Discussion

Denna studie identifierade ett antal distinkta egenskaper hos collaterala ECs och SMCs som kan ligga till grund för eller bidra till de unika egenskaperna hos collateraler som beskrevs i inledningen. Vi fann att trots den låga och oscillerande skjuvspänning som finns i kollateraler vid baslinjen i avsaknad av obstruktion, är deras ECs inriktade på kärlets axel i samma grad som finns i de distalaste arteriolerna och i den nedåtgående aorta-kärlen – kärl med ortograd laminarflöde med hög hastighet. Endotelceller i både kollateraler och arterioler har primära cilier, och kollateraler har färre av dem. Glattmuskelcellerna i kollateraler är kontinuerliga, till skillnad från dem i DMAs. Collateraler har högre nivåer av uttryck av gener som är associerade med både pro- och antiinflammatoriska och pro- och antiproliferationsvägar, jämfört med DMAs. En tendens till högre cellproliferation i collaterala murala celler stöds av observationen att collaterala celler börjar få tortuositet strax efter att de bildats i embryot och att den ökar under medelåldern (16 månader, 49 människoårsekvivalenter). Ovanstående fynd ger insikter i strukturella och molekylära specialiseringar som kan ligga till grund för de unika egenskaperna och funktionerna hos kollaterala kärl.

Konvergens av blodflödet i kollaterala kärl vid baslinjen medför låga och ”störda” flödes- och skjuvspänningskrafter på deras muralceller, dvs. antingen avsaknad av flöde eller ett mycket lågt flöde som oscillerar fram och tillbaka (~1-10 gånger per minut) och i genomsnitt är noll . Detta resulterar i ökad väggspänning enligt Bernoulli-förhållandet. När den förekommer på andra ställen i den arteriella cirkulationen, t.ex. vid bifurkationer, aortans inre båge eller nedströms från plack, gynnar låg och störd skjuvspänning en icke-justerad, kullerstensformad EC-morfologi som är förknippad med ökad oxidativ stress, inflammation, markörer för åldrande och låg eNOS/NO-aktivitet (dvs. endotelisk dysfunktion) . Överraskande nog fann vi dock att kollaterala EC har samma inriktning (och celldimensioner) som EC i DMA och den nedåtgående aorta. Vi undersökte inte hur denna antiinflammatoriska strukturella fenotyp specificeras. Det är möjligt att en eller flera av de andra unika egenskaper som vi identifierade är inblandade (se nedan). Å andra sidan erhölls data i figur 2 för flöde och skjuvspänning i bedövade djur. Under vakna beteenden kan collateraler ha perioder av ihållande flöde i den ena eller andra riktningen som induceras av förändringar i den regionala metaboliska aktiviteten i det område som försörjs av de arteriella träd som de korsförbinder. Det är inte känt om collateraler på detta sätt bidrar till fysiologisk metabolisk reglering av blodflödet och syretillförseln, dvs. neurovaskulär koppling i hjärnan och funktionell hyperemi på andra ställen. Sådana perioder av ihållande enkelriktat flöde skulle dock kunna främja den EC-orientering som vi observerade. Oberoende av den underliggande orsaken spekulerar vi i att den riktade fenotypen hos kollaterala EC är en del (eller en markör) av en grupp skyddsmekanismer som gynnar upprätthållandet av kollateraler och mildrar deras förtunning (figur 9).

Såvitt vi vet är detta den första rapporten som visar att ECs som kantar kollateraler och arterioler har primära cilier. De är mycket rikligare än vad som tidigare rapporterats för ledningskärl från friska individer (dvs. saknas eller finns på mindre än 1 % av ECs ): 18 % av kollaterala ECs har PrC jämfört med 28 % för DMAs. Primära cilier på ECs beskrevs 1984 av Haust i aorta hos kaniner och människor med ateroskleros . Senare rapporter beskrev cilierade EC i kapillärer i tallkottkörteln hos ett 20 veckor gammalt mänskligt foster , i utvecklingen av hjärtat och aortaklaffbladen , och referenser däri], kring aterom, ektopiskt i ApoE-/-musens halspulsåder och hos friska individer vid bifurkationer av ledningsartärer och den inre krökningen av aortabågen; i motsats till detta saknas cilier eller är nästan obefintliga i områden av artärerna där skjuvspänningen är lamellär . De flesta andra celltyper uttrycker PrC under utveckling, under vissa förhållanden i cellkultur och hos vuxna . Beroende på celltyp deltar PrC i specificering av embryoasymmetri, centrioldisposition, proliferation/cellcykelreglering, autofagi, flödessensorisk mekanotransduktion, kemoception samt kompartmentalisering och trafikering av signalproteiner mellan ciliplasma, cytoplasma och nukleoplasma (t.ex. för Gli och PDGFRα) . När de finns är cilierna mest rikligt förekommande i icke-prolifererande celler, med den proximala änden förankrad i en invagination av plasmalemma (ciliär ficka) i EG och andra men inte alla celltyper . Primära cilier är sammansatta med modercentriolen i den basala kroppen som är kopplad till det mikrotubulära organiseringscentret (MTOC) . Ciliens nedmontering/resorption under S-fasen och centriolens frigörelse är nödvändiga för celldelningen . Eftersom PrC är kopplade till cytoskelettet via MTOC kan flödesinducerad ciliär böjning i ECs överföras genom hela cellen, inklusive till cell-cell- och cell-matrix-övergångar . Primära cilier överför skjuvspänning i njurtuberkulära epitelceller och EG genom en väg som är exceptionellt känslig för skjuvspänning och som involverar polycystin-1 och polycystin-2, som kodas av Pkd1 och Pkd2 . Polycystin-1 har mekanosensitiva egenskaper medan polycystin-2 är en TRP-kalciumkanal. Båda proteinerna krävs för att känna av skjuvstress och i sin tur frigöra kväveoxid . Defekter i PrC är förknippade med många avvikelser. Mutationer i PKD1 och PKD2 är till exempel orsaken till autosomal dominant polycystisk njursjukdom, där EC- och tubulära celler i njurarna hos patienterna uppvisar bristfälliga kalcium- och NO-svar och ökad proliferation .

Primära cilier saknas i EC från humana navelsträngar som hålls under laminär skjuvstress och proliferativ vila i cellkultur. I mänskliga navelsträngar har mindre än en procent av ECs cilier som sticker ut i lumen, medan i en större fraktion är cilierna lokaliserade intracellulärt . Embryonal aorta och EC som odlats från den har ett enda cilium som sticker ut i lumen . Endotelcellerna finns i områden med hög skjuvstress under embryonalutvecklingen, tillsammans med uttryck av den skjuvstresskänsliga transkriptionsfaktorn KLF2, som transaktiverar eNOS och andra antiinflammatoriska och antiproliferativa gener . I områden med låg eller störd skjuvspänning är PrC nedmonterade/frånvarande och uttrycket av Klf2 och eNOS är avskaffat respektive reducerat . Uttrycket av Klf2 hämmas också i icke-cilierade ECs som isolerats från embryonala artärer, och kemiskt avlägsnande av PrC från ECs i kultur har en liknande effekt, dvs. att uttrycket av Klf2 avskaffas . Intressant nog uttrycks cilier ektopiskt i EC från vuxna ApoE-/- möss, som har endoteldysfunktion men inte utvecklar plack, i den gemensamma halspulsådern trots förekomsten av laminärt flöde, jämfört med vildtypmöss som saknar cilier . Ciliorna försvann när hög skjuvspänning inducerades genom att man placerade en flödesbegränsande gips runt kärlet. Gjutning av karotis i vilda möss inducerade ciliogenes endast i områden med låg och störd skjuvspänning. Dessa resultat tyder på att uttrycket av PrC på ECs in vivo hos vuxna är begränsat till regioner med låg/störd skjuvspänning men kan förekomma ektopiskt i artärer med laminärt flöde i närvaro av endotelisk dysfunktion orsakad av hyperlipidemi och möjligen andra vaskulära riskfaktorer. Det är värt att notera att i områden med mycket cilierade, störda flödesområden, t.ex. den inre krökningen av aortabågen eller nedströms från plack, har cirka 25 % av EC ett enda cilium medan resten saknar cilium , en procentsats som liknar den som vi har observerat i arterioler och kollateraler.

Våra fynd att PrC också finns på arterioler och kollateraler hos friska unga vuxna möss understryker behovet av studier som undersöker ciliefunktionen i dessa kärltyper. Detta inkluderar att fastställa om vår observation av färre cilier på kollaterala EC än arterioler har funktionell betydelse. Endotelceller är kopplade mekaniskt, elektriskt och diffusionsmässigt till intilliggande ECs och SMCs , vilket innebär att endast en bråkdel av ECs kanske behöver uttrycka cilier för att överföra mekaniskt känsliga eller andra signaler. Hög skjuvspänning orsakar en nedmontering av cilier i odlade EG-celler, medan en oscillerande flödesomvändning framkallar deras uttryck. Vi spekulerar i att cilier på arteriole- och kollaterala EC kan återspegla det lägre flödet/skjuvspänningen i arterioler och det mycket låga och störda flödet i kollateraler och att färre PrC på kollaterala EC kan bidra till att minska deras känslighet för den rådande störda skjuvspänningsmiljön. Med andra ord kan färre cilier på kollaterala EC vara en del av en repertoar av anpassningar som balanserar eller motverkar – genom bibehållet eller ökat uttryck av KLF2/4, eNOS och andra antiinflammatoriska/antiproliferativa faktorer – de låggradiga inflammatoriska, oxidativa, proliferativa och apoptotiska signalerna som främjas av den störda hemodynamiska miljön i kollaterala kretsar (figur 9). Egorova et al. föreslog något liknande, dvs. att eftersom närvaron av PrC på EC är förknippad med KLF2-uttryck, kan endotelceller signalera en broms på EC-aktivering i områden med lågt och stört flöde. En skyddande roll för cilier i dessa regioner stöds av den senaste rapporten om att avlägsnande av endoteliska cilier med hjälp av villkorlig deletion av Ift88 ökade ateroskleros och inflammatoriskt genuttryck och minskade eNOS-aktiviteten hos Apoe-/- möss som utfodrats med en fettrik diet , och att endotelet blir känsligt i atero-benägna regioner för att genomgå osteogen differentiering hos Tg737 (orpk/orpk) ciliumdefekta möss . Det är också möjligt att om PrC är skyddande kan färre av dem i kollaterala kärl bidra till att dessa kärl är mycket känsliga för förtunning på grund av åldrande och andra vaskulära riskfaktorer. Färre cilier i kollaterala kärl kan dock helt enkelt återspegla en sekundär effekt eller en bieffekt, till exempel en följd av en högre inneboende proliferationshastighet hos kollaterala ECs, vilket framgår av den progressiva ökningen av kollaterala tortuositet (diskuteras nedan), eftersom närvaron av PrC och deras förening med basalkroppen tros gynna avlägsnande av celler från cellcykeln . Framtida studier kommer att krävas för att avgöra om vårt fynd av multipla cilier på ECs återspeglar ECs som har genomgått proliferativ senescens och associerad misslyckad cytokinesis och nukleär polyploidi .

Det har nyligen visats att ECs i musens näthinna under utveckling är beroende av PrC för att stabilisera kärlförbindelserna under remodellering av det vaskulära plexuset i regioner med låg till intermediär skjuvspänning . Endotelceller känner av flödet i zebrafiskembryon, deltar i rekryteringen av murala celler till kärl med artärfäste och krävs för normal vaskulär morfogenes . Antalet och diametern av kollateraler minskar med början i medelåldern . Denna åldersinducerade minskning påskyndas kraftigt av genetisk eller farmakologiskt inducerad eNOS/NO-brist eller förekomst av vaskulära riskfaktorer . Ökad skjuvspänning inducerar en utåtriktad remodellering av kollateralerna efter akut eller långsamt utvecklande arteriell obstruktion . Pkd1+/- möss och patienter med autosomal dominant polycystisk njursjukdom har endotelial eNOS/NO-dysfunktion . Det kommer att vara viktigt att i framtida studier undersöka om kollaterala PrC deltar i en eller flera av ovanstående funktioner med hjälp av EC-specifik knockdown av polycystin-1, eftersom: 1) brist på det leder till förändrad ciliär funktion, 2) polycystin-1 tillsammans med polycystin-2 deltar i flödessensorering av PrC, 3) muterade former av båda proteinerna orsakar polycystisk njursjukdom, 4) det finns bevis för att VHL, oberoende av sin roll i nedbrytningen av Hif1α, tillsammans med GSK3β krävs för strukturellt underhåll av cilium , och 5) proteinet Rabep2, som krävs för kollaterogenes, är ett nytt substrat för GSK3β , lokaliseras vid cilium-basalkroppskomplexet och knockdown av det leder till defekt ciliogenes . Andra metoder för att störa ciliernas närvaro och funktion, t.ex. genom knockdown av andra cilierproteiner som Pkd2 och Ift88, måste också undersökas.

I motsats till distala arterioler, som har glesa och diskontinuerliga SMC i olika vävnader inklusive näthinnan (vi kunde inte identifiera studier i hjärnan) , var SMC kontinuerliga på kollateraler. Vi spekulerar att detta kan vara en adaptiv ökning av väggtjockleken för att balansera ökningen av den cirkumferentiella väggspänningen som orsakas av den Bernoulli-specificerade omvandlingen av flödets kinetiska energi till ökad potentiell energi (transmuralt tryck) som en följd av flödeskonvergens i kollateraler. Det skulle vara intressant att undersöka om sammansättningen och mängden extracellulär matris, som skulle kunna hjälpa SMC att balansera den ökade väggspänningen i kollateraler, skiljer sig åt i kollateraler jämfört med arterioler. Noterbart är att collateraler, trots sin ökade SMC-täckning, har mindre snarare än mer tonus jämfört med arterioler av liknande storlek och saknar myogen responsivitet – ytterligare unika egenskaper hos kollaterala kärl .

Den störda hemodynamiska, pro-oxidativa miljön som collaterala muralceller befinner sig i ledde till att vi undersökte om uttrycket av gener som är involverade i inflammation, cellproliferation, åldrande och angiogenes skiljer sig åt för collateraler jämfört med distala arterioler. Collateraler uppvisade ökade mRNA-nivåer för den proinflammatoriska, proapoptosinflammasomgen Pycard, de proproliferativa generna Ki67, Pdgfb och Angpt2, den antiproliferativa genen Dll4 och den differentierade EC-markörgenen av arteriell typ Ephrinb2. Uttrycket av cellcykelhämmande gener, p21, p27 och p53, skiljde sig dock inte åt, inte heller andra gener som förknippas med proliferation, cellcykelstopp och åldrande (p16Ink4a, Ampk, Sirt1, telomeras). Det fanns inte heller några skillnader i uttrycket av andra gener som är förknippade med proliferation av EC och/eller SMC (Vegfa, Flk1, Clic4, Pdgfa, Flt1) och som krävs (när det gäller de tre förstnämnda generna ) för bildandet av kollateraler under utvecklingen eller som är involverade i specificering av EC- och SMC-differentiering och quiescens (Tgfb, Angpt1). Ett ökat uttryck i kollaterala kärl av ovanstående proproliferationsgener stämmer överens med våra tortuositetsmätningar, som tyder på att kollaterala murala celler har en högre proliferationshastighet jämfört med andra artärkärl: kollaterala tortuositeter var uppenbara redan första dagen efter födseln, fortsatte att öka fram till medelåldern för att sedan minska. Det senare inträffade samtidigt som kollateraler upplever en minskning i antal och diameter med avancerat åldrande . Dessa fynd stöder hypotesen att åldersassocierad kollaterala förminskning orsakas av proliferativ senescens och efterföljande apoptos hos kollaterala EC- och SMC-kretsar på grund av en livslång ökning av proliferationshastigheten som orsakas av den störda hemodynamiska miljön med låg syrehalt i blodet där kollaterala kranskärl befinner sig (figur 9).

Kollateraler uppvisade också ökad aktivitet av eNOS, vilket tidigare studier har visat motverkar förtunning av kollateraler orsakad av åldrande och andra vaskulära riskfaktorer . eNOS-derivat NO hämmar oxidativ stress, inflammation, proliferation, leukocytadhesion, trombocytaggregation och cellulärt åldrande och främjar SMC-avslappning . Eftersom skjuvspänning är en närliggande stimulus för eNOS-deriverat NO, kan ökad eNOS/NO i kollateraler med sin låga och störda skjuvspänningsmiljö minska effekten av faktorer som främjar kollaterala sällsynthet (figur 9). På samma sätt kan ett bibehållet uttryck av transkriptionsfaktorerna Klf2 och Klf4, som är känsliga för skjuvspänning, i kollateraler trots det låga och oscillerande flödet, vilket hämmar uttrycket av dessa faktorer på andra ställen i det arteriella kärlsystemet med stört flöde, fungera som ytterligare ”balanserande” faktorer eller specialisering av kollateraler, tillsammans med ökad eNOS, alignerade EC:s, färre cilier, robust SMC-täckning och ökad ephrin-B2 och Dll4. Uttrycket av KLF2 och KLF4, som negativt reglerar proliferation, inflammation och angiogenes, uppreglerar eNOS och kraftigt nedregleras på platser med låg och störd skjuvspänning, skilde sig inte åt i collateraler jämfört med DMA. Intressant nog främjar PrC uttrycket av Klf2, Klf4 och eNOS .

En begränsning i ovanstående studier är att RNA erhölls från dissekerade kärl, som består av ECs, SMCs och, om än i mindre utsträckning, pericyter, fibroblaster och residenta myeloida celler. Det behövs studier där man separerar olika celltyper och undersöker ett större antal gener och deras respektive proteinnivåer. Svårigheten att manuellt dissekera collateraler och distala arterioler i erforderligt antal, effekten av celldissociationstekniker på grundnivåerna av RNA och protein, avsaknaden av cellodlingsmodeller av ”collaterala” EC:s och SMC:s och den hittillsvarande avsaknaden av en collateralspecifik markörgen utesluter dock användningen av dessa metoder. Det bör dock noteras att uttrycket av flera av de undersökta generna är specifika eller berikade för EG, t.ex. Flk1, Angpt1, Angpt2, Ephrinb2, DLL4, eNOS, Clic4, Klf2 och Klf4. Analyser av gentranskription återspeglar dock inte alltid förändringar i proteinnivå eller funktion; därför kan undersökning av oxidativ stress, inflammatoriska markörer, proliferation eller senescensmarkörer på proteinnivå bättre återspegla skillnader i cellulära egenskaper.