Forskningsstudier

I våra studier har vi undersökt en EU-gröda, Pisum sativum (ärt). Ärter är mottagliga för ett stort antal virus, bland annat Pea enation mosaic virus, Pea early browning virus och en rad virus från Potato virus Y-gruppen (Potyviridae). Inom den sistnämnda gruppen är Bean yellow mosaic virus, Bean common mosaic virus, Pea mosaic virus och Pea seed borne mosaic virus (PSbMV) alla viktiga patogener. Vi har särskilt studerat PSbMV som alla kommersiella ärtsorter är mottagliga för. Denna mottaglighet förvärras av det faktum att detta virus inte bara överförs från planta till planta genom sin bladlusvektor utan också överförs vertikalt från generation till generation i fröet. Denna egenskap har resulterat i allvarlig kontaminering av samlingar av ärtspermat och utgör ett mycket effektivt sätt att ge tidig och utbredd infektion av grödor strax efter det att fröet gror. Om man betänker att en överföringseffektivitet på endast 0,1 % skulle resultera i 10 000 infektioner efter sådd av 107 frön per hektar, blir betydelsen av överföring av frön uppenbar. För närvarande motverkas detta problem genom effektiv testning av utsädesprover efter skörd genom immunodetektion av virusets höljeprotein och genom att kontaminerade utsädespartier förkastas. Som ett alternativ, och eftersom frööverföringen i en rad ärtsorter varierar från 0 till 100 %, har vi undersökt om resistens mot frööverföring kan avlas in i förbättrade ärtlinjer. I testkorsningar och backcrossningar mellan linjer som inte har någon överföring eller 60-80 % överföring uppträdde resistensen som en dominerande egenskap, även om den i F2- och BC2-generationerna inte segregerades som en mendelsk egenskap. Fenotypens kvantitativa karaktär tyder på att det skulle vara svårt att inkludera frööverföring som en resistensegenskap i ett konventionellt förädlingsprogram.

Naturlig resistens mot PSbMV har identifierats i ärttillgångar från Nordafrika och Asien, även om dessa recessiva gener hittills inte har förts in i kommersiella linjer. Genetisk analys har visat att dessa gener är klustrade med andra recessiva gener med olika potyvirusspecificitet på två platser på ärtgenomet. Generna sbm-1, sbm-3 och sbm-4, som ger resistens mot PSbMV-patotyperna PI, L-l respektive P4, finns på kromosom 6, medan sbm-2, som också ger resistens mot patotyp L-l, finns på kromosom 2 . Även om denna organisation tyder på lokal genkonvertering och translokation mellan kromosomerna 2 och 6, tyder andra bevis på att de två genklustren kan ha olika ursprung och funktion. Med hjälp av rekombinanta hybridvirus tillverkade av olika patotyper har virusets avirulensdeterminant definierats som det virusgenomlänkade proteinet (VPg) för sbm-1 . En strukturell och funktionell analys av sbm-1-genen är ämnet för ett EG-bioteknikprojekt nr BI04-CT97-2356 (www.dias.kvl.dk/eupsbmv) med deltagande av forskargrupper och industri från Danmark, Finland, Spanien och Storbritannien.

Karakteriseringen av sbm-1-genen kommer att ge särskilda intellektuella och praktiska fördelar. Eftersom cirka 20 % av alla virusresistensgener och cirka 40 % av de gener som ger resistens mot potyvirus är recessiva, kommer det att vara viktigt att förstå hur sbm-1 fungerar och vad som styr specificiteten hos intilliggande sbm- och andra potyvirusresistensgener när det gäller ett brett spektrum av sjukdomar. Projektet sbm- har dock också tekniska utmaningar, inte minst när det gäller att hantera storleken och redundansen i ärtgenomet. Ärtgenomet är cirka 5 x 109 baspar per haploidgenom, cirka 50 gånger större än det från Arabidopsis thaliana. Kartbaserad kloning av gener i ärt har inte lyckats, och det finns ännu inga stora insättningsbibliotek. Det finns dock potential i sbm-1 att identifiera en ny klass av resistensgener. Resistensgener som hittills har klonats från andra arter kan delas in i två klasser. De dominerande resistensgener som fungerar mot specifika virus, svampar och bakterier hör i stort sett till klassen ”NBS-LRR” och förmedlar en överkänslig resistens mot infektioner. Den enda recessiva genen som har klonats (mlo) förmedlar en icke rasspecifik resistens mot mjöldagg hos korn och är också förknippad med lokalisering av patogenen i döda celler. Funktionellt fungerar Mlo som en negativ regulator av den konstitutiva resistensen. Däremot är sbm-1 ras (eller patotyp) specifik och är inte förknippad med celldöd. Utifrån dessa jämförelser verkar flera funktionella mekanismer för sbm-1 vara möjliga. För det första kan vi betrakta Sbm-1 som en dominerande känslighetsfaktor som krävs för att underlätta virusreplikation. Detta skulle stämma med VPg:s sannolika inblandning i virusets RNA-replikation och observationen att protoplaster från resistenta växter inte uppvisar någon påvisbar virusreplikation . För det andra kan Sbm-1 i likhet med Mlo fungera som en negativ regulator av resistens, även om skillnaderna i specificitet jämfört med mlo skulle placera sbm-1 i en särskild klass av resistensgener. För det tredje kan sbm-1 vara en dominant men dosberoende svag resistensallel. Vi föredrar det första alternativet som den mest direkta och enklaste tolkningen.

För vår komponent i EG-bioteknikprojektet har vi valt att använda oss av genetiska metoder för att identifiera sbm-1-resistensgenprodukten. Efter att ha identifierat lämpliga ärtlinjer (ett BC4-par av linjer som bär homozygota resistens- och känslighetsalleler) har en cDNA-AFLP-strategi använts för att identifiera uttryckta gener som kommer från den introgresserade regionen. Hittills har tio polymorfa cDNAs identifierats. Dessa kartläggs nu med hjälp av rekombinanta inavelsfamiljer för att bekräfta deras genomiska ursprung. Vår alternativa strategi är att ”fiska” efter sbm-1-genprodukten genom att använda jäst tvåhybridsystemet med PSbMV VPg som lockbeteprotein. Två starka kandidat-cDNA:er och åtta andra cDNA:er som kodar för interaktorproteiner har identifierats från ett cDNA-bibliotek av ärt som gjorts från en mottaglig ärtlinje. Dessa cDNA:er håller också på att sekvenseras och kartläggas.

Som en del av ett tidigare EC-AIR-projekt (# CT94-1171) med deltagande av akademiska och industriella partner i Danmark, Frankrike och Storbritannien, har vi också undersökt potentialen för att utveckla PDR mot PSbMV i transgena ärtor. Eftersom virusets replikasgen i andra system vanligen har använts för att ge PDR genom att utlösa processen för posttranskriptionell genavstängning (PTGS), använde vi PSbMV:s replikascistron (NIb) för transgena uttryck i ärter. Av 35 ärtlinjer som transformerats med Agrobacterium tumefaciens T-DNA med en 35S-promotor -Nib – 35S-terminatorkonstruktion och bar-genen som en selekterbar markör för transformerad vävnad i närvaro av herbiciden Bialophos, visade sig tre linjer vara resistenta mot PSbMV. Två av dessa linjer hade en direkt upprepning av 3′ änden av Nib-genen (NIbIb), eftersom det fanns vissa tecken på att komplexa transgenarrangemang hade större potential att initiera PTGS. Alla dessa linjer uppvisade en typ av PDR som kallas ”återhämtning”, där utmaningsinokulering resulterar i en initial infektion, men plantorna återhämtar sig snabbt och visar inga fler symtom eller virusackumulering. De återställda vävnaderna är sedan resistenta mot ytterligare angrepp med homologa eller närbesläktade virusisolat. För att bedöma betydelsen av detta i fält, där växterna kan utsättas för en population av besläktade virus, bedömdes förmågan hos olika isolat av PSbMV att utlösa PTGS och att bli måltavla för inducerad PTGS. Detta visade att virus med ca 89 % eller mer identitet i NIb-cistronen kunde framkalla resistens, även om kraven på specificitet kan vara högre för att ett andra virus som utmanas ska betraktas som en måltavla. Som referens kan nämnas att de två mest divergerande sekvenserade PSbMV-isolaten skiljer sig åt med 89 % i Nib-regionen. Denna skillnad i krav på specificitet för utlösning och målinriktning i PTGS kommer att vara ett viktigt övervägande för tillämpningen av tekniken på kommersiella grödor. Den relativt breda resistensen mot PSbMV-isolat i transgena Nib-ärter står i kontrast till den extrema patotypspecificitet som ses för de naturliga sbm-resistensgenerna, där endast en eller ett fåtal förändringar i virusets avirulensdeterminant räcker för att förändra ett PSbMV-isolat från avirulent till virulent .

Trots den korta perioden av initial infektion uppvisade de transgena ärtplantorna god tillväxt och frösättning efter utmaningsinokulering för att ge en avkastning under växthusförhållanden som var likvärdig med de som observerades för oinfekterade transgena eller icke-transgena linjer. Vi tror att dessa plantor, med förbehåll för licensavtal som täcker användningen av bar-genen för att selektera transformerade plantor, skulle kunna vara användbara tillägg till panelen av patogenresistensgener som ska användas för att utveckla nya förbättrade ärtlinjer.

De transgena ärtplantorna representerar de första baljväxterna som uppvisar PDR mot potyvirus och några av de första experimentella exemplen i Leguminosae på plantor som uppvisar PTGS. Det var därför värdefullt att fastställa att de principer som styr PTGS och resistens i detta system stämde överens med de principer som kännetecknas av mer vanligt förekommande försöksväxter (t.ex. Nicotiana spp.). Som förväntat för PTGS var den inducerade virusresistensen förknippad med nedbrytning av transgen-RNA och PSbMV-RNA . Vi visade också att PTGS förmedlades i dessa växter av en systemisk signal som genererades under den inledande fasen av virusinfektion, och att denna signal hade potential att förmedla spridningen av PTGS genom att inducera metylering i den transkriberade regionen av NIb-transgenen .

Slutsatsen är att vi har insett att jordbruksindustrin skulle gynnas av att ha en stabil och effektiv resistens mot PSbMV i ärter. Den minst kontroversiella vägen för att uppnå detta skulle vara att införliva naturligt förekommande resistens (antingen mot frööverföring eller mot virusreplikation) med hjälp av konventionella förädlingsstrategier. Vår relativt dåliga förståelse av den genetiska komplexiteten i överföringen av PSbMV-frön innebär att det är osannolikt att detta är användbart på kort sikt. sbm-gener är mer lovande även om bristen på nära kopplade genetiska markörer och resistensens recessiva karaktär skapar vissa svårigheter. Alternativt har vi visat att det finns potential för att skapa resistens genom tillämpning av transgen teknik, även om frågorna om biosäkerhet och allmänhetens acceptans måste lösas. Förutom dessa tillämpade överväganden har forskningen genererat och genererar material och kunskap som kommer att påverka hur relaterade metoder kan användas i andra grödor. Det är särskilt viktigt att förstå verkningsmekanismerna hos en ny klass av virusresistensgener.