Cellodling, virusamplifiering och rening för SHAPE-MaP- och SPLASH-experiment

Madin-Darby Bovine Kidney (MDBK) och Madin-Darby canine kidney (MDCK) celler odlades i Minimum Essential Medium (Merck), kompletterat med 2 mM l-glutamin och 10% FCS. Stockar av WSN (H1N1)-virus framställdes genom att MDBK-celler infekterades med influensavirus med en infektionsmultiplicitet (MOI) på 0,01. Virusstockar av Udorn (H3N2) och PR8 (H1N1) (PR8) virus framställdes genom att MDCK-celler infekterades med en MOI på 0,001 i närvaro av 0,8 μg ml-1 n-Tosyl-l-fenylalaninklorometylketon (TPCK)-behandlat trypsin (Merck). Virusen samlades in 2 dagar efter infektionen. Virusen renades genom ultracentrifugering: först klargjordes det infekterade cellodlingsmediet genom centrifugering vid 4 000 r.p.m. i 10 minuter vid 4 °C följt av centrifugering vid 10 000 r.p.m. i 15 minuter vid 4 °C. Viruset renades sedan genom centrifugering genom en kudde av 30 % sackaros vid 25 000 varv per minut i 90 minuter vid 4 °C i en SW 32-rotor (Beckman Coulter). Den renade viruspelleten återuppslöts i en resuspensionsbuffert (0,01 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,1 M NaCl, 0,0001 M EDTA). Vi noterar att varken virionernas eller RNA:s tertiärstrukturer störs av ultracentrifugering30,31,32.

SHAPE-MaP

SHAPE-MaP utfördes i enlighet med publicerade procotoler17. 1-metyl-7-nitroisatosyraanhydrid (1M7) syntetiserades från 4-nitroisatosyraanhydrid enligt tidigare beskrivning33. För in vitro transkriberat RNA-experiment syntetiserades varje viralt RNA-segment från en linjär DNA-mall med hjälp av HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit (New England Biolabs). Produkterna kontrollerades med avseende på storlek och renhet på en 3,5 % polyakrylamidgelelektrofores (PAGE)-ureagel. Naked viral RNA-prover framställdes genom rening av WSN-partiklar över sackaroskudde enligt tidigare beskrivning. De renade virusen behandlades med 250 μg ml-1 proteinas K (Roche) i proteinas K-buffert (10 mM Tris-HCl, pH 7,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 % SDS) i 40 minuter vid 37 °C. Före modifieringen viktades in vitro-transkriberat RNA och prover av naket viralt RNA vid 37 °C i 30 minuter i vikningsbuffert (100 mM HEPES-NaOH, pH 8,0, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2). 1M7 (löst i vattenfri dimetylsulfoxid (DMSO; Merck)) tillsattes till en slutkoncentration på 10 mM till det vikta RNA:t och proverna inkuberades i 75 s vid 37 °C. Modifieringarna in virio utfördes genom att 1M7 tillsattes direkt till renat virus. SHAPE-MaP-reagensens förmåga att penetrera viruspartiklar testades inledningsvis enligt tidigare beskrivning34 genom att utföra 32P-märkta primerförlängningar på RNA som extraherats från SHAPE-MaP-reagensbehandlat virus med hjälp av en primer som riktar sig mot NA-segmentet (5′-AATTGGTTCCAAAGGAGACACG-3′). Parallellt med de 1M7-behandlade proverna behandlades kontrollproverna med DMSO. n-metylisatoisk anhydrid (NMIA; Thermo Fisher Scientific) SHAPE-MaP-reagenset testades också i virio. Försök med NMIA utfördes som beskrivet för 1M7, förutom att de renade virionerna behandlades med NMIA i 45 minuter.

Förberedelse av sekvenseringsbibliotek utfördes som tidigare beskrivet17 i enlighet med arbetsflödet för randomer. I korthet, efter 1M7- eller kontrollbehandling renades RNA med hjälp av RNA Clean & Concentrator-5 Kit (Zymo Research). RNA:t omvänt transkriberades med hjälp av Random Primer Mix (New England Biolabs) med SuperScript II (Invitrogen) i MaP-buffert (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 75 mM KCl, 6 mM MnCl2, 10 mM dithiothreitol och 0,5 mM deoxynukleosidtrifosfat). Nextera XT DNA Library Prep Kit (Illumina) användes för att förbereda DNA-biblioteken. De slutliga PCR-amplifieringsprodukterna storlekssorterades med Agencourt AMPure XP Beads (Beckman Coulter) och kvalitetsbedömdes med Agilent DNA 1000-kit (Agilent Technologies) på ett Bioanalyzer 2100-system (Agilent Technologies). För WSN, naket viralt RNA och in vitro transkriberat RNA sekvenserades biblioteken (2 × 150 baspar (bp)) på ett HiSeq 4000-system (Illumina). För PR8- och Udorn-virus sekvenserades biblioteken (1 × 150 bp) på ett NextSeq 500-system (Illumina).

SPLASH

SPLASH-proverna framställdes som tidigare publicerats24,35, med vissa ändringar, för två replikat vardera av WSN-, PR8- och Udorn-virus och ett enda replikat för vart och ett av H3N2-reassortantvirusen. Det renade viruset inkuberades med 200 μM EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin (Thermo Fisher Scientific) och 0,01 % digitonin (Merck) i 5 minuter vid 37 °C. Viruset spreds på en 6-brunnsskål, täcktes med en glasplatta, placerades på is och bestrålades i 45 minuter med en UVP Ultra Violet Product Handheld UV Lamp (Thermo Fisher Scientific). Korsbundet virus behandlades med proteinas K och viralt RNA extraherades med TRIzol (Invitrogen). En alikvot av extraherat viralt RNA användes för att detektera biotininkorporering med hjälp av ett kemiluminiscent Nucleic Acid Detection Module Kit (Thermo Fisher Scientific) på ett Hybond-N-nylonmembran (GE Healthcare Life Sciences). Resten av det extraherade virala RNA fragmenterades med hjälp av NEBNext Magnesium RNA Fragmentation Module (New England Biolabs) och storleksselekterades för fragment som var kortare än 200 nt med hjälp av RNA Clean & Concentrator-5 Kit. Proverna anrikades för biotinylerat viralt RNA med hjälp av Dynabeads MyOne Streptavidin C1-beads (Thermo Fisher Scientific); närhetsligering på beads och omvänd psoralen-korslänkning utfördes enligt tidigare publicerade uppgifter24,35. Sekvenseringsbibliotek framställdes med hjälp av det kommersiella SMARTer smRNA-Seq-kitet (Clontech Laboratories). Det slutliga storleksurvalet gjordes genom att köra de PCR-amplifierade sekvenseringsbiblioteken på en 6 % PAGE-gel (Thermo Fisher Scientific) i Tris/borsyra/EDTA (TBE), med urval av 200-300 bp DNA. Biblioteken sekvenserades 1 × 150 bp på ett NextSeq 500-system.

Bearbetning av SHAPE-MaP-sekvenseringsavläsningar

Sekvenseringsavläsningar trimmades för att ta bort adaptrar med hjälp av Skewer v0.2.2 (ref. 36). SHAPE-MaP-reaktivitetsprofilerna genererades med hjälp av den publicerade ShapeMapper2-pipeline37 , som anpassar reads till referensgenomet och beräknar mutationsfrekvensen vid varje nukleotidposition. Mutationshastigheterna omvandlas sedan till SHAPE-MaP-reaktivitetsvärden som definieras som:

där mutr1M7 är nukleotidmutationsfrekvensen i det 1M7-behandlade provet och mutrDMSO är mutationsfrekvensen i det DMSO-behandlade provet. Alla SHAPE-MaP-reaktiviteter normaliserades till en ungefärlig skala 0-2 genom att dividera SHAPE-MaP-reaktivitetsvärdena med den genomsnittliga reaktiviteten för de 10 % mest högreaktiva nukleotiderna efter att ha uteslutit outliers (definierade som nukleotider med reaktivitetsvärden som är >1,5 interkvartilområdet). Hög SHAPE-MaP-reaktivitet indikerar mer flexibla (dvs. enkelsträngade) regioner av RNA och låg SHAPE-MaP-reaktivitet indikerar mer strukturellt begränsade (dvs. basparade) regioner av RNA.

Bearbetning av SPLASH sekvenseringsreads

Sekvenseringsreads trimmades för att avlägsna adaptrar med hjälp av Skewer v0.2.2 (ref. 36). STAR v.2.5.3 (ref. 38) användes för att anpassa läsningarna till det lämpliga virusreferensgenomet (kompletterande tabell 2). Endast de chimära läsningar där minst 20 nt anpassades till referenssegmenten användes i den fortsatta bearbetningen (STAR-parameter: -chimSegmentMin 20). Chimeriska läsningar deduplicerades med hjälp av CIGAR-strängar och positioner för anpassning. CIGAR-strängar i varje läsningskonfiguration bearbetades för att hitta läsningens start- och slutkoordinater. Koordinaterna för de chimära läsningarna användes för att ta fram en matris av sekvensinteraktioner i R-programvaran. Diskreta loci i matrisen valdes ut och anpassades individuellt med en Gauss-kurva baserad på läsöverlappningsintensiteten för att definiera ett interaktionsfönster; interaktionsfönster med komplexa överlappande loci separerades i enskilda fönster. Interaktionsfönstrets bredd användes för att bestämma start- och slutkoordinaterna för varje interaktion. Antalet läsningar som låg inom (eller delvis inom) denna region användes som ett mått på interaktionsfrekvensen. För generering av figurer visualiserades de 20 bästa interaktionerna i varje virus med hjälp av cirklize-paketet v.0.4.5 (ref. 39) i R v.3.5.1. Den fullständiga uppsättningen interaktionslokaler finns i kompletterande tabell 2. För qPCR-validering av interagerande loci förbereddes och anrikades psoralen-korslänkade prover på samma sätt som tidigare beskrivits, men med en förkortad fragmenteringstid (3 jämfört med 4 min) för att generera längre RNA-fragment. RNA polyadenylerades med Poly(A) Polymeras (Takara Bio) och komplementärt DNA genererades med smRNA dT Primer (Takara Bio) och PrimeScript Reverse Transcriptase (Takara Bio) enligt tillverkarens instruktioner. En qPCR med 50 cykler utfördes enligt tillverkarens anvisningar på ett StepOnePlus-instrument (Applied Biosystems) med hjälp av Brilliant II SYBR Green QPCR Master Mix with ROX (Agilent Technologies) och primerpar för att testa intersegmentinteraktioner. Primersekvenser finns i kompletterande tabell 3. Efter 50 cykler av qPCR-amplifiering löstes produkterna upp med 8 % PAGE (29:1 akrylamid/bisakrylamid, 1× TBE-buffert) och visualiserades med transilluminering med blått ljus.

RNA-strukturförutsägelser

The IntaRNA algorithm v.2.3.1 (ref. 40) användes för att förutsäga förmågan hos RNA-RNA-interaktioner att förekomma i de regioner som identifierades under SPLASH-analysen, med hjälp av alternativen Exact mode (-mode E) och no seed constraint (-noSeed). SHAPE-MaP-reaktivitet inkluderades i modelleringen av RNA-RNA-interaktioner (-tShape och -qShape). Permuterade dataset genererades genom att slumpmässigt blanda de specifika interaktionspartners som identifierats av SPLASH och bedöma interaktionens ΔG-energier med hjälp av IntaRNA. Signifikansen av skillnaden mellan sannolikhetsfördelningarna av ΔG-energierna i samband med de SPLASH-identifierade intermolekylära RNA-interaktionerna jämfört med de permuterade datasetten beräknades med hjälp av Wilcoxon rangsummetestet i R-programvaran. IntaRNA-strukturprediktionerna användes sedan för att trimma interaktionsregionerna till de nukleotider som är involverade i basparningen. I de fall SHAPE-MaP-data inte var tillgängliga (PR8-reassortanter med H3N2-virus) inaktiverades förvecklingen av varje RNA-sträng (”tillgänglighet”) i IntaRNA (-qAcc = N -tAcc = N). För validering mot kända strukturer extraherades data om RNA:s sekundärstruktur från databasen RNA3Dhub41 , baserat på strukturerna för kryogen elektronmikroskopi av 80S-ribosomen42 (PDB: 6EK0) och från det tredubbla lilla nukleära ribonukleoprotein-spliceosomala komplexet U4/U6.U543 (EMDB: EMD-2966). Referens-RNA-sekvenser korrigerades för att matcha sekvenser från nötkreatur (MDBK) för ribosomalt RNA och U4/U6 små nukleära RNA:er enligt tidigare beskrivning44. För intramolekylära RNA-strukturprediktioner användes paketet ViennaRNA v.2.0 (ref. 45). Kommandot RNAfold användes för att förutsäga sekundära RNA-strukturer och partitionsfunktioner för varje segment. SHAPE-MaP-reaktivitet inkluderades som pseudoenergibegränsningar. En korrelationsanalys med ett glidande medianfönster på 50 nt mellan SHAPE-MaP-reaktivitetsprofilerna ex virio och in virio användes för att bestämma omfattningen av SHAPE-MaP-korrelationen mellan T7-transkriberat och vRNP-associerat RNA. Vi fann att det inte fanns någon korrelation >150 nt. Därför satte vi begränsningen för det maximala parningsavståndet för förutsägelser av struktur och partitionsfunktion till 150 nt. För intramolekylära strukturprediktioner ställde vi in nukleotiderna inom promotorregionen som enkelsträngade.

Cellodling för reverse-engineering av influensavirus

MDCK-celler och mänskliga embryonala njurceller (HEK 293T) hämtades från en befintlig samling vid institutionen för mikrobiologi och immunologi, University of Melbourne. MDCK-celler odlades i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium (Sigma-Aldrich) och HEK 293T-celler odlades i DMEM (Thermo Fisher Scientific). Båda medierna kompletterades med 10 % värmeinaktiverat FCS, 2 mM l-glutamin, 2 mM natriumpyruvat, 24 μg ml-1 gentamicin, 50 μg ml-1 streptomycin och 50 IU ml-1 penicillin. Kokulturer av MDCK-celler och HEK 293T-celler för transfektion upprättades i Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific) med 50 μg ml-1 streptomycin och 50 IU ml-1 penicillin.

Konstruktion av omvända influensavirus

Enskilda gensegment från PR8-, Udorn-, Mem71- (H3N2-), PC73- (H3N2-) och Wyo03- (H3N2-) virus transkriberades omvänt och klonades in i pHW2000-plasmider46. De virus som härstammade från omvänd genetik innehöll antingen en PR8-, Udorn-, Mem71-, PC73- eller Wyo03-PB1-gen med antingen en vildtyp eller modifierad NA-gen i en genetisk bakgrund som omfattade sex segment från PR8-viruset (PB2, PA, HA, NP, M och NS). Den modifierade NA-genen (Wyo03UdSub) härstammade från Wyo03 och innehöll fyra substitutioner mot Udorn-NA-sekvensen: nukleotiderna G943A, C938U, U933C och G923A. Tre av dessa fyra nukleotidändringar var tysta, medan den fjärde (A534G) resulterade i en konservativ förändring från lysin till arginin (K172R). Komplementära fragment som innehåller dessa förändringar genererades genom PCR och sammanfogades genom ytterligare en omgång PCR med segmentspecifika primers som innehåller BsmBI-restriktionsplatser47; produkten klonades in i pHW2000-uttrycksvektorn för virusräddning. Primersekvenser finns i kompletterande tabell 3. Räddade virus amplifierades i 10-d embryonerade hönsägg. Infektiös allantoisk vätska titrerades för virusinnehåll genom plackbildning i MDCK-celler48 och förvarades vid -80 °C.

Bestämning av virusreplikationskinetik för omvända virus

Replikationsegenskaperna hos de omvända virusen bestämdes genom att infektera MDCK-celler vid en MOI på 0,01. Efter 1 h absorption (vid t = 0 h) avlägsnades inokulumet och cellerna tvättades och inkuberades vid 37 °C, 5 % CO2 i RPMI 1640 kompletterat med 2 mM l-glutamin, 2 mM natriumpyruvat, 24 μg ml-1 gentamicin, 50 μg ml-1 streptomycin, 50 IU ml-1 penicillin och 1 μg ml-1 TPCK-behandlat trypsin (Worthington Biochemical Corporation). Cellkulturens supernatanter samlades upp vid olika tidpunkter efter infektionen och förvarades vid -80 °C för analys. Virustitrar bestämdes genom plackbildning på konfluenta monolager av MDCK-celler.

Nine-plasmid competitive reverse-engineering av influensavirus

Kompetitiv reverse-engineering av influensavirus genomfördes med hjälp av en modifierad version av det omvända genetiska systemet med åtta plasmider26 enligt tidigare beskrivning25. Kort sagt, plasmider som kodar för de virala RNA-segmenten PB2, PB1, PA, hemagglutinin (HA), nukleoprotein (NP), matrixprotein (M) och icke-strukturellt protein (NS) från PR8 samtransfekterades med plasmider som kodar för viralt RNA av neuraminidas (NA) och konkurrerande viralt RNA av PB1 från antingen Udorn, Mem71, PC73 eller vildtyp eller modifierad Wyo03. Varje plasmid (1 µg) blandades med FuGENE 6 transfektionsreagens (Promega) i Opti-MEM och tillsattes till en kokultur av HEK 293T- och MDCK-celler. Sex timmar efter transfektionen ersattes media med Opti-MEM kompletterat med 50 μg ml-1 streptomycin och 50 IU ml-1 penicillin. Tjugofyra timmar senare tillsattes TPCK-behandlat trypsin (1 μg ml-1) och supernatanten samlades upp efter ytterligare 42 timmar och förvarades vid -80 °C. För att bestämma inkorporeringsfrekvenserna för de konkurrerande PB1-generna utsattes progenyvirusen i transfektionens supernatant för en plackanalys i MDCK-celler. Slumpmässigt utvalda plack (cirka 36 per experiment) plockades genom provtagning genom agarosen och resuspenderades i 0,05 % Triton-X100. Källan till de konkurrerande gensegmenten identifierades genom genspecifik kvantitativ RT-PCR med hjälp av SensiFast probe no-ROX one-step RT-PCR Kit (Bioline). Varje 20 μl reaktion utfördes med hjälp av 5 μl plackplockad virussuspension, 10 μl 2× SensiFast SYBR No-ROX One-Step mix, 0,2 μl omvänt transkriptas, 0,4 μl Ribosafe RNashämmare, 0,8 μl av varje 10 μM genspecifik framåt- och bakåtriktad primer och 0,08 μl av varje 25 μM genspecifik sond. Primer- och sondsekvenser finns i kompletterande tabell 3. RT-PCR-reaktionen inkuberades i 10 minuter vid 45 °C innan qPCR-amplifiering påbörjades enligt tillverkarens anvisningar. De rapporterade värdena är kombinerade data från 3-8 oberoende transfektionsexperiment för varje tävling.

Rapporteringssammanfattning

Fördjupad information om forskningsdesign finns i Nature Research Reporting Summary som är länkad till denna artikel.