Molekylär kloning är en uppsättning tekniker som används för att föra in rekombinant DNA från en prokaryotisk eller eukaryotisk källa i ett replikerande medium, t.ex. plasmider eller virala vektorer. Kloning innebär att man gör många kopior av ett DNA-fragment av intresse, t.ex. en gen. I den här videon får du lära dig om de olika stegen i molekylär kloning, hur man ställer in förfarandet och olika tillämpningar av den här tekniken.
Minst två viktiga DNA-molekyler krävs innan kloningen påbörjas. Först, och viktigast, behöver du det DNA-fragment som du ska klona, även kallat insert. Det kan komma från en prokaryot, eukaryot, en utdöd organism eller skapas artificiellt i laboratoriet. Genom att använda molekylär kloning kan vi lära oss mer om funktionen hos en viss gen.
För det andra behöver du en vektor. En vektor är plasmid-DNA som används som ett verktyg inom molekylärbiologin för att göra fler kopior av eller producera ett protein från en viss gen. Plasmider är ett exempel på en vektor och är cirkulärt, extra kromosomalt, DNA som replikeras av bakterier.
En plasmid har vanligtvis en multipel kloneringsplats eller MCS, detta område innehåller igenkänningsställen för olika restriktionsendonukleaser även kända som restriktionsenzymer. Olika inserts kan införlivas i plasmidet genom en teknik som kallas ligering. Plasmidvektorn innehåller också ett replikationsursprung, vilket gör att den kan replikeras i bakterier. Dessutom har plasmiden en antibiotikagene. Om bakterier inkorporerar plasmiden kommer den att överleva i medier som innehåller antibiotikan. Detta gör det möjligt att välja ut bakterier som framgångsrikt transformerats.
Insatsen och vektorn klonas in i en värdcellsorganism, den vanligaste som används vid molekylär kloning är E. coli. E. coli växer snabbt, är allmänt tillgänglig och har många olika kloningsvektorer som produceras kommersiellt. Eukaryoter, t.ex. jäst, kan också användas som värdorganismer för vektorer.
Det första steget i det allmänna förfarandet för molekylär kloning är att få fram det önskade inslaget, som kan härledas från DNA eller mRNA från vilken celltyp som helst. Den optimala vektorn och dess värdorganism väljs sedan utifrån typen av insättning och vad som i slutändan ska göras med den. En polymeraskedjereaktion eller PCR-baserad metod används ofta för att replikera insatsen.
Därefter används en serie enzymatiska reaktioner för att sammanfoga insatsen och digesten och föra in den värdorganismen för massreplikation. Replikerade vektorer renas från bakterier och efter restriktionssmältning analyseras de på en gel. Gelrenade fragment skickas senare för sekvensering för att verifiera att insatsen är det önskade DNA-fragmentet.
Låt oss ta en lite mer detaljerad titt på hur molekylär kloning genomförs. Innan du börjar vill du planera din kloningsstrategi, innan du gör något kloningsförsök i bänken. Till exempel kommer en given plasmidvektor att ge dig ett begränsat antal restriktionsställen för att införliva insatsen via den multipla kloningsstället. Du måste välja restriktionsplatser som inte finns i din insert så att du inte klyver den. Du kan hamna i en situation där du tvingas sammanfoga ett fragment med trubbig ände med ett som har ett överhäng. Om så är fallet kan det enda alternativet för att få in insatsen i önskad vektor vara att använda klenow-fragmentet för att sätta upp en trubbig ligation. Att förstå de olika verktyg för molekylär kloning som står till ditt förfogande, samt att komma fram till en noggrann strategi innan du börjar klona kan vara en enorm tidsbesparing.
Den DNA-källa som används för molekylär kloning kan isoleras från nästan vilken typ av cell- eller vävnadsprov som helst genom enkla extraktionstekniker. När det har isolerats kan PCR användas för att amplifiera insatsen.
När insatsen har amplifierats smälts både den och vektorn med hjälp av restriktionsenzymer, även kallade restriktionsendonukleaser.
När den har smälts kan insatsen och vektorn köras på en gel och renas med hjälp av en process som kallas gelrening. När det gäller vektorn hjälper detta steg till att rena linjäriserad plasmid från oklippt plasmid, som tenderar att uppträda som en smet med hög molekylvikt på en gel.
Efter gelrening av digesten ligeras eller sammanfogas insatsen med plasmidet, via ett enzym som kallas DNA-ligas.
Generellt sett är det alltid en bra idé att sätta upp ligeringar, så att förhållandet mellan insatsen och vektorn är 3 till 1, vilket säkerställer att endast en liten mängd vektor kommer att självligera. När ligationen har ställts upp på is, inkuberas den någonstans mellan 14-25˚C från 1 timme till över natten.
Nästan utförs transformationen för att föra in plasmidvektorn i den värd som kommer att replikera den.
Efter transformationen plottas bakterierna ut på agarplattor med antibiotika och inkuberas över natten vid 37°C. Eftersom plasmidet innehåller en antibiotikaresistensgen kommer en lyckad transformation att ge bakteriekolonier när det odlas på agarplattor i närvaro av antibiotika. Enskilda kolonier kan sedan plockas från den transformerade plattan, placeras i flytande tillväxtmedium i numrerade rör och placeras i en skakande inkubator för expansion. En liten volym av den flytande kulturen läggs till en numrerad agarplatta, medan resten av kulturen går vidare till plasmidrening. Det numreringsschema som anger identiteten på de bakteriekolonier från vilka plasmiderna så småningom kommer att renas behålls under hela plasmidreningsprocessen.
Ett prov av den renade plasmiden skärs sedan med restriktionsenzymer. Digesten laddas sedan och körs på gel för att kontrollera förekomsten av insert, vilket kommer att verifiera att bakteriekolonin transformerades med en plasmid som innehåller ett insert och inte en självligerad plasmid. Bakterier som verifierats ha transformerats med en plasmid som innehåller en insert expanderas för ytterligare plasmidrening. Sekvensering används som ett sista verifieringssteg för att bekräfta att din gen av intresse har klonats.
Molekylär kloning kan användas för ett nästan obegränsat antal tillämpningar. Till exempel, när en mRNA-mall omvänt transkriberas för att bilda cDNA, eller komplementärt DNA, med ett enzym som kallas omvänt transkriptas och sedan PCR används för att amplifiera cDNA, kan molekylär kloning användas för att skapa ett cDNA-bibliotek – ett bibliotek med alla gener som uttrycks av en viss celltyp.
Molekylär kloning kan också användas för att ta en serie gener eller ett genkluster från en bakteriestam, omorganisera dem till plasmider som transformeras i en annan stam, så att en hel biosyntesväg kan återskapas för att producera en komplex molekyl.
Med hjälp av molekylär kloning kan ett mutantbibliotek genereras genom att uttrycka en målplasmid i en speciell bakteriestam som använder ett felkänsligt polymeras när den odlas vid vissa temperaturer. Mutationerna kan karakteriseras genom sekvensering. Bakterier som transformerats med muterade gener kan sedan testas med olika läkemedel eller kemikalier för att se vilka bakteriekolonier som har utvecklats till att ha läkemedelsresistens.
Tack vare molekylär kloning kan reportergener införlivas i DNA-plasmider, en vanlig reportergen är grönt fluorescerande protein eller GFP, som avger en grön fluorescens när det utsätts för UV-ljus. En reportergen kan också införas i ett alfavirus för att visa infektion hos myggor och överförbarhet i celler.
Du har just tittat på JoVEs video om molekylär kloning. Du bör nu förstå hur molekylär kloning fungerar och hur tekniken kan användas inom molekylärbiologin. Som alltid tack för att du tittade på!