A community resource
A 460 vadon élő egér teljes immunológiai adatsora közösségi forrásként elérhető (Supplementary Data 1). Ebből részletesen összehasonlítjuk az egyetlen helyszínről (HW helyszín, 1a. ábra, 1. kiegészítő táblázat) származó 181 vadon élő egér (100 hím, 81 nőstény) egy részhalmazát 64 laboratóriumban nevelt, kórokozómentes C57BL/6 egérrel (24 hím, 40 nőstény). Az összehasonlítás eredményeit az 1,2. táblázat és a 2. kiegészítő táblázat tartalmazza, ez utóbbi túl nagy ahhoz, hogy a cikk főszövegébe beleférjen.
A vad egerek immunológiailag különböznek a laboratóriumi egerektől
A vadon élő (HW) és a laboratóriumi (C57/BL6) egerek szerológiai és morfometriai paramétereit az 1. táblázat foglalja össze. A vadon élő egerek sokkal kisebbek voltak, mint a laboratóriumi egerek (súlyuk csak feleakkora volt), és a vadon élő egerek között az életkor, a testhossz és a tömeg mind erősen korrelált (hossz és tömeg, Pearson-korrelációk (kétfarkú) r=0,79; életkor és tömeg, r≥0,77; életkor és hossz, r=0,58, P<0,001, n>80 hím és nőstény egerekre külön-külön) (Kiegészítő adatok 2). A vadon élő egerek medián életkora 6,6 hét volt (tartomány 1-39,5), és számos immunparaméter korrelált az életkorral és a mérettel, valószínűleg a fertőzésnek való kumulatív kitettség miatt (Kiegészítő adatok 2). A 62 immunológiai mérés közül a legtöbb (57 mérés) különbözött a vadon élő és a laboratóriumi egerek között (1. táblázat, 2. táblázat, 2. kiegészítő táblázat). A vadon élő egerek között nagyon kevés (62 mérésből 6) szignifikáns immunológiai különbség volt a hím és nőstény egerek között, míg a laboratóriumi egereknél több (62 mérésből 18) immunológiai nemi dimorfikus volt (1. táblázat, 2. táblázat, 2. kiegészítő táblázat).
A multilokális genotipizálás azt mutatja, hogy a HW vad egerek strukturálatlan, genetikailag változatos populációt alkotnak (1b. ábra, 3. kiegészítő adat). A vad egerek genetikailag különböznek tíz laboratóriumi egértörzstől, és a laboratóriumi törzsek genetikailag változatosabbak, mint a vad egerek. Azt feltételezzük, hogy a vadon élő és a laboratóriumi egerek közötti genetikai kapcsolat a laboratóriumi egerek genomjának mozaikosságával4 , azzal a ténnyel, hogy a laboratóriumi egereket sok generáción keresztül szándékosan elkülönítették egymástól, és azzal, hogy a laboratóriumi törzsek nagyrészt homozigóták.
A vad egerek jelentős fertőzési terhet hordoznak
A vad egereket vírusokkal és Mycoplasma pulmonisszal való fertőzésre, valamint ektoparazita és bélférgességre utaló bizonyítékokra vizsgáltuk; a beszállítók megerősítették, hogy a laboratóriumi egerek fertőzésmentesek. A különböző mikrobiális fertőzések szeroprevalenciája a percvírus esetében 22%-tól a parvovírus esetében 92%-ig terjedt (n=153 mindkét elemzésnél; 3. kiegészítő táblázat). A vadon élő egerek gyakran fertőződtek a Syphacia spp. oxyurid fonálféreggel (prevalencia 91%) és a Myocoptes musculinus atkával (prevalencia 82%) (n=181 mindkét esetben). A vadon élő egerek fertőzése nagyon gyakori volt: minden vadon élő egér megfertőződött legalább egy kórokozóval, és csak 5% (153-ból 8) volt szeronegatív az összes vírusra és a M. pulmonisra. A nemnek nem volt hatása a fertőzés intenzitására vagy gyakoriságára (3. kiegészítő táblázat).
A vad egerekben nagyon magas a szérumfehérjék koncentrációja
A vad egerekben az IgG és IgE szérumkoncentrációja 20-szor, illetve 200-szor magasabb volt, mint a laboratóriumi egerekben (2. ábra). A vadon élő egerek között az IgE-koncentráció szignifikánsan magasabb volt a nőstényeknél, mint a hímeknél (1. táblázat). Ezzel szemben a széklet IgA-koncentrációja nem különbözött szignifikánsan a vadon élő és a laboratóriumi egerek között (2. ábra, 1. táblázat). A vad egereknél az akut fázisú fehérjék, a szérum amiloid P komponens (SAP) és a haptoglobin szérumkoncentrációja is szignifikánsan magasabb volt, mint a laboratóriumi egereknél (2. ábra, 1. táblázat). Ezek a különbségek nem a vadon élő egerek magasabb teljes szérumfehérje-koncentrációjának voltak köszönhetőek, mivel az alfa-1 antitripszin (AAT) – a normál szérum stabil összetevője – koncentrációja nem különbözött a vadon élő és a laboratóriumi egerek között (2. ábra, 1. táblázat).
A vad (árnyékolt) és laboratóriumi (árnyékolatlan) egerek G-, E- és A-immunoglobulin, valamint SAP-, haptoglobin- és AAT-szérumfehérjék koncentrációja log10-es skálán látható. A dobozok középpontjai mediánok, a dobozhatárok pedig a 25. és 75. percentilisek, a whiskerek az interkvartilis tartomány 1,5-szerese, a kiugró értékeket pedig pontok jelölik. A csillagok szignifikáns különbségeket jelölnek ***P<0,001 (Mann-Whitney U-teszt; 1. táblázat), a § pedig azt jelzi, hogy további, az 1. táblázatban részletezett nemi hatások vannak. A minták méretét az 1. táblázat és az 1. kiegészítő adatok tartalmazzák.
A vad egereknél heterogénebb volt az immunglobulinok és az akut fázisú fehérjék koncentrációja a laboratóriumi egerekhez képest (2. ábra, 1. táblázat, 4. kiegészítő táblázat). Bár az SAP alapkoncentrációja részben genetikailag meghatározott13 , az SAP és a haptoglobin koncentrációja közötti jelentős korreláció (Pearson korrelációk (kétfarkú) r=0,41, P<0,0001, r=0,33, P=0,004 96 hím és 77 nőstény esetében; Kiegészítő adatok 2) arra utal, hogy a gyulladás és/vagy a fertőzés a heterogenitás valószínű kiváltó oka. A vadon élő egerek körében az IgG és IgE szérumkoncentrációja szignifikánsan pozitívan korrelált az életkorral (Pearson korreláció (kétfarkú) r>0,2, P<0,05, n≥79; Kiegészítő adatok 2), ami valószínűleg a fertőzésnek való kumulatív kitettséget tükrözi. Ez egyértelműen kimutatható az IgE-koncentrációk esetében, amelyek szignifikánsan pozitívan korreláltak a mikrobiális fertőzések számával a hím vadegereknél (Pearson korreláció (kétfarkú) r=0,23, P=0,036, n=80; Kiegészítő adatok 2). A nőstény vadegereknél a széklet IgA-koncentrációja erősen korrelált a mikrobiális fertőzések számával és az atkák számával (mikrobiális fertőzések Pearson-korreláció (kétfarkú) r=0,58, P<0,0001, n=35; atkák száma r=-0,380, P=0,01, n=45; Kiegészítő adatok 2).
A vad egerek lépsejtjei különböznek a laboratóriumi egerekétől
A vad egerek lépsejtjei sokkal kisebbek voltak (körülbelül harmadakkora tömegűek), mint a laboratóriumi egereké, és lényegesen kevesebb (körülbelül ötödakkora számú) életképes mononukleáris leukocitát tartalmaztak (1. táblázat). Még meglepőbb, hogy a vadon élő egerek lépjei szignifikánsan arányosan (azaz a testtömeghez viszonyítva) kisebbek voltak, mint a laboratóriumi egereké (1. táblázat).
Ex vivo áramlási citometriás számszerűsítés és a lép sejtpopulációk jellemzése (3., 4., 5., 6. ábra, Kiegészítő ábra. 1) kimutatta, hogy a vad egerekben a T-sejtek, B-sejtek, NK-sejtek, dendritikus sejtek, makrofágok és neutrofilek abszolút száma alacsonyabb volt, mint a laboratóriumi egerekben, ami összhangban van a lép mononukleáris sejtjeinek alacsonyabb abszolút számával (Kiegészítő adatok 1). Arányosan azonban a vadegerek lépében szignifikánsan több T-sejt, magasabb T:B-sejt arány és több CD11b+ myeloid sejt, de kevesebb NK-sejt és dendritikus sejt volt, mint a laboratóriumi egerekben (2. kiegészítő táblázat); a CD4+: CD8+ T-sejtek aránya is szignifikánsan magasabb volt a vad egerekben, mint a laboratóriumi egerekben. Ezek a különbségek összhangban vannak a T-segítő sejtek és a fagocita sejtek felhalmozódásával a vad egerek lépében szisztémás fertőzésekre adott válaszként.
Az áramlási citometriás kapuzási stratégia és a CD3+ T-sejtek alcsoportjainak arányai vad (árnyékolt) és laboratóriumi (árnyékolatlan) egerekben (a) CD4+ sejtek, (b) CD4+ Treg sejtek, (c) CD8+ sejtek és érési állapotuk, valamint (d) terminálisan differenciált CD8+ sejtek esetében. A CD4+ és CD8+ effektor/effektor memóriasejtek CD62L- CD44hi, a centrális memóriasejtek pedig CD62L+ CD44hi. A dobozok középpontjai mediánok, a dobozhatárok pedig a 25. és 75. percentilisek, a whiskerek az interkvartilis tartomány 1,5-szerese, a kiugró értékeket pedig pontok jelölik. A csillagok szignifikáns különbségeket jelölnek: *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 (Mann-Whitney U-teszt; 2. kiegészítő táblázat), a § pedig azt jelzi, hogy további, a 2. kiegészítő táblázatban részletezett nemi hatások vannak. A CD3+ limfociták kapuzási stratégiáját az 1. kiegészítő ábra mutatja. A minták méretét a 2. kiegészítő táblázat és az 1. kiegészítő adat tartalmazza.
(a) A CD19+ B-sejtek naiv (N), memória (M) vagy csíracentrum (G) B-sejtként való jellemzésére szolgáló áramlási citometriás kapuzási stratégia vad és laboratóriumi egerekben, valamint (b) e három alpopuláció arányai, (c) MHC II. osztályú expressziójuk és (d) PNA-kötésük, utóbbiak log10-es skálán feltüntetve. Az egerek vadon élő (árnyékolt) és laboratóriumi (árnyékolatlan) egerek. A dobozok középpontjai mediánok, a dobozhatárok pedig a 25. és 75. percentilisek, a whiskerek az interkvartilis tartomány 1,5-szerese, a kiugró értékeket pedig pontok jelölik. A csillagok szignifikáns különbségeket jelölnek: **P<0,01, ***P<0,001 (Mann-Whitney U teszt; 2. kiegészítő táblázat), a § pedig azt jelzi, hogy további, a 2. kiegészítő táblázatban részletezett nemi hatások vannak. A mintanagyságokat a 2. kiegészítő táblázat és az 1. kiegészítő adatok tartalmazzák. A CD19+ limfociták kapuzási stratégiája az 1. kiegészítő ábrán látható.
(a) Az áramlási citometriás kapuzási stratégia a CD11b+ CD11c- myeloid sejtek azonosítására és a myeloid sejtek aránya a lépi leukociták között vad (árnyékolt) és laboratóriumi (árnyékolatlan) egerekben, (b) a myeloid sejtek kapuzása az F4/80 és Ly6G expresszió alapján az M1 (szövetrezidens makrofágok) meghatározására, M2 (monociták), M3 (hipergranulocita myeloid sejtek, HGMC) és M4 (polimorfonukleáris leukociták, PMN) alcsoportok, c) Ly6G expresszió, amely megerősíti három sejtpopuláció jelenlétét a laboratóriumi egerekben és négy populációét a vad egerekben, d) az M1-M4 populációk oldalsó szórási jellemzői vad (árnyékolt, n≥115) és laboratóriumi (árnyékolatlan n≥57) egerekben; megjegyzendő, hogy a laboratóriumi egerekben túl kevés sejt volt jelen az M3 kapuban ahhoz, hogy pontosan meg lehessen határozni az oldalsó szórás statisztikáját, (e) az M3 (balra) és M4 (jobbra) sejtek szórási jellemzői, amelyek egy alacsony előre szórt neutrofil populációt (M5) és egy magas előre szórt myeloid származású szuppresszor sejtpopulációt (M6) mutatnak az M4 sejtek között, (f) az M1, M2, M3 és M4 alpopulációk aránya a myeloid sejtpopulációban vad (árnyékolt) és laboratóriumi (árnyékolatlan) egerekben, és (g) a CD11c+ dendritikus sejtek gátlása és arányuk a lépsejtek között vad és laboratóriumi egerekben. A dobozdiagramok esetében a dobozok középpontjai mediánok, a dobozhatárok pedig a 25. és 75. percentilisek, a whiskerek az interkvartilis tartomány 1,5-szerese, a kiugró értékeket pedig pontok jelölik. A csillagok szignifikáns különbségeket jelölnek *P<0,05, ***P<0,001 (Mann-Whitney U teszt; 2. kiegészítő táblázat), a § pedig azt jelzi, hogy további, a 2. kiegészítő táblázatban részletezett nemi hatások vannak. A minták méretét a 2. kiegészítő táblázat és az 1. kiegészítő adat tartalmazza.
(a) A CD27 és CD11b expresszióját használó áramlási citometriás kapuzási stratégia a vadon élő és laboratóriumi egerek NKp46+ CD3-mal rendelkező lépi NK-sejtjeinek 1-4. érettségi stádiumba történő osztályozásához, (b) az egyes ilyen stádiumokban lévő NK-sejtek aránya vad (árnyékolt) és laboratóriumi (árnyékolatlan) egerekben, valamint (c) a CD69 és (d) a KLRG1 expressziója az egyes alcsoportokban (2. táblázat). Szintén láthatóak (e-h) a Ly49 receptorok kapuzási stratégiái és a Ly49D és Ly49G2 különböző kombinációi, (e) Ly49D, (f) Ly49D, (g) Ly49G2 (Ly49G2+ sejtek Ly49G2-, Ly49G2low és Ly49G2high sejtekre kapuzva) és (h) Ly49H expresszáló NK sejtek aránya. A vadon élő egerek árnyékolt boxplotként, a laboratóriumi egerek árnyékolatlanul vannak ábrázolva. A dobozok középpontjai mediánok, a dobozhatárok pedig a 25. és 75. percentilisek, a whiskerek az interkvartilis tartomány 1,5-szerese, a kiugró értékeket pedig pontok jelölik, egyes tengelyek pedig log10-es skálán vannak. A csillagok szignifikáns különbségeket jelölnek: **P<0,01, ***P<0,001 (Mann-Whitney U teszt; 2. táblázat), a § pedig azt jelzi, hogy további, a 2. táblázatban részletezett nemi hatások vannak. Az NKp46+ CD3- limfociták gátlási stratégiáját az 1. kiegészítő ábra mutatja. A mintanagyságokat a 2. táblázat és az 1. kiegészítő adat tartalmazza.
A CD4+ és CD8+ T-sejtek státusza jelentősen különbözött a vad és a laboratóriumi egerek között. A CD4+ T-sejtek esetében szignifikánsan nagyobb arányban voltak effektor/effektor memória (CD62L- CD44hi) és centrális memória (CD62L+ CD44hi) sejtek (és így arányosan kevesebb volt a naiv, CD62L+ CD44low) a vad egerekben, mint a laboratóriumi egerekben (2. kiegészítő táblázat, 3a. ábra). Bár a Foxp3+ CD25+ Treg sejtekből álló CD4+ T sejtek aránya a vadon élő egereknél kis mértékben magasabb volt, mint a laboratóriumi egereknél (2. kiegészítő táblázat, 3b. ábra), ez nem volt elegendő ahhoz, hogy ellensúlyozza az effektor CD4+ T sejtek sokkal nagyobb arányát, így az effektor CD4+ T sejtek és a Tregek aránya szignifikánsan magasabb volt a vadon élő egereknél, mint a laboratóriumi egereknél (2. kiegészítő táblázat).
Hasonlóképpen, a CD8+ T-sejtek esetében a vad egereknél szignifikánsan nagyobb volt az effektor/effektor memória (CD62L- CD44hi) és a terminálisan differenciált (KLRG1+) sejtek aránya, mint a laboratóriumi egereknél (és így szignifikánsan kisebb a naiv sejtek aránya) (3c,d ábra). A vadon élő egereknek arányosan kevesebb központi memória (CD62L+ CD44hi) CD8+ T-sejtjük volt, mint a laboratóriumi egereknek; ez a különbség részben e sejtek alacsony gyakoriságának köszönhető a vadon élő hím egerekben (2. kiegészítő táblázat), de tükrözheti az antigén-tapasztalt CD8+ T-sejtek relatív megoszlását is a memória és az effektor alcsoportok között. Az effektor/effektor memória CD8+ T-sejtek és a Tregek aránya ismét szignifikánsan magasabb volt a vad egerekben, mint a laboratóriumi egerekben (2. kiegészítő táblázat).
Egyetértve azzal az elképzeléssel, hogy a gyakori vagy tartós kórokozó-kihívás az antigén-tapasztalt CD4+ és CD8+ T-sejt-alcsoportok terjeszkedését segíti elő vad egerekben, szignifikáns pozitív korreláció volt az effektor CD4+ és CD8+ T-sejtek aránya és az életkor között a nőstény vad egerek körében (Pearson korreláció (kétfarkú) életkor és effektor CD4+ r=0,62, P<0,0001, n=51; életkor és az effektor CD8+ r=0,49, P<0,0001, n=50; Kiegészítő adatok 2). Érdekes módon ezek a paraméterek nem korreláltak erősen az életkorral a hím vad egerekben (Pearson korreláció (kétfarkú) r<0,1, P>0,05, n=66), ami a hím és nőstény vad egerek eltérő immunológiai stratégiájára utal.
A lépi T-sejtek erősen primed/effektor státuszával ellentétben a vad egerek CD19+ B-limfocitái túlnyomórészt naiv fenotípusúak voltak. A lépi CD19+ B-limfocitákat naiv (CD38+ IgD+), memória (CD38+ IgD- GL7-) vagy csíracentrum (CD38lo IgD- GL7hi) sejtekként14 kategorizáltuk, és a nemrég aktivált, antigén-tapasztalt sejteket MHC II. osztályú expressziójuk és a mogyoróagglutinin (PNA; a PNA-receptor, PNA-R, expresszióját jelzi)15 (4a. ábra) alapján azonosítottuk. Nagyon magas szérum immunglobulin-koncentrációjuk ellenére a vadon élő egerek lépében szignifikánsan nagyobb arányban voltak naiv B-sejtek (és fordítva, szignifikánsan kisebb arányban memória B-sejtek), mint a laboratóriumi egerekben (4b,c ábra). Ez a kezdetben ellenkező értelmű megfigyelés valószínűleg az antigén-tapasztalt B-sejtek átcsoportosítását tükrözi a lépből a csontvelőbe, más nyirokszövetekbe vagy a fertőzés helyeire, valamint a lép folyamatos újratelepítését naiv, csontvelőből származó B-sejtekkel. A vadon élő egerek lépében arányosan több csíraközpontú B-sejt volt, mint a laboratóriumi egerekében, és a PNA-kötődés a vadon élő egerek valamennyi B-sejt-alcsoportján viszonylag magasabb volt, ami összhangban van a friss aktivációval15 (4d. ábra, 2. kiegészítő táblázat). Ezek az eredmények együttesen az aktivált CD19+ B-sejtek magas fluktuációjára utalnak a vadegerek lépében.
A vadegerek egy eddig ismeretlen myeloid sejtpopulációval rendelkeznek
Ezután a myeloid sejteket CD11b+ CD11c-nek azonosítottuk (5a. ábra), és elemeztük az F4/80 és Ly6G expressziójukat, feltárva az F4/80+ sejtek négy alpopulációját, amelyeket M1-M4-nek jelöltünk (5b-d ábra). Ezek közé tartoznak az F4/80+ Ly6G- (M1) szöveti rezidens makrofágok, az F4/80+ Ly6Glow (M2) monociták/vörös pulpa makrofágok és az F4/80+/-Ly6Ghigh (M4) polimorfonukleáris sejtek (PMN). Az M4 PMN-populációt tovább lehetett osztani neutrofilekre és myeloid eredetű szuppresszor sejtekre az előre és oldalirányú szórás jellemzői alapján (5e. ábra). Fontos, hogy a vadon élő, de nem laboratóriumi egerekben azonosítottunk egy további F4/80+ sejtekből álló populációt, amely Ly6G szintet expresszál, és amely a monocita/macrofágok és a PMN között helyezkedik el (M3). Tudomásunk szerint ez egy új, korábban le nem írt sejtpopuláció, amelyet előre- és oldalszórásos jellemzőik alapján hiper-granulocita myeloid sejteknek (HGMC) neveztünk el (5c-e ábra). Bár a Ly6G-expresszió szintje némileg eltér a vadon élő és a laboratóriumi egerek M2 és M3/M4 populációi között (5c. ábra), az egyes populációk CD11b, CD11c, valamint az előre- és oldalszórás alapján történő visszacsatolása megerősítette, hogy a vadon élő és a laboratóriumi egerek M2 populációi egyébként azonosak, és hogy a laboratóriumi egerek Ly6Gmagas populációja megegyezik a vadon élő egerek M4 populációjával (5d. ábra). Az egyes populációk oldalsó szórásának összehasonlítása azt is megerősítette, hogy a magas oldalsó szórású, hipergranulocita M3 populáció valóban csak a vad egerekben fordul elő (5f. ábra). Ezeknek a sejteknek a funkcionális jelentősége egyelőre ismeretlen, de felfedezésük hangsúlyozza, hogy a laboratóriumi egerek vizsgálata nem feltétlenül tárja fel az immunrendszer teljes fegyverzetét.
A vad egerek lépében nemcsak arányosan több CD11b+ CD11c- myeloid sejt volt, mint a laboratóriumi egerekben, hanem a myeloid populáción belül a PMN és HGMC a makrofágok és monociták rovására feldúsult (5a,f ábra, 2. kiegészítő táblázat). A neutrofilek és HGMC-k elszaporodása és/vagy felhalmozódása a vadon élő egerek lépében összhangban van a vadon élő egerek friss vagy aktuális fertőzésnek való kitettségével. A lép CD11c+ dendritikus sejtjei arányosan ritkábbak voltak a vad egerekben, mint a laboratóriumi egerekben (5g. ábra, 2. kiegészítő táblázat).
A vadegerek NK-sejtjei erősen aktiváltak
A CD27 és CD11b expressziója alapján az NKp46+ CD3ɛ- NK-sejteket (6. ábra) korai (1. szakasz), közepes (2. szakasz), késői (3. szakasz) vagy teljesen (4. szakasz) érett sejtekként jellemeztük (6a. ábra). A vadon élő egerekben magasabb volt az 1. és 2. stádiumú sejtek aránya és alacsonyabb a 3. és 4. stádiumú lépi NK-sejtek aránya, ami a korai/közepes stádiumú NK-sejtek és a késői/érett NK-sejtek szignifikánsan magasabb arányát eredményezte, mint a laboratóriumi egerekben (6b. ábra, 2. táblázat). A CD69 friss/korai aktivációs marker kifejeződése a vadegerek NK-sejtjeinek minden alcsoportján magasabb volt a laboratóriumi egerekhez képest (6c. ábra, 2. táblázat), de – az 1. stádiumú sejtek kivételével – a KLRG1 terminális differenciálódási marker kifejeződése általában alacsonyabb volt (6. ábra, 2. táblázat). Ezek az adatok együttesen összhangban vannak a vadon élő egerek lépi NK-sejtjeinek aktivációjával, önmegújulásával és homeosztatikus terjeszkedésével16 , és így a laboratóriumi egerekhez képest nagyobb mértékű turnoverjével.
A következőkben a C-típusú lektin szabályozó receptorok Ly49 családjának expresszióját vizsgáltuk az NK-sejteken (Ábra. 6e-h), arra gondolva, hogy a Ly49 receptorcsalád tagjainak sztochasztikus expressziója az egyes NK-sejteken a populáció genetikai sokféleségével kombinálva az NK-sejtek heterogenitását eredményezheti az egyeden belül és az NK-sejtek fenotípusának kiterjedt variációját az egyedek között11. A gátló Ly49 receptorok felismerik a saját MHC I. osztályú sejteket és megakadályozzák, hogy az NK sejtek egészséges sejteket öljenek, míg a kórokozóhoz kapcsolódó ligandumokat felismerő Ly49 receptorok az NK sejtek aktiválódásához és a fertőzött sejtek elpusztításához vezetnek; a legjobban leírt példa erre a Ly49H kötődése az egér citomegalovírus (MCMV) m157 glikoproteinjéhez, amely az MCMV-vel szembeni védő immunitást közvetíti (ref. 17).
Elemeztük két aktiváló receptor (Ly49D és Ly49H) és egy gátló receptor (Ly49G2) expresszióját. A legtöbb C57BL/6 laboratóriumi egér esetében az NK-sejtek Ly49D-t, Ly49G-t és Ly49H-t expresszáltak (6e-h ábra), az NK-sejtek 5-45%-a expresszálta az egyes receptorokat, ami összhangban van korábbi jelentésekkel18. Ezzel szemben nagyon kevés vadon élő egérben volt Ly49H+ NK-sejt (10%, n=125, a Ly49H+ sejtek ≥1%-a, Kiegészítő adatok 1), ami arra utal, hogy az ezt a receptort kódoló gén ritka ebben a vadon élő egérpopulációban, vagy hogy az allélvariáció kizárja az anti-Ly49H antitest általi felismerést. Az egerek Ly49h lókuszában genotipizáltunk egy olyan deléciót, amely az MCMV iránti fogékonysággal van összefüggésben (17. hivatkozás), és azt találtuk, hogy a vad egerek 18%-a homozigóta volt erre a delécióra (95%-os konfidenciaintervallum 9,5-30%, n=98 egér a HW-helyről; a deléciós allél gyakorisága 0,42, Hardy-Weinberg egyensúlyt feltételezve). Ez valószínűleg részben hozzájárul a Ly49H+ NK-sejtek ritkaságához a vad egerek körében, de kérdéseket vet fel a Ly49h lokusz további null alléljainak jelenlétével kapcsolatban, és hogy más receptorok kompenzálhatják-e a Ly49H hiányát a vad egerekben, különösen az MCMV magas prevalenciáját figyelembe véve a vad egérpopulációkban, amely a jelentések szerint 62 és 79% (hivatkozások 19, 20). A Ly49H nyilvánvaló hiánya a vad egerek körében magyarázatot adhat az alternatív aktiváló receptor, a Ly49D sokkal gyakoribb expressziójára, és arra utal, hogy fontos különbségek lehetnek a vad és a laboratóriumi egerek között az NK-sejtek funkcionális immunitáshoz való hozzájárulásában.
A Ly49G2 sejtek három populációját azonosítottuk: Ly49G2-, Ly49G2low és Ly49G2high (6g ábra). A vadon élő egerek között a legtöbb Ly49G2+ sejt Ly49G2low volt, míg a laboratóriumi egerekben a Ly49G2high sejtek domináltak. Ez arra utal, hogy a Ly49G2 kódoló lókuszban különböző allélek vannak jelen a vadon élő és a laboratóriumi populációkban. A laboratóriumi egerek körében a Ly49G receptor expressziójának törzsek közötti különbségeit a promóter aktivitás allélváltozataival hozták összefüggésbe21 , és ez befolyásolhatja az NK-sejtek aktiválódásának küszöbértékét18. Ezek az adatok alátámasztják azt az elképzelést, hogy a Ly49-receptorok között kiterjedt, eddig nem dokumentált allélváltozatosság van, amely valószínűleg fontos következményekkel jár a vadon élő NK-sejtek működésére nézve.
Az aktiváló és gátló Ly49-receptorok NK-sejteken történő expressziójának egyensúlyát kívántuk megérteni, ezért összehasonlítottuk a Ly49D és Ly49G2 receptort expresszáló vagy nem expresszáló NK-sejtek arányát (6e. ábra). A vad egerekben szignifikánsan magasabb volt a Ly49D+G- sejtek aránya, mint a laboratóriumi egerekben, míg a laboratóriumi egerekben szignifikánsan magasabb volt a Ly49D-G+ sejtek aránya, mint a vad egerekben (2. táblázat), ami arra utal, hogy a vad egerek NK-sejtjeinek alacsonyabb lehet az aktivációs küszöbük, bár ezt nagyban befolyásolja az MHC I. osztályú genotípus és az itt nem vizsgált egyéb Ly49-receptorok kifejeződése. Ezek az eredmények együttesen azt mutatják, hogy a vadon élő egerek NK-sejtjei sokkal könnyebben aktiválhatók és aktiválódnak, mint a laboratóriumi egereké, ami a vadon élő környezet magas kórokozó-terhelésére adott szükséges válasz lehet.
A vad egereknek csökkent citokinválaszuk van a PAMP-okra
A vad egerek sejtes immunrendszerének magasan aktivált állapotára tekintettel a funkcionális immunválaszt úgy mértük, hogy lépsejteket tenyésztettünk PAMP-ok jelenlétében (CpG, az endoszómálisan expresszált TLR9 liganduma; PG, egy TLR2 agonista; bakteriális LPS, a TLR4 ligandja) és egy mitogén (a CD3 és CD28 T-sejt felszíni molekulák elleni monoklonális antitestek). A vad és laboratóriumi egerek között végzett 45 összehasonlítás (5 tenyésztési körülmény × 9 citokin) közül csak 16 szignifikáns különbséget figyeltünk meg a vad és laboratóriumi egerek között, és ezek közül 13-ban az analitkoncentrációk szignifikánsan alacsonyabbak voltak a vad egerekben (7. ábra, 1. kiegészítő adat, 5. kiegészítő táblázat). Külön kiemelendő, hogy a vad egerek szignifikánsan kevesebb IL-12-t (p40 és p70) és kevesebb IL-13-at termeltek, mint a laboratóriumi egerek a kórokozóval kapcsolatos ligandumok hatására, és tendencia volt az is, hogy az IL-10 termelése is alacsonyabb volt a vad egerekben, bár ez csak a kiindulási értéken volt szignifikáns. Ezek a viszonylag lecsökkent citokinválaszok jelentős ellentétben állnak a vad egerek erősen aktivált sejtes immunállapotával. Feltételezésünk szerint a veleszületett immuntolerancia valamilyen formája korlátozhatja a gyulladás mértékét a krónikusan és erősen patogénnek kitett vad egerekben. Az egyetlen citokinválasz, amely szignifikánsan magasabb volt a vad egerekben, mint a laboratóriumi egerekben, az anti-CD3/anti-CD28-ra adott IFN-γ, IL-4 és MIP-2α válaszok voltak, ami összhangban van a memória- és effektor T-sejtek magasabb arányával a vad egerekben. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a veleszületett citokinválaszokat és azok funkcionális hatásait újra kell értékelni laboratóriumi egerekben.
Kilenc citokin (IFN-γ, IL-1β, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12p40, IL-12p70, IL-13, IL-12p40, IL-13, MIP-2α), amelyet anti-CD3/anti-CD28-mal, CpG-vel, LPS-szel vagy PG-vel stimulált lépi limfociták termeltek az RPMI kontrollhoz képest vad (árnyékolt) és laboratóriumi (árnyékolatlan) egerekben, log10-es skálán ábrázolva. A dobozok középpontjai mediánok, a dobozhatárok pedig a 25. és 75. percentilisek, a whiskerek az interkvartilis tartomány 1,5-szerese, a kiugró értékeket pedig pontok jelölik. A szaggatott vízszintes vonalak az összes elemzett lemezre vonatkozó standard görbékből meghatározott mennyiségi meghatározás alsó határának mediánját mutatják minden egyes citokin esetében. A csillagok szignifikáns különbségeket jelölnek: *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 (Mann-Whitney U-teszt; 5. kiegészítő táblázat). A mintanagyságok az 1. kiegészítő adatokban és az 5. kiegészítő táblázatban szerepelnek.