Abstract
AGE/RAGE-signalointi on ollut hyvin tutkittu kaskadi monissa eri tautitiloissa, erityisesti diabeteksessa. Reseptorin monimutkaisen luonteen ja monien risteävien reittien vuoksi AGE/RAGE-signalointimekanismia ei vieläkään ymmärretä hyvin. Tämän katsauksen tarkoituksena on tuoda esiin AGE/RAGE-välitteisen verisuonten kalkkeutumisen keskeiset osa-alueet diabeteksen komplikaationa. AGE/RAGE-signalointi vaikuttaa voimakkaasti sekä solu- että systeemivasteisiin luun matriisiproteiinien lisäämiseksi PKC:n, p38 MAPK:n, fetuiini-A:n, TGF-β:n, NFκB:n ja ERK1/2:n signalointireittien kautta sekä hyperglykemiassa että kalkkiutumisolosuhteissa. AGE/RAGE-signalisaation on osoitettu lisäävän oksidatiivista stressiä diabeteksen aiheuttaman verisuonten kalkkeutumisen edistämiseksi Nox-1:n aktivaation ja SOD-1:n vähentyneen ilmentymisen kautta. AGE/RAGE-signalointi diabeteksen aiheuttamassa verisuonten kalkkeutumisessa johtui myös lisääntyneestä oksidatiivisesta stressistä, joka johti VSMC-solujen fenotyyppiseen vaihtumiseen osteoblastin kaltaisiksi soluiksi AGE:n aiheuttamassa kalkkeutumisessa. Tutkijat havaitsivat, että farmakologiset aineet ja tietyt antioksidantit vähensivät kalsiumin kertymistä AGE:n aiheuttamassa diabeteksen aiheuttamassa verisuonten kalkkeutumisessa. AGE/RAGE-signalointikaskadin roolin ymmärtäminen diabeteksen aiheuttamassa verisuonten kalkkeutumisessa mahdollistaa farmakologisen intervention tämän diabeettisen komplikaation vakavuuden vähentämiseksi.
1. Johdanto
Diabetes mellitus on sairauksien ryhmä, jolle on ominaista kohonnut veren glukoosipitoisuus tai hyperglykemia, joka johtuu elimistön kyvyttömyydestä tuottaa ja/tai käyttää insuliinihormonia. Tyypin I diabetes mellitukseen liittyy haiman β-solujen toimintahäiriö, joka johtaa insuliinin tuotannon menetykseen, kun taas tyypin II diabetes mellitus johtuu insuliinireseptorin toimintahäiriöstä, jossa insuliinireseptorin signalointi on irrotettu glukoosin ottamisesta. Diabetes mellitus on erittäin yleinen Yhdysvalloissa, jossa noin 29 miljoonaa ihmistä eli 9,3 prosenttia väestöstä sairastaa diabetesta. On raportoitu, että sydän- ja verisuonitautien aiheuttama kuolleisuus 18-vuotiailla ja sitä vanhemmilla diabeetikoilla oli noin 1,7 kertaa suurempi kuin normaaliväestöllä . Diabeettisten sydän- ja verisuonitautien lisääntyneet kuolleisuusluvut osoittavat, kuinka vakavia komplikaatioita tämä sairaus voi aiheuttaa. Siksi sydän- ja verisuonitautien ja diabeteksen välinen yhteys on tärkeää ymmärtää .
2. Tyypin II diabetes ja verisuonten kalkkeutuminen
Tyypin II diabetes on yhdistetty voimakkaasti verisuonten kalkkeutumiseen useiden eri mekanismien kautta, joista joitakin ovat oksidatiivinen stressi, hyperglykemia, hyperkalemia ja hyperkalsemia, ja oksidatiivinen stressi on tämän katsauksen pääpaino . Verisuonten kalkkeutumista kuvataan valtimon mediaalisen kerroksen kovettumisena hydroksiapatiittimineraalien kerrostuessa solunulkoiseen matriisiin . Tämän prosessin, jota aiemmin pidettiin passiivisena ja ikääntymiseen liittyvänä, on nyt osoitettu olevan tiukasti säädelty soluvälitteinen prosessi . Verisuonten kalkkeutumisen aikana luun morfogeneettinen proteiini-2 (BMP-2) aktivoi ydinsitoutumistekijä alfa-1:n (CBFA-1, tunnetaan myös nimellä RunX2), joka toimii ensisijaisena transkriptiosäätäjänä osteoblastien kypsymiselle luussa . CBFA-1 säätelee myös osteoblastiproteiinien tuotantoa verisuonten sileissä lihassoluissa (VSMC), minkä uskotaan aiheuttavan VSMC:n fenotyyppisen siirtymisen osteoblastin kaltaiseen fenotyyppiin . Alkalisen fosfataasin (ALP) ja luun sialoproteiinin (BSP) on osoitettu olevan osteoblastien aktiivisuuden varhaisia merkkiaineita, kun taas merkkiaineet, kuten osteopontin (OPN) ja osteokalsiinin, säätäytyvät kalkkiutumisprosessin loppuvaiheessa . Niiden ensisijainen tehtävä on edistää tyypin I kollageenista ja muista ei-kollageenisista proteiineista koostuvan hydroksiapatiitin muodostumista ja laskeutumista . Ensisijaisesti luunmuodostuksessa ALP on vastuussa pyrofosfaatin pilkkomisesta fosfaatiksi hydroksiapatiitin laskeutumisen ja mineralisaation edistämiseksi luun sisällä . BSP vastaa hydroksiapatiittimineraalin ydintymisestä . ALP:n tavoin myös OPN liittyy hydroksiapatiitin laskeutumiseen ja voi toimia solujen kiinnittymisen ja signaloinnin välittäjänä . Osteokalsiinin välityksellä K-vitamiinista riippuvaisella mekanismilla välitetään hydroksiapatiitin kokoa ja muotoa . Kaiken kaikkiaan nämä tiedot osoittavat, että luunmuodostusta voidaan edistää elävässä järjestelmässä, ja tutkijat ovat hyödyntäneet tätä tietoa luun matriisiproteiineista ymmärtääkseen verisuonten kalkkeutumisen ja tyypin II diabeteksen taustalla olevia mekanismeja.
Chenin ym. suorittamassa tutkimussarjassa diabeettisilta ja ei-diabeettisilta potilailta kerätyt valtimot analysoitiin kalsiumin, OPN:n, ALP:n, tyypin I kollageenin ja BSP:n määrien määrittämiseksi. BSP:tä lukuun ottamatta kaikki tutkitut luun matriisiproteiinit lisääntyivät merkittävästi diabeteksen seurauksena. In vitro -kokeet, joissa käytettiin naudan verisuonten sileitä lihassoluja (BVSMC), joita kasvatettiin euglykeemisissä (normaali glukoosi) ja hyperglykeemisissä olosuhteissa, osoittivat, että CBFA1:n, ALP:n ja osteokalsiinin pitoisuudet olivat merkittävästi korkeammat soluissa, joita kasvatettiin korkeassa glukoosipitoisessa väliaineessa. Lisäksi kalsiumin kertyminen oli myös merkittävästi suurempaa korkeassa glukoosipitoisessa mediassa kuin normaalissa glukoosipitoisessa mediassa, ja tämä suuntaus havaittiin myös silloin, kun molempiin kasvualustaolosuhteisiin lisättiin kalkitusmediaa. Kalkitusmediat sisältävät kohonneita määriä epäorgaanista fosfaattia edistääkseen kalkkeutumista hyödyntämällä soluja, jotka tarvitsevat homeostaasin ylläpitämiseksi. Lisääntyneestä luumatriksin proteiiniekspressiosta vastuussa olevien signalointimekanismien määrittämiseksi BVSMC-solut altistettiin korkeille glukoosipitoisuuksille ja proteiinikinaasi C:n (PKC) aktiivisuus estettiin farmakologisesti sekä normaaleissa että korkealla glukoosilla käsitellyissä soluissa. PKC valittiin signaalireitin keskipisteeksi sen ennalta määritellyn roolin vuoksi solujen vasteissa diabetekseen ja hyperglykemiaan . Tämän seurauksena luun matriisiproteiinien ilmentyminen väheni merkittävästi, kun taas normaalilla glukoosilla käsitellyissä soluissa proteiinien ilmentymisessä ei tapahtunut merkittävää muutosta. Tämä tutkimus osoitti myös BMP-2:n lisääntyneen erityksen BVSMC-soluista, joita viljeltiin korkeassa glukoosipitoisessa väliaineessa. Kaiken kaikkiaan Chen et al. päättelivät, että hyperglykeemiset olosuhteet, kuten diabeteksessa havaittiin, edistivät luun matriisiproteiinien säätelyä ja verisuonten kalkkeutumista . Mori et al. tukevat tutkimukset osoittivat, että OPN:ää säänneltiin ja aktivoitiin samankaltaisella PKC-välitteisellä reitillä diabeettisissa rottien VSMC:ssä. Western blotting vahvisti, että PKC:n esto johti OPN-proteiinin ilmentymisen huomattavaan vähenemiseen . Kaiken kaikkiaan nämä tutkimukset ovat osoittaneet paitsi luumatriisiproteiinin ilmentymisen yleisyyttä verisuonten sileissä lihassoluissa myös PKC:n roolin diabeteksen aiheuttamassa verisuonten kalkkeutumisessa.
3. Verisuonten kalkkeutuminen ja AGE-RAGE-signaalien välitys
Luumatriisiproteiinin lisääntyneen ilmentymisen lisäksi VSMC:ssä diabeteksen ja kalkkeutumishoitojen aikana tutkimukset ovat osoittaneet, että pitkälle edenneillä glykaation päätteisillä tuotteilla (Advanced Glycation End Products, AGEs) ja niiden reseptoreilla (RAGEs) on rooli verisuonten kalkkeutumisessa . Tyypin II diabetesta sairastavien potilaiden AGE-pitoisuuksien on osoitettu olevan huomattavasti suurempia kuin ei-diabeettisen väestön . AGE:t muodostuvat eliniän aikana lisääntyneen verenkierrossa olevan glukoosin sekä muiden pelkistävien sokerien, kuten galaktoosin ja fruktoosin, reagoidessa proteiinien aminoryhmien kanssa ja muodostaen Schiffin emäksiä, jotka joko kulkevat polyolireittiä pitkin AGE:iksi tai hajoavat . Nämä glykoituneet lopputuotteet ovat vuorovaikutuksessa RAGE:iden kanssa, jotka ovat immunoglobuliinien superperheeseen kuuluvia transmembraaniproteiineja. RAGE:t säätäytyvät vasteena lisääntyneille verenkierron AGE-pitoisuuksille . AGE:n ja RAGE:n sitoutuessa RAGE toimii PKC-ζ:n kautta käynnistääkseen signaalikaskadin, joka toimii p38 mitogeeniaktivoituneen proteiinikinaasin (MAPK), transformoivan kasvutekijä-β:n (TGF-β) ja ydintekijä κB:n (NFκB) kautta, aktivoitumisen . Suga ym. osoittivat, että AGE-RAGE-signaloinnin aktivointi rotan VSMC:ssä vähensi VSMC:n geenimerkkiaineiden, kuten sileän lihaksen myosiinin raskaan ketjun (SM-MHC) ja sileän lihaksen 22α:n (SM22α), ilmentymistä. Tämä VSMC:n merkkiaineiden alaregulaatio viittaa VSMC:n mahdolliseen fenotyyppiseen siirtymiseen osteoblastin kaltaiseen fenotyyppiin . Tätä tukevat havainnot ihmisen VSMC:istä (HVSMC), joissa RAGE:n aktivointi lisäsi luun matriisiproteiinin ALP:n mRNA-ekspressiota ja aktiivisuutta, mikä viittaa RAGE-signaloinnin rooliin verisuonten kalkkeutumisessa . Nämä tutkimukset osoittivat joitakin RAGE:n perusrooleja VSMC:n kalkkeutumisessa PKC-ζ-signaloinnin, ALP:n lisääntyneen ilmentymisen ja VSMC:n geenimerkkiaineiden vähentyneen ilmentymisen kautta.
Tutkimuksissa, jotka Tanikawa ym. tekivät käyttäen HVSMC:n in vitro -kalkeutumismallia, AGE:iden pitoisuuksien kasvattaminen lisäsi merkitsevästi kalsiumin kerrostumisen määrää 7 ja 14 vuorokauden kuluttua BSA:lla käsiteltyihin näytteisiin ja vertailunäytteisiin verrattuna . Lisäksi CBFA-1:n (RunX2) mRNA-ekspressio, ALP-aktiivisuus ja osteokalsiinin proteiinitasot olivat myös merkittävästi koholla. Yhdessä nämä tiedot osoittivat, että AGE-hoito edistää osteoblastin kaltaista fenotyyppiä HVSMC:ssä. Tämä fenotyyppinen siirtyminen ei ollut riippuvainen kalkkipitoisesta väliaineesta, sillä samankaltaisia tuloksia havaittiin käyttämällä HVSMC:tä, joita kasvatettiin kalkkipitoisella väliaineella ja ilman sitä. VSMC:n osteoblastiproteiinien ilmentyminen voi liittyä p38 MAPK:n aktiivisuuteen, sillä Tanikawa et al. havaitsivat, että AGE-altistuksen lisääntyessä p38 MAPK:n aktivaatio lisääntyi. Sitä vastoin, kun RAGE-signalointia vaimennettiin, p38 MAPK:n aktivaatio väheni, ja p38 MAPK:n muutokset korreloivat ALP-aktiivisuuden vähenemiseen AGE:n aiheuttamasta kalkkeutumisesta huolimatta . Hu ym. vastaavassa tutkimuksessa p38 MAPK:n osoitettiin olevan välttämätön osteoblastien erilaistumiselle MC3T3-E1-soluissa. P38 MAPK:n farmakologinen esto johti ALP-aktiivisuuden vähenemiseen, mikä osoittaa, että p38 MAPK:ta tarvitaan ALP:n ilmentymiseen osteoblastin kaltaisissa soluissa . Näin ollen ALP-aktiivisuuteen voi vaikuttaa suoraan sekä lisääntynyt AGE-altistus että kohonnut RAGE-kaskadin signalointi p38 MAPK:n kautta. Tämä suhde viittaa siihen, että p38 MAPK:lla on keskeinen rooli AGE-RAGE-reitillä diabeteksen aiheuttamassa verisuonten kalkkeutumisessa .
Vaikka nämä havainnot osoittavat AGE-RAGE-reitin merkityksen diabeteksen aiheuttamassa verisuonten kalkkeutumisessa, Ren ym. osoittivat, että AGE:t lisäsivät merkittävästi myös solunsisäisiä kalsiumtasoja rotan VSMC:ssä . Todettiin, että ALP:n ja OPN:n mRNA-tasot kasvoivat merkittävästi 24 tunnin altistuksen jälkeen glykoituneelle albumiinille (AGE-BSA). Koska ALP:n ja OPN:n pitoisuudet kasvoivat AGE-BSA-käsittelyn yhteydessä, ryhmä osoitti myös, että RAGE:n pitoisuudet nousivat rotan VSMC:ssä. Kun sitä inkuboitiin RAGE:n neutraloivalla vasta-aineella, kalsiumin määrä ja ALP:n ilmentyminen vähenivät. Havaitut muutokset vahvistivat, että RAGE välittää AGE:n aiheuttamaa VSMC-kalsifikaatiota . Wei ym. osoittivat, että diabetes kiihdytti aortan kalkkeutumista urospuolisilla Wistar-rotilla . Eläimiä hoidettiin streptotsotosiinilla (STZ) diabeteksen indusoimiseksi ja sitten hoidettiin D3-vitamiinilla ja nikotiinilla (VDN) verisuonten kalkkeutumisen indusoimiseksi. von Kossa -värjäys mahdollisti kalsiumhiukkasten visualisoinnin poistetun aortan kudoksen sisällä, ja kalsiumhiukkasia löytyi valitusta kudosleikkeestä. Western blot -analyysi osoitti ALP:n ilmentymisen merkittävää lisääntymistä, ja myös AGE:iden tasot kasvoivat diabeetikoilla ja VDN-käsitellyillä eläimillä . On tärkeää huomauttaa, että vaikka AGE-RAGE-signalointi voi suoraan välittää verisuonten kalkkeutumista diabeteksessa, AGE-RAGE-signalointi voi myös välillisesti vaikuttaa tähän diabeettiseen komplikaatioon.
4. Fetuiini-A:n roolit verisuonten kalkkeutumisessa ja RAGE-signaloinnissa
Serumiproteiini -Heremans-Schmid -glykoproteiini (Ahsg tai fetuiini-A), joka on systeemisesti kiertävä glykoproteiini, on liitetty insuliiniresistenssiin tyypin II diabeetikoilla . Potilastiedot osoittivat, että seerumin korkeat fetuiini-A-pitoisuudet olivat tyypin II hyperglykemian indikaattori. Fetuiini-A esti myös insuliinin vastaanottoa estämällä insuliinireseptoria autofosforyloimasta insuliinireseptorin substraatti-1-proteiinia, joka on ratkaisevan tärkeä insuliinireseptorin signalointireitin kannalta . Yhdessä nämä tutkimukset osoittivat, että fetuiini-A:lla on rooli tyypin II diabeteksen insuliiniresistenssissä, mikä voi johtaa hyperglykemian ja muiden diabeettisten komplikaatioiden pahenemiseen entisestään. Mielenkiintoista on, että lisääntyneen verisuonten kalkkeutumisen on osoitettu liittyvän tyypin II diabeteksen lisäksi myös kroonista munuaissairautta sairastaviin potilaisiin . Verisuonten kalkkeutumisen on tässä tapauksessa osoitettu edistävän sekä tulehdus- että oksidatiivista stressireaktiota, jolloin se on sydän- ja verisuonitautien riskitekijä. Fetuiini-A vapautuu maksasta toimimaan akuutin vaiheen proteiinina synnynnäisessä immuunijärjestelmässä, jossa se toimii edistääkseen anti-inflammatorisia ja antioksidatiivisia stressireaktioita estääkseen yliekspressoituja tulehdusmolekyylejä.
Kääntäen fetuiini-A voi myös saada aikaan synnynnäisen immuunivasteen, jonka aiheuttavat osittain tollin kaltaiset reseptorit (Toll-like receptors, TLR). Tämä mekanismi voi aktivoitua vapaiden rasvahappojen (FFA) vaikutuksesta ja aiheuttaa proinflammatorisen vasteen . Pal et al. osoittivat, että fetuiini-A voi toimia TLR-4:n ligandina ja stimuloida FFA:n aiheuttamaa insuliiniresistenssiä rasvasoluissa . Sen lisäksi, että fetuiini-A edistää insuliiniresistenssiä tyypin II diabeetikoilla, se voi myös estää vaihtoehtoista RAGE-ligandia, high mobility group box-1:tä (HMGB1), joka on vastuussa useiden sytokiinien, adheesiomolekyylien ja kemokiinien vapautumisesta ja rekrytoinnista. RAGE-signaalikaskadin aktivaation on osoitettu olevan vastuussa HMGB1:n välittämästä tuumorinekroositekijän (TNF) ja interleukiini-1:n (IL-1) ilmentymisestä. Huolestuttavaa on, että HMGB1:n fetuiini-A:n estäminen voisi mahdollisesti luoda olosuhteet, joissa RAGE:t valitsevat ja sitovat AGE:itä ensisijaisesti kaskadin aktivoimiseksi. Käyttämällä CKD-potilaiden näytteistä kerättyjä tietoja Janda ym. osoittivat, että seerumin kohonneet fetuiini-A-pitoisuudet olivat positiivinen indikaattori AGE:iden lisääntyneelle laskeutumiselle valtimoissa, mikä osoittaa, että fetuiini-A voi epäsuorasti vaikuttaa AGE:n/RAGE:n reittiin erityisesti tulehdusmolekyylien läsnäollessa.
Fetuiini-A:lla (Ahsg) on suuri affiniteetti hydroksiapatiittikiteisiin, jotka sijaitsevat verisuonten kalkkikivien paikoissa, kuten luussa ja hampaissa . Ketteler et al. käyttivät hemodialyysipotilaita, joilla oli CKD, korreloidakseen sydän- ja verisuonikuolleisuuden alentuneiden fetuiini-A-pitoisuuksien ja lisääntyneen verisuonten kalkkeutumisen kanssa, mikä viittaa siihen, että fetuiini-A toimii kalkkeutumisen estäjänä . Tutkimuksissa, joissa käytettiin kalkkiutumisherkkää fetuiini-A-puutteista hiirimallia (DBA/2-Ahsg-/-), todettiin, että glykoproteiini on kalkkiutumisen estäjä . Luun röntgenkuvat ja keuhkojen, sydämen, munuaisten ja ihon von Kossa -värjäykset osoittivat, että fosforin ja kalsiumin kertyminen oli lisääntynyt kussakin kudostyypissä. DBA/2-Ahsg-/- -eläimistä otettiin veriseerumia in vitro-kalsiumfosfaatin (BCP) saostumismääritystä varten. Fetuiini-A vähensi BCP-saostuman määrää seerumissa, mikä osoittaa, että fetuiini-A voi estää BCP-saostuman muodostumista. Samassa tutkimusryhmässä Heiss et al. käyttivät elektronimikroskopiaa ja dynaamista valonsirontaa määrittääkseen BCP:n kanssa kalsiproteiinihiukkasia muodostavien fetuiini-A-kompleksien rakenteelliset ominaisuudet. Lisätutkimukset, joissa puhdistettua fetuiini-A:ta inkuboitiin BCP:n kanssa in vitro, osoittivat BCP:n rakenteen muuttuvan jäykästä hauraaksi. Tämä havaittu rakennemuutos havaittiin myös muissa kalsiumpohjaisissa materiaaleissa, kuten CaCO3-nanopartikkeleissa .
Fetuiini-A:n, BCP:n ja kalkkiutuneiden VSMC:iden välinen suhde määritettiin käyttämällä in vitro- ja in vivo HVSMC-mallijärjestelmää. Reynolds et al. osoittivat, että fetuiini-A oli lokalisoitunut kalkkeutuneiden HVSMC:iden matriksin rakkuloihin valtimon mediaalisessa kerroksessa . Näitä kalkkeutuneita HVSMC-soluja käsiteltiin fetuiini-A:lla, joka esti kalsiumin kertymistä ja kalsiumin inkorporaatiota annosriippuvaisesti ja soluvälitteisesti. VSMC-solujen on osoitettu kokevan vesikkelien ja apoptoottisten kappaleiden välittämää verisuonten kalkkeutumista . Mikroskooppi ja western blotting osoittivat, että fetuiini-A esti HVSMC:n apoptoosia. Vapautuneiden matriisivesikkelien ja apoptoottisten kappaleiden kalkkiutuminen kvantifioitiin energiadispersiivisellä röntgenanalyysillä ja osoitti, että fetuiini-A estää myös näiden vapautuneiden solupartikkelien kalkkiutumista. Samassa tutkimuksessa osoitettiin, että fetuiini-A estää matriisivesikkelien ja apoptoottisten kappaleiden välittämää HVSMC:n kalkkeutumista. Moen ja muiden samankaltaisissa tutkimuksissa fetuiini-A:n osoitettiin olevan BVSMC:n kalkkeutumisen estäjä . Kaiken kaikkiaan nämä tiedot osoittavat, että fetuiini-A on kalkkeutumisen estäjä.
5. AGE-RAGE-signalointi ja oksidatiivinen stressi verisuonten kalkkeutumisessa
AGE/RAGE-signalointikaskadin on osoitettu muistuttavan feed-forward-silmukkaa, jossa syntyy lopputuloksia, kuten lisääntynyttä fibroosia, lisääntynyttä RAGE-ekspressiota ja lisääntyneitä oksidatiivisia stressitekijöitä . Kohonneiden reaktiivisten happilajien (ROS) tuottama oksidatiivinen stressi voi häiritä lukuisia solunsisäisiä rakenteita, kuten solukalvoja, proteiineja, lipidejä ja DNA:ta. ROS-tuotteet, kuten vetyperoksidi, superoksidi-anionit, hydroksyyliradikaalit ja typpioksidi, syntyvät mitokondrioiden oksidaaseissa, NADPH-oksidaaseissa (Nox) ja typpioksidisyntaaseissa . RAGE:n aktivaatio johtaa ROS:n lisääntyneeseen tuotantoon stimuloimalla erityisiä signaalikaskadeja, kuten TGF-β:tä, NF-κB:tä ja Nox-1:tä . Wein ja muiden tekemässä tutkimuksessa malondialdehydin (MDA) pitoisuutta ja Cu/Zn-superoksididismutaasin (SOD-1) aktiivisuutta käytettiin arvioimaan oksidatiivista stressiä ja kykyä käynnistää kompensoiva oksidatiivisen stressin mekanismi diabeteksen aiheuttaman verisuonten kalkkeutumisen eläinmalleissa. Diabeettisilla eläimillä, joilla oli VDN:n aiheuttama verisuonten kalkkeutuminen, MDA-pitoisuus lisääntyi merkittävästi ja SOD-aktiivisuustasot laskivat merkittävästi diabeettiseen ryhmään verrattuna. Kun eristettyjä VSMC:itä käsiteltiin kasvavilla AGE-pitoisuuksilla, ALP-aktiivisuustasot, Nox-1-välitteinen ROS-tuotanto ja RAGE-ekspressio kohosivat. RAGE:n ilmentymisen estäminen vähensi ALP-aktiivisuutta, kalsiumpitoisuutta ja Nox-1-proteiinin tuotantoa samalla kun SOD-1-tasot kasvoivat. Kaiken kaikkiaan nämä tutkimukset osoittivat, että diabeteksen ja VDN-välitteisen verisuonten kalkkeutumismallin soluisolaatit reagoivat AGE-käsittelyihin, mikä ilmenee ALP-, ROS-, Nox-1- ja RAGE-proteiinipitoisuuksien merkittävänä lisääntymisenä verrattuna pelkkiin diabeettisiin eläimiin . Brodeur et al. käyttivät samanlaista eläinmallia määrittääkseen, voidaanko AGE:itä in vivo -järjestelmässä vähentää sen jälkeen, kun diabeteksen välittämää verisuonten kalkkeutumista on tapahtunut . Pyridoksamiinia (PYR), AGE:n estäjää, annettiin ennaltaehkäisevänä kalkkeutumista edeltävänä hoitona, kun taas alagebriumia (ALA), AGE:n katkaisijaa, annettiin terapeuttisena kalkkeutumisen jälkeisenä hoitona. Näissä tutkimuksissa vain ALA:n avulla voitiin vähentää merkittävästi AGE:iden määrää ja kalsiumpitoisuutta mitattuna lihaksikkaissa valtimoissa, kuten reisivaltimossa, mutta ei isommissa johtavissa valtimoissa, kuten aortassa. PYR vähensi AGE:n ja kalsiumin kokonaismäärää, mutta se ei ollut merkittävää tutkituissa kudoksissa. Molempien hoitojen tehokkuuden ero saattaa johtua vaikutusmekanismeista; PYR toimii AGE:iden ennaltaehkäisevänä aineena, kun taas ALA toimii AGE-ristisidosten rikkojana. Lisäksi testattiin useiden antioksidanttihoitojen, kuten alfa-lipioc-hapon, 4-hydroksitempolin ja aposyniinin, tehoa. Aposyniinihoito vähensi merkittävästi kalsiumin kertymistä diabeteksen aiheuttamassa verisuonten kalkkeutumisen eläinmallissa. Brodeur ym. osoittivat, että kalsiumin vähentäminen kohdennetun ROS-antioksidanttihoidon avulla on toteuttamiskelpoisempi hoito verisuonten kalkkeutumisen in vivo -mallissa. Yhdessä nämä tutkimukset osoittavat, että AGE/RAGE-kaskadi kykenee välittämään verisuonten kalkkeutumista oksidatiivisen stressin mekanismien kautta, ja terapeuttiset hoidot, joilla rajoitetaan ROS-tuotantoa, saattavat tarjota toteuttamiskelpoisemman vaihtoehdon verisuonten kalkkeutumisen minimoimiseksi.
Toinen AGE:iden aktivoima ROS-signalointikaskadi on transformoiva kasvutekijä- (TGF-) β. Kun VSMC:tä käsiteltiin AGE:illa, Li ym. tutkimuksessa, kun VSMC:itä käsiteltiin AGE:illa, AGE/RAGE- signaalinkäsittelyn kaskadin jäseniä (ts, p38 MAPK ja ERK1/2) havaittiin fosforyloituvan RAGE:n aktivoituessa. Lisäksi TGF-β-signalointi johti sen välittäjäaineperheen, Smadsin, fosforylaatioon, jotka toimivat transkriptiomodulaattoreina . Näiden muutosten todettiin olevan TGF-β-riippuvaisia. Western blot -analyysi osoitti, että kun RAGE-ekspressiota vähennettiin, myös Smad 2 -fosforylaatio estyi, mikä osoittaa, että AGE/RAGE-kaskadi vaikuttaa Smadin aktivoitumiseen ja TGF-β-signalointiin. Koska AGE:t kerääntyvät solunulkoiseen matriisiin (ECM), on tärkeää huomata, että TGF-β:n lisääntymisen on katsottu vaikuttavan fibroosiin taudin yhteydessä. Fibroosi liittyy tyypillisesti tyypin I kollageenin lisääntymiseen, ja Li ym. osoittivat western blot -analyysin avulla, että AGE:t aiheuttavat tyypin I kollageenin lisääntynyttä tuotantoa, jota estettiin estämällä p38 MAPK:n ja ERK1/2:n signalointia. Näiden tietojen perusteella voidaan päätellä, että AGE/RAGE-signaloinnilla on merkitystä ECM:n ylläpidossa ja säätelyssä diabeteksessa ja että AGE:t indusoivat TGF-β:tä RAGE:n välityksellä .
AGE:iden on myös osoitettu lisäävän NFκB:n aktiivisuutta RAGE-signaloinnin kautta VSMC:ssä. Tutkimukset ovat osoittaneet, että VSMC:t ylläpitävät joustavaa, supistumiskykyistä fenotyyppiä valtimossa; NFκB-signalisaation lisääntyminen häiritsee kuitenkin tätä fenotyyppiä, mikä johtaa lisääntyneeseen jäykkyyteen ja jäykkyyteen, jotka liittyvät yleisesti kardiovaskulaarisiin diabeettisiin komplikaatioihin . Simard et al. käsittelivät rotan aortan VSMC-soluja (A7r5-solut) glykoituneella ihmisen seerumin albumiinilla (AGE-HSA) ja havaitsivat GFP-ekspression avulla merkittävästi lisääntyneen NFκB-aktiivisuuden. Western blot -analyysi osoitti, että ERK1/2-aktivaatio lisääntyi merkittävästi AGE-HSA-hoidon yhteydessä ja AKT-aktivaatio lisääntyi hieman. Molemmat näistä reiteistä aktivoivat NFκB:tä, minkä perusteella voidaan päätellä, että RAGE-signalointi lisää NFκB-aktiivisuutta . NFκB:n transkription aktiivisuuden lisääntyminen voi johtaa tyypin I kollageenin a1 ja a2 mRNA-ekspression lisääntymiseen AGE:lla käsitellyissä hiiren VSMC:ssä, kuten Peng et al. osoittivat. Kaiken kaikkiaan AGE:n aiheuttama RAGE-signalointi vaikuttaa NFκB:n aktiivisuuteen VSMC:ssä, mikä voi johtaa tyypin I kollageenin uudelleenmuotoiluun ECM:ssä tai solujen morfologian muuttumiseen. Kun niitä käsitellään AGE-HSA:lla, sileän lihaksen myosiinin raskaan tuolin (SM-MHC) ja SM-22α:n mRNA-tasot pienenivät, ja lisäksi SM-α-aktiinin, SM-22α:n ja myokardiinin (MyoC) proteiiniekspressio väheni. Kaiken kaikkiaan tutkijat osoittivat, että RAGE-signalointi häiritsee sileän lihaksen fenotyypin merkkiaineiden ilmentymistä A7r5-soluissa. Sileän lihaksen fenotyypin merkkiaineiden häviäminen tarjosi selityksen sileän lihaksen mekaanisten soluominaisuuksien muutoksille, kun AGE/RAGE-signalointi lisääntyi. A7r5-soluissa esiintyi myös lisääntynyttä rakeisuutta, mikä osoitti lisääntyneen RAGE-signalisaation aiheuttamaa näkyvää muutosta solujen morfologiassa. Vaikka yleinen aktiinitiheys pysyi muuttumattomana AGE-HAS-käsitellyissä soluissa, Youngin moduuli, joka on kimmoisuuden mitta, paljasti, että solujen perusjäykkyys oli lisääntynyt merkittävästi, mikä osoittaa, että solutyyppi on jäykempi ja vähemmän joustava. Fosforyloidun myosiinin kevyen ketjun (MLC) proteiiniekspressiotasoja mitattiin myös supistumiskyvyn ja aktiini-myosiinivälitteisen motorisen aktiivisuuden muutosten määrittämiseksi. Tulokset osoittivat, että supistumiskyky ei muuttunut, kun A7r5-soluja käsiteltiin AGE-HSA:lla. Kaiken kaikkiaan lisääntynyt AGE/RAGE-signalointi muuttaa VSMC-solujen mekaanisia ominaisuuksia, mikä johtaa jäykempään ja vähemmän joustavaan solutyyppiin.
6. Johtopäätökset
AGE/RAGE-signalointi on monimutkainen ja monimutkainen kaskadi, ja sitä on tutkittu monissa eri sairaustiloissa. Erityisesti diabeteksen välittämässä verisuonten kalkkeutumisessa on useita tekijöitä, joiden ansiosta AGE/RAGE-signalointi voi vaikuttaa voimakkaasti sekä solu- että systeemivasteisiin. Verisuonten kalkkeutumisen on osoitettu lisäävän luun matriisiproteiineja PKC-signaloinnin kautta hyperglykeemisissä ja kalkkeutumisolosuhteissa. AGE:n aiheuttama verisuonten kalkkeutuminen aiheutti VSMC-markkereiden alenevaa säätelyä ja luun matriisiproteiinien nousevaa säätelyä, mikä viittaa siihen, että VSMC:ssä tapahtuu fenotyyppinen muutos osteoblastin kaltaiseksi soluksi. RAGE-signalointi voi myös välittää VSMC-kalsifikaatiota useiden mitogeenisten reittien kautta. Näistä p38 MAPK -reitin osoitettiin olevan olennainen osa AGE/RAGE-välitteistä VSMC:n erilaistumista. Fetuiini A:lla osoitettiin olevan myös kiistanalaisempi rooli verisuonten kalkkeutumisessa. Fetuiini A toimii välittäjänä sekä kalkkiutumista edistävässä toiminnassa, kun AGE:t valikoituvat keinotekoisesti RAGE-ligandina, että kalkkiutumista estävässä toiminnassa tietyissä CDK:n malleissa. Fetuiini-A edustaa jännittävää aluetta, jolla on tehtävä lisätyötä sen roolin ymmärtämiseksi verisuonten kalkkeutumisessa diabeettisena komplikaationa. AGE/RAGE-signalointi on yhdistetty diabeteksen aiheuttamaan verisuonten kalkkeutumiseen liittyvään oksidatiiviseen stressiin Nox-1:n, TGF-β-välitteisen fibroosin, NFκB:n ja ERK1/2:n polkujen aktivoitumisen ja SOD-1:n vähentyneen ilmentymisen kautta. Tutkijat havaitsivat, että farmakologiset aineet ja tietyt antioksidantit vähensivät kalsiumin kertymistä AGE:n aiheuttamassa diabeteksen aiheuttamassa verisuonten kalkkeutumisessa. Kaiken kaikkiaan AGE/RAGE-signaloinnin rooli diabeteksen aiheuttamassa verisuonten kalkkeutumisessa johtui oksidatiivisesta stressistä ja VSMC:n fenotyyppisestä vaihtumisesta AGE:n aiheuttamissa kalkkeutumisolosuhteissa, kuten kuvassa 1 on esitetty. Tulevaisuuden suunnaksi verisuonten kalkkeutumisen ymmärtämisessä diabeettisena komplikaationa voitaisiin käyttää RAGE:n tyrmäyshiiriä RAGE:n systeemisen eston vaikutusten tutkimiseksi diabeteksen aiheuttamaan verisuonten kalkkeutumiseen. Myös fetuiini-A:n roolia voitaisiin tutkia paremmin, jotta ymmärrettäisiin tämän biomarkkerin ja AGE/RAGE-signalisaation vuorovaikutusta tyypin II diabeteksessa.
Disclosure
Tässä aineistossa esitetyt mielipiteet, havainnot ja johtopäätökset tai suositukset ovat kirjoittajien omia eivätkä välttämättä vastaa National Science Foundationin näkemyksiä.
Kilpailevat intressit
Tekijät ilmoittavat, että heillä ei ole kilpailevia intressejä.
Tekijöiden panos
Kaikki kirjoittajat osallistuivat tasapuolisesti tämän artikkelin laatimiseen.
Kiitokset
Tekijät haluaisivat kiittää tohtori Donna M. Gordonia hänen panoksestaan tämän katsauksen laatimiseen ja toimittamiseen. Tätä työtä on tukenut American Heart Association Beginning Grant-In-Aid no. 4150122 (JAS), American Heart Association Scientist Development Grant no. 5310006 (JAS) ja Mississippin osavaltion yliopisto ja sen biologisten tieteiden laitos. Lisäksi tämä aineisto perustuu työhön, jota on tukenut National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program Grant no. 2015202674.