes cell death. Cell.80:285-291. 1995. Visa artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Hock MB and Kralli A: Transcriptionalcontrol of mitochondrial biogenesis and function. Annu Rev Physiol.71:177-203. 2009. Visa artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Handschin C, Rhee J, Lin J, Tarr PT andSpieglman BM: An autoregulatory loop controls peroxisomeproliferator-activated receptor gamma coactivator 1alpha expressionin muscle. Proc Natl Acad Sci USA. 100:7111-7116. 2003. Visa artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Schaeffer PJ, Wende AR, Magee CJ, NeilsonJR, Leone TC, Chen F och Kelly DP: Calcineurin andcalcium/calmodulin-dependent protein kinase activate distinctmetabolic gene regulatory programs in cardiac muscle. J Biol Chem.279:593-603. 2004. Visa artikel : Google Scholar
	Rohas LM, St-Pierre J, Uldry M, Jäger S,Handschin S and Spiegelman BM: A fundamental system of cellularenergy homeostasis regulated by PGC-1 alpha. Proc Natl Acad SciUSA. 104:7933-7938. 2007. Visa artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Puigserver P, Rhee J, Lin J, Wu Z, YoonJC, Zhang CY, Krauss S, Mootha VK, Lowell BB och Spiegelman BM:Cytokinstimulering av energiförbrukningen genom p38 MAP kinaseaktivering av PPARgamma coactivator-1. Mol Cell. 8:971-982. 2001.Visa artikel : Google Scholar : PubMed/NCBI