Abstract
Detta arbete visar att en detaljerad beskrivning av ultrastrukturen av de sekretoriska cellerna i den sydamerikanska havskatten Rhamdia quelens bukspottkörtelns öar presenteras. Bevis erbjuds för att stödja påståendet att α-granulerna består av en central och en yttre del med olika elektrontäthet och löslighet, att δ-cellerna troligen är morfologiskt förändrade men livskraftiga α-celler, och att β-granulerna möjligen har en upprepad substruktur och därför kan representera en intracellulär kristallin lagringsform av insulin.
1. Introduktion
De Langerhanska öarna upptäcktes hos kaninen av Langerhans 1869. De rapporterades dock av Stannius och Blockmann i teleoster ungefär 20 år tidigare och kallas därför också, även om det är mindre vanligt, för Stannius eller Blockmanns kroppar. Langerhans öar är av endodermalt ursprung och hos de flesta teleoster finns de som små kroppar utspridda i den exokrina delen av bukspottkörteln.
Fisken har ingen separat bukspottkörtel. Exokrin bukspottkörtelvävnad kan hittas utspridd längs tarmkanalen. Den exokrina bukspottkörtelns acinära struktur är mycket lik den hos däggdjur och består av celler med en mycket mörk, basofil cytoplasma . Hos fiskar som äter aktivt innehåller de ett stort antal ljusa eosinofila, sekretoriska granuler. Den endokrina bukspottkörteln Langerhansöarna kunde urskiljas, och vävnaden omfattar α-celler (som producerar glukagonliknande peptid), β-celler (som producerar insulin) och d-celler (som producerar somatostatin) . Hos däggdjur och människor har de flesta av de tidigare elektronmikroskopiska beskrivningarna av vuxna mänskliga bukspottkörtelns öar varit kortfattade och mindre delar av publikationerna har främst ägnats åt beskrivningar av β-cellstumörer eller översiktsartiklar som diskuterar den jämförande morfologin hos öarna hos flera arter .
Fiskens bukspottkörteln visar sig inte ofta vara en färdig källa till vävnad för elektronmikroskopiska studier. Huvudfiskens bukspottkörtel är både anatomiskt och utvecklingsmässigt lik däggdjurens bukspottkörtel, medan stora skillnader är uppenbara hos andra fiskarter. Hos vuxna zebrafiskar innehåller huvudpankreas flera huvudsakliga öar omgivna av exokrin vävnad. En svans av enskilda öar inbäddade i exokrin vävnad och fett sträcker sig kaudalt längs tarmen. Däremot sitter β-cellerna hos tilapia (en annan glukoskänslig teleostfisk) i Langerhanska öar som är belägna längs mesenteriet och som inte är omgivna av exokrin vävnad . Rhamdia quelen är en teleostfisk och är en viktig art för vattenbruk i subtropiskt klimat. R. quelen finns från södra Mexiko till centrala Argentina, och uppfödning av denna art sprider sig mot södra Brasilien .
I den här studien analyserar vi ultrastrukturen hos de Langerhanska öarna och beskriver i detalj de olika typerna av sekretoriska celler hos sydamerikansk havskatt R. quelen.
2. Material och metoder
Fyra odlade R. quelem två honor och två hanar ( g; cm) från Centro Nacional de Desarrollo Acuícola (CENADAC) i den nordöstra delen av Argentina och placerades i 200 L tankar där de acklimatiserades i två veckor före obduktion. Fisken föddes upp i filtrerat sötvatten som hölls vid 25 °C med ett vattenbyte på 100 % per dag. Fotoperioden anpassades till 12 timmars mörker och 12 timmars ljus. De utfodrades för hand fyra gånger per dag med kommersiellt foder (Ganave). Fisken avlivades med bensokain (500 ppm) och nekrotiserades och prover av fett som sträcker sig kaudalt längs tarmen fixerades i 10 % buffrat formalin, bäddades in i paraffin och färgades med hematoxylin och eosin (H&E).
Små vävnadsfragment skars i 1 mm stora block och fixerades omedelbart i fosfatbuffrad glutaraldehyd (pH 6.9 vid 4°C), tvättades i Millonigs lösning och postfixerades i 1 % osmiumtetroxid. Vävnadsblocken dehydratiserades sedan i en graderad serie av etanol-aceton, sänktes i propylenoxid och bäddades in i Durcupan ACNI (Fluka Chemie A.G., Schweiz). Tunna snitt skars med en LKB ultramikrotom och färgades dubbelt med uranylacetat och blycitrat före undersökning i ett Jeol JEM-8T elektronmikroskop (Jeol, Tokyo, Japan).
3. Resultat
3.1. Ljusmikroskopi
R. quelen har bukspottkörteln utspridd i fettvävnaden som omger den gemensamma gallgången; detta ligger inom ett grovt triangulärt område som överst avgränsas av magsäcken, främre av levern och undre av mjälte och gallblåsa. Varje Langerhans-ö ligger i ett område som består av relativt ren ödelvävnad omgiven av en exokrin bukspottkörtel (figur 1). Inga skillnader mellan män och kvinnor observerades.
3.2. Elektronmikroskopi
Den β-cellerna, som vanligtvis upptar det inre av öarna, var vanligen, men inte alltid, separerade från den exokrina bukspottkörteln av de perifert belägna α-cellerna (figur 2). β-cellernas ultrastrukturella utseende var identiskt i proverna från de fyra fiskarna. De distinkta β-granulerna fanns i slätmembraniga säckar och var varierande i storlek och form. Rektangulära, fyrkantiga, hexagonala och oregelbundet polygonala kristaller var synliga. Runda former förekom men var mindre frekventa (figurerna 2-5). Varje granulat bestod av en eller flera kristallina eller ostrukturerade former av varierande storlek och form. Valet av fixeringsmedel tycktes inte påverka β-granulernas inre struktur. Inom det omslutande membranets gränser verkade området kring kristallerna tomt eller innehöll en fin flockig utfällning, oavsett vilket fixeringsmedel som användes. Vid högre förstoringar kunde man ibland se en upprepad substruktur i de kristaller som var korrekt orienterade i förhållande till snittplanet (figurerna 6 och 7). De många mitokondrierna var utspridda i hela cellen och syntes som runda eller fylliga filamentösa strukturer. De var större och talrikare än de i β-cellen, men vanligen mindre än de i pankreasacinarcellerna. De talrika mitokondriella cristae var för det mesta orienterade i tvärgående riktning, och mitokondriella granuler fanns men var inte framträdande. Cisternerna i det granulära endoplasmatiska retikulumet var vanligtvis korta eller vesikulära (figurerna 2-4). Det granulära endoplasmatiska retikulumet och de fria ribosomerna var inte ett lika framträdande inslag i β-cellerna som i acinar- eller β-cellerna. De β-celler med få sekretoriska granuler var normalt sett rikare utrustade med ribosomer och granulärt endoplasmatiskt retikulum, som då oftare var cisternalt utformade (figur 5).
Golgi-komplexet var mer framträdande efter aldehydfixering och de ingående strukturerna var mer dilaterade (figur 2). Efter användning av dessa fixeringsmedel var tätt amorft material ibland synligt inom Golgivesiklar och kan representera omogna granuler eller föregångare till β-sekretoriska granuler. β-cellernas kärnor var vanligen sfäriska och relativt släta i konturen. Cellmembranet i intilliggande ö-celler låg nära desmosomer, även om de inte ofta var sammanfogade med desmosomer. Vid sammanfogningen av tre eller fler celler var de begränsande membranen ofta invecklade och cellerna var snårigt sammanflätade (figurerna 2 och 9). Multivikulära cytoplasmatiska inneslutningar som liknade ceroid var iögonfallande i de flesta β-celler (figurerna 2, 7, 9 och 8). Förekomsten och frekvensen av dessa inneslutningar påverkades inte nämnvärt av den primära användningen av osminsyra eller aldehyd som fixeringsmedel, och det fanns inget uppenbart samband mellan närvaron av dessa granuler och de morfologiska bevisen på fysiologisk aktivitet hos cellerna. α-cellernas ultrastruktur var densamma i alla fyra vävnadsproverna. Storleken och formen på dessa celler och på deras kärnor skilde sig inte nämnvärt från normala β-celler (figurerna 2 och 7). Även om man ibland fann en α-cell med en oregelbundet formad eller intryckt kärna, förekom detta inte tillräckligt ofta för att fungera som ett användbart differentieringskriterium. α-cellens cytoplasmiska granuler bevarades genom primär osmiumfixering som täta, sfäriska kroppar av varierande storlek och fanns inom löst sittande glattmembranösa säckar (figurerna 7 och 9). De var större än β-granulerna, men betydligt mindre än zymogengranulerna i acinarcellerna (figur 2). De slanka, långsträckta mitokondrierna var måttligt många och mindre än β-cellernas och hade cristae som vanligtvis var orienterade i tvärled. Det granulära endoplasmatiska retikulumet var ofta cisternformigt och rikligare än i β-cellerna (figur 9). Golgikomplexet var, när det var synligt, av måttliga proportioner. Täta amorfa material inom Golgivesiklar och cisterner, troligen föregångare till de sekretoriska granulerna, var vanligare i α-celler än i β-celler (figur 10). Ceroidkroppar, även om de ofta var synliga, var mindre talrika än i β-cellerna (figurerna 2 och 3). Säckarna i vilka α-granulerna är belägna verkade därför vara helt fyllda, och man drog slutsatsen att granulerna består av en rundad inre tät kärna och en yttre mindre elektrontät mantel som saknades efter osmiumfixering (figurerna 3 och 9) och därför kanske är mer löslig. Ingen konsekvent substruktur var synlig inom vare sig de inre eller perifera delarna av α-granulerna. Inte vid något tillfälle sågs celler som kunde tolkas som övergångsformer mellan α-celler och β-celler. α-granulerna, inklusive både de yttre och inre tätare delarna, var jämförbara i total storlek med ”δ-granulerna”. Dessutom finns det mellanliggande celler som innehöll granuler av båda typerna, vilket tyder på att δ-cellerna i själva verket var modifierade α-celler (figur 10). δ-cellerna visualiserades, även om de nästan alltid var belägna bland α-cellerna, och har identifierats och särskilts ultrastrukturellt från α-cellerna på grundval av den lägre elektrontätheten och den större totala storleken på deras sekretoriska granuler. Dessutom förekommer intermediära celler som innehöll granuler av båda typerna vilket tyder på att δ-cellerna i själva verket var modifierade α-celler (figur 11).
Trots att det fanns ett omvänt förhållande mellan antalet sekretoriska granuler och Golgikomplexets och det granulära endoplasmatiska retikulumets framträdande, observerades inget mönster för frisättning av α- eller β-granuler. Ett tunt basalmembran och varierande mängder bindväv separerade vanligtvis pankreasöarna från intilliggande akinarceller (figur 2). Ibland fanns dock inget basalmembran mellan öarna och akinarcellerna, som då endast skiljdes åt av det smala interstitiella utrymmet. De fenestrerade kapillära endotelcellerna var alltid separerade från dem av åtminstone kapillärens basalmembran (figur 9). Andra stödjande element, inklusive kollagen och elastiska vävnadskomponenter, förekom också ibland. Inga skillnader mellan män och kvinnor observerades.
4. Diskussion
Fiskars β-celler skiljer sig lätt från α-cellerna genom morfologin hos de sekretoriska granulerna. Den frekventa förekomsten av vinklade underenheter och den uppenbart repetitiva substrukturen tyder på att β-granulerna har en kristallin karaktär. Försök att lösa upp och mäta dimensionerna hos ett kristallgitter har ännu inte lyckats. När sekretoriska granuler visualiserades i närheten av Golgikomplexet observerades vanligtvis inte kristallina underenheter. Det är därför frestande att spekulera i att de icke-kristallina granulerna eller det amorfa materialet inom Golgikomplexet representerar en annan kemisk eller fysisk form av insulin eller insulinproteinkomplex än granulernas kristallina underenheter. Det är inte känt om dessa olika morfologiska former inom β-granulerna har olika löslighet och kanske olika mönster för frisättning som svar på fysiologisk efterfrågan. Sekretoriska granuler observerades inte i cisternerna eller vesiklarna i det granulära endoplasmatiska retikulumet. Man antar att Golgikomplexet, i likhet med andra proteinutsöndrande celler, fungerar för att koncentrera eller ”förpacka” den produkt som syntetiseras i det granulära endoplasmatiska retikulumet. Det skulle logiskt följa att de säckar med släta membran i vilka de sekretoriska granulerna finns härstammar från Golgimembran snarare än från det granulära endoplasmatiska retikulumet.
α-cellerna med sina stora, rundade, täta sekretoriska granulerna liknar ganska mycket α-cellerna hos andra arter. Även om α-cellernas granuler varierar kraftigt i dimension, verkade de flesta celler besitta ett sortiment av granuler av olika storlek, vilket utesluter en subklassificering av denna celltyp som har föreslagits för andra arter . För närvarande har inga fysiologiska data publicerats som stöder förekomsten av δ-celler i fiskens bukspottkörteln. De olika aktörerna har stött δ-cellernas existens med uppgifter som grundar sig på ljusmikroskopiska undersökningar av kapricious silver, fosfotungsyra-hematoxylin och andra granulfärgningar eller elektronmikroskopiska undersökningar av dåligt bevarade vävnader. De mikrografer som presenteras här stöder den åsikt som ansågs av Bloom 1931 och därefter av Gomori 1941 att δ-cellerna kan representera modifierade α-celler.
Övergången från den typiska α-granulan, med inre täta och yttre mindre täta delar, till en δ-granulan av ungefär samma storlek, med enhetlig men minskad täthet, åtföljs ofta av en gradvis förlust av morfologisk integritet eller färgningsintensitet hos mitokondrier, Golgikomplexet och de membranösa komponenterna i det granulära endoplasmatiska retikulumet. De intakta och livskraftiga kärnorna samt förekomsten av ett litet antal fria ribosomer och ceroidkroppar tyder på att de s.k. δ-cellerna är livskraftiga även i det förmodade slutskedet av denna övergång, dvs. när de sekretoriska granulerna i sig själva inte längre är synliga och alla cytoplasmatiska organeller utom ceroidgranuler och ribosomer är frånvarande. I avsaknad av fysiologiska data som tilldelar δ-cellerna en funktion och i avsaknad av mer övertygande morfologiska bevis för en separat celltyp hoppas man att presentationen här av en trolig övergång från α-celler till δ-celler kommer att accepteras som den mest sannolika förklaringen till den tredje granulära cellen i Bloom hos människor . Betydelsen av dessa livskraftiga men förändrade α-celler är inte känd. Även om α- och β-celler, enskilt eller i små kluster, kan ses inom acini och dukter, sågs inte vid något tillfälle i något av de fyra studerade bukspottkörtelproverna några mellanformer mellan acinar- och ö-celler eller dukt- och ö-celler, vilket hade föreslagits av Nakamura och Yokote (4).
Intressekonflikter
Författarna förklarar att det inte finns några intressekonflikter i samband med publiceringen av denna artikel.
Acknowledgment
L. A. Romano har erhållit stipendier för produktivitetsforskning från Brasiliens forskningsråd, CNPq (Process nr PQ 301002/2012-6).