A estratégia da citometria de fluxo e as proporções de subconjuntos de células T CD3+ em ratos selvagens (sombreados) e de laboratório (não sombreados) para (a) células CD4+, (b) células CD4+ Treg, (c) células CD8+ e seu estado de maturação e (d) células CD8+ terminalmente diferenciadas. As células CD4+ e CD8+ effector/efector de memória são definidas como CD62L- CD44hi e as células de memória central são CD62L+ CD44hi. Os centros da caixa são medianas, e a caixa limita os percentis 25 e 75, os bigodes 1,5 vezes o intervalo interquartil e os outliers são representados por pontos. Os asteriscos denotam diferenças significativas como *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 (Teste Mann-Whitney U; Tabela Complementar 2), e § denota que há efeitos sexuais adicionais detalhados na Tabela Complementar 2. A estratégia de alimentação para linfócitos CD3+ é mostrada na Fig. 1 do Suplemento. Os tamanhos das amostras são mostrados na Tabela Complementar 2 e Dados Suplementares 1.

(a) A estratégia da citometria de fluxo para caracterizar as células CD19+ B como células naïve (N), memória (M) ou centro germinal (G) B em ratos selvagens e de laboratório, e (b) as proporções destas três subpopulações, (c) sua expressão de MHC classe II e (d) ligação de PNA, com esta última mostrada em uma escala log10. Os ratos são selvagens (sombreados) e de laboratório (não sombreados). Os centros da caixa são medianas, e a caixa limita os percentis 25 e 75, os bigodes 1,5 vezes o intervalo interquartil e os outliers são representados por pontos. Os asteriscos denotam diferenças significativas como **P<0,01, ***P<0,001 (Teste Mann-Whitney U; Tabela Complementar 2), e § denota que existem efeitos sexuais adicionais detalhados na Tabela Complementar 2. Os tamanhos das amostras são mostrados na Tabela Complementar 2 e nos Dados Suplementares 1. A estratégia de alimentação para linfócitos CD19+ é mostrada na Figura Suplementar 1.

(a) A estratégia da citometria de fluxo para identificar células mielóides CD11b+ CD11c e a proporção de células mielóides entre os leucócitos esplênicos em ratos selvagens (sombreados) e de laboratório (não sombreados), (b) células mielóides de fluxo na expressão F4/80 e Ly6G para definir M1 (macrófagos residentes no tecido), M2 (monócitos), M3 (células mielóide hipergranulocíticas, HGMC) e M4 (leucócitos polimorfonucleares, PMN) subconjuntos, (c) expressão Ly6G confirmando a presença de três populações celulares em ratos de laboratório e quatro populações em ratos selvagens, (d) características de dispersão lateral das populações M1-M4 em ratos selvagens (sombreados, n≥115) e de laboratório (não sombreados n≥57); note que muito poucas células estavam presentes no portão M3 em ratos de laboratório para determinar com precisão uma estatística de dispersão lateral, (e) características de dispersão das células M3 (esquerda) e M4 (direita), revelando uma baixa população de neutrófilos de dispersão frontal (M5) e uma alta população de células supressoras derivadas do mielóide de dispersão frontal (M6) entre as células M4, (f) proporções de subpopulações M1, M2, M3 e M4 entre a população de células mielóides em ratos selvagens (sombreados) e de laboratório (não sombreados), e (g) portais de células dendríticas CD11c+ e suas proporções entre os esplenócitos em ratos selvagens e de laboratório. Para as parcelas de caixa, os centros de caixa são medianas, e a caixa limita os percentis 25 e 75, os bigodes 1,5 vezes o intervalo interquartil e os outliers são representados por pontos. Os asteriscos denotam diferenças significativas como *P<0,05, ***P<0,001 (Teste Mann-Whitney U; Tabela Complementar 2), e § denota que há efeitos sexuais adicionais detalhados na Tabela Complementar 2. Os tamanhos das amostras são mostrados na Tabela Complementar 2 e nos Dados Suplementares 1.

(a) A estratégia da citometria de fluxo usando a expressão de CD27 e CD11b para classificar as células NKp46+ CD3- splenic NK de ratos selvagens e de laboratório nos estágios 1-4 de maturidade, b) As proporções de células NK em cada uma dessas fases, em ratos selvagens (sombreados) e de laboratório (sem sombra), e expressão de (c) CD69 e (d) KLRG1 por cada subconjunto (Tabela 2). Também são mostradas (e-h) as estratégias de alimentação para receptores Ly49 e as proporções de células NK expressando, (e) diferentes combinações de Ly49D e Ly49G2, (f) Ly49D, (g) Ly49G2 (Ly49G2+ células fechadas em Ly49G2-, Ly49G2low e Ly49G2high cells) e (h) Ly49H. Os ratos selvagens são mostrados como caixas sombreadas, os ratos de laboratório como não sombreados. Os centros da caixa são medianos e a caixa limita os percentis 25 e 75, os bigodes 1,5 vezes o intervalo interquartil e os outliers são representados por pontos e alguns eixos estão numa escala de log10. Os asteriscos denotam diferenças significativas como **P<0,01, ***P<0,001 (teste Mann-Whitney U; Tabela 2), e § denota que existem efeitos sexuais adicionais detalhados na Tabela 2. A estratégia de alimentação para NKp46+ CD3- linfócitos é mostrada na Fig. 1 suplementar. Os tamanhos das amostras são mostrados na Tabela 2 e nos Dados Suplementares 1.

O status das células T CD4+ e CD8+ foi marcadamente diferente entre ratos selvagens e de laboratório. Para CD4+ as células T foram proporções significativamente maiores em ratos selvagens (CD62L- CD44hi) e células de memória central (CD62L+ CD44hi) (e assim proporcionalmente menos eram ingênuas, CD62L+ CD44low), em ratos selvagens comparado com ratos de laboratório (Tabela Complementar 2, Fig. 3a). Embora as proporções de células T CD4+ que eram células Foxp3+ CD25+ Treg fossem marginalmente maiores entre os ratos selvagens do que entre os ratos de laboratório (Tabela Suplementar 2, Fig. 3b), isto foi insuficiente para compensar a proporção muito maior de células T effector CD4+ de tal forma que as proporções de células T effector CD4+ para Tregs eram significativamente maiores entre os ratos selvagens do que entre os ratos de laboratório (Tabela Suplementar 2, Fig. 2).

Similiarmente, para as células CD8+ T os ratos selvagens tinham uma proporção significativamente maior de células effector/efector de memória (CD62L- CD44hi) e células terminalmente diferenciadas (KLRG1+) do que os ratos de laboratório (e por isso proporções significativamente menores de ingenuidade) (Fig. 3c,d). Ratos selvagens também tinham proporcionalmente menos células CD8+ T de memória central (CD62L+ CD44hi) do que ratos de laboratório; esta diferença foi devida em parte à baixa frequência destas células em ratos selvagens machos (Tabela Complementar 2), mas também pode refletir a distribuição relativa de células CD8+ T com experiência em antígenos entre a memória e os subconjuntos effector. Novamente, a proporção de células T CD8+ de memória efetora/efeitora para Tregs foi significativamente maior em ratos selvagens do que em ratos de laboratório (Tabela Suplementar 2).

Consistente com a idéia de que o desafio patogênico frequente ou persistente impulsiona a expansão dos subconjuntos de células T CD4+ e CD8+ com experiência em antígenos em ratos selvagens, houve correlações positivas significativas entre as proporções de células T CD4+ e CD8+ e idade entre ratos selvagens fêmeas (correlações de Pearson (duas caudas) idade e CD4+ r=0,62, P<0,0001, n=51; idade e efetor CD8+ r=0,49, P<0,0001, n=50; Dados Suplementares 2). Curiosamente, estes parâmetros não foram fortemente correlacionados com a idade em ratos selvagens machos (correlação de Pearson (duas caudas) r<0,1, P>0,05, n=66) apontando para diferentes estratégias imunológicas de ratos machos e fêmeas na natureza.

Em contraste com o status altamente primed/efeitoral das células T esplênicas, os linfócitos CD19+ B de ratos selvagens tinham predominantemente um fenótipo ingênuo. Classificamos os linfócitos CD19+ B esplênicos como células naïves (CD38+ IgD+), de memória (CD38+ IgD- GL7-) ou de centro germinal (CD38lo IgD- GL7hi)14, e identificamos células recentemente ativadas, com experiência antigênica pela sua expressão MHC classe II e ligação de aglutinina de amendoim (PNA; indicando a expressão do receptor de PNA, PNA-R)15 (Fig. 4a). Apesar de suas concentrações séricas muito elevadas de imunoglobulina, os baços de ratos selvagens continham proporções significativamente maiores de células B ingênuas (e, reciprocamente, proporções significativamente menores de células B de memória) do que os ratos de laboratório (Fig. 4b,c). Esta observação inicialmente contra-intuitiva provavelmente reflete a realocação de células B com experiência em antígenos do baço para a medula óssea, para outros tecidos linfóides, ou para locais de infecção, juntamente com o repovoamento contínuo do baço por células B ingênuas, derivadas da medula óssea. Os ratos selvagens tinham proporcionalmente mais células B do centro germinal no baço do que os ratos de laboratório e a ligação do PNA era comparativamente mais elevada em todos os subconjuntos de células B em ratos selvagens, consistente com a activação recente15 (Fig. 4d, Tabela Suplementar 2). Juntos estes resultados apontam para uma alta rotatividade de células CD19+ B ativadas em baços selvagens de camundongos.

Ratos selvagens têm uma população até então desconhecida de células mielóides

A seguir identificamos células mielóides como CD11b+ CD11c- (Fig. 5a) e analisamos sua expressão de F4/80 e Ly6G, revelando quatro subpopulações de células F4/80+, denominadas M1-M4 (Fig. 5b-d). Estas incluem F4/80+ Ly6G- (M1) macrófagos residentes no tecido, F4/80+ Ly6Glow (M2) monócitos/ macrófagos de polpa vermelha e F4/80+/-Ly6Ghigh (M4) células polimorfonucleares (PMN). A população de M4 PMN poderia ser ainda dividida em neutrófilos e células supressoras derivadas de mielóide, com base nas suas características de dispersão para a frente e para o lado (Fig. 5e). Importante, em ratos selvagens, mas não em laboratório, identificamos uma população adicional de células F4/80+ expressando níveis de Ly6G que são intermediários entre monócitos/macrófagos e PMN (M3). Tanto quanto sabemos, esta é uma nova população de células não descrita anteriormente, que denominamos células mielóide hiper-granulocíticas (HGMC) com base nas suas características de dispersão frontal e lateral (Fig. 5c-e). Embora existam algumas pequenas diferenças nos níveis de expressão de Ly6G entre as populações de M2 e M3/M4 em ratos selvagens e de laboratório (Fig. 5c) retroalimentação de cada população em CD11b, CD11c, e dispersão para a frente e para o lado confirmaram que as populações de M2 em ratos selvagens e de laboratório são idênticas e que a população de Ly6G elevada em ratos de laboratório é equivalente à população de M4 em ratos selvagens (Fig. 5d). A comparação da dispersão lateral para cada população também confirma que a alta dispersão lateral, hipergranulocítica população M3 é de fato vista apenas em camundongos selvagens (Fig. 5f). O significado funcional destas células é ainda desconhecido, mas a sua descoberta enfatiza que o estudo de ratos de laboratório não revela necessariamente o armamento completo do sistema imunológico.

Ratos selvagens não só tinham proporcionalmente mais CD11b+ CD11c – células mielóides no baço do que os ratos de laboratório, mas, dentro da população mielóide, PMN e HGMC foram enriquecidos à custa de macrófagos e monócitos (Fig. 5a,f, Tabela Suplementar 2). A expansão e/ou acumulação de neutrófilos e HGMC em baços de ratos selvagens é consistente com a exposição recente ou actual à infecção em ratos selvagens. As células esplênicas CD11c+ dendríticas foram proporcionalmente mais raras em camundongos selvagens em comparação com camundongos de laboratório (Fig. 5g, Tabela Suplementar 2).

Células NK de camundongos selvagens são altamente ativadas

Caracterizamos as células NK46+ (Fig. 6) como células precoces (estágio 1), médias (estágio 2), tardias (estágio 3) ou totalmente (estágio 4) células maduras por expressão de CD27 e CD11b (Fig. 6a). Ratos selvagens tinham proporções mais altas de células dos estágios 1 e 2 e proporções mais baixas de células NK esplênicas dos estágios 3 e 4, resultando em proporções significativamente mais altas de células NK precoces/médio estágio do que as células NK maduras (Fig. 6b, Tabela 2). A expressão do marcador de ativação recente/anterior CD69 foi maior em todos os subconjuntos de células NK de camundongos selvagens do que em camundongos de laboratório (Fig. 6c, Tabela 2), mas – diferente da expressão do marcador de diferenciação terminal KLRG1 no estágio 1 – tendeu a ser menor (Fig. 6, Tabela 2). Juntos, esses dados são consistentes com ativação, auto-renovação e expansão homeostática16 e, portanto, maiores taxas de rotatividade, de células NK esplênicas de ratos selvagens em comparação com ratos de laboratório.

Em seguida, exploramos a expressão da família Ly49 de receptores reguladores de lectin tipo C em células NK (Fig. 6c, Tabela 2). 6e-h) raciocinando que a expressão estocástica de membros da família de receptores Ly49 em células NK individuais combinadas com a diversidade genética da população poderia levar à heterogeneidade das células NK dentro de um indivíduo e a extensa variação no fenótipo de células NK entre indivíduos11. Os receptores inibitórios de Ly49 reconhecem auto-MHC classe I e impedem que as células NK matem células saudáveis, enquanto os receptores de Ly49 que reconhecem ligandos associados ao patógeno levam à ativação das células NK e à morte das células infectadas; o melhor exemplo descrito é a ligação do Ly49H ao citomegalovírus murino (MCMV) m157 glicoproteína que medeia a imunidade protetora ao MCMV (ref. 17).

Analisamos a expressão de dois receptores ativadores (Ly49D e Ly49H) e um receptor inibitório (Ly49G2). Para a maioria dos ratos de laboratório C57BL/6, as células NK expressaram Ly49D, Ly49G e Ly49H (Fig. 6e-h) com 5-45% das células NK expressando cada um dos receptores, consistente com relatos anteriores18. Em contraste, muito poucos ratos selvagens tinham quaisquer células Ly49H+ NK (10%, n=125, ≥1% das células Ly49H+, Dados Suplementares 1), sugerindo que o gene que codifica este receptor é raro nesta população de ratos selvagens ou que a variação alélica impede o reconhecimento pelo anticorpo anti-Ly49H. Genotipamos ratos no locus Ly49h para uma deleção que está associada à suscetibilidade ao MCMV (ref. 17), encontrando que 18% dos ratos selvagens eram homozigotos para esta deleção (intervalo de confiança 95% 9,5-30%, n=98 ratos do local HW; frequência do alelo de deleção 0,42 assumindo o equilíbrio de Hardy-Weinberg). Isto provavelmente contribui parcialmente para a escassez de células Ly49H+ NK entre ratos selvagens, mas levanta questões sobre a presença de alelos nulos adicionais no locus Ly49h, e se outros receptores podem compensar a falta de Ly49H em ratos selvagens, especialmente dada a alta prevalência de MCMV nas populações de ratos selvagens, relatada como sendo de 62 e 79% (refs 19, 20). A aparente ausência de Ly49H entre os ratos selvagens pode explicar a sua expressão muito mais frequente do receptor alternativo de activação Ly49D e sugere que podem existir diferenças importantes entre ratos selvagens e de laboratório nas contribuições das células NK para a imunidade funcional.

Identificámos três populações de células Ly49G2: Ly49G2-, Ly49G2low e Ly49G2high (Fig. 6g). Entre os ratos selvagens, a maioria das células Ly49G2+ eram Ly49G2low, enquanto que no laboratório predominavam as células Ly49G2high. Isto sugere a presença de diferentes alelos no local de codificação do Ly49G2 na natureza e nas populações de laboratório. Entre os ratos de laboratório, as diferenças de expressão entre estirpes nos receptores de Ly49G foram ligadas à variação alélica na actividade promotora21 e podem influenciar o limiar de activação das células NK18. Estes dados apoiam a idéia de que existe uma diversidade alélica extensa, até então não documentada, entre os receptores Ly49, com prováveis consequências importantes para a função das células NK na natureza.

Quisemos entender o equilíbrio da expressão dos receptores Ly49 ativadores e inibitórios nas células NK, e assim comparamos as proporções de células NK que expressam ou não Ly49D e Ly49G2 (Fig. 6e). Ratos selvagens tinham proporções significativamente mais elevadas de células Ly49D+G- do que ratos de laboratório, enquanto que os ratos de laboratório tinham proporções significativamente mais elevadas de células Ly49D-G+ do que os ratos selvagens (Tabela 2), sugerindo que as células NK de ratos selvagens podem ter um limiar de activação mais baixo, embora isto seja fortemente influenciado pelo genótipo MHC classe I e pela expressão de outros receptores Ly49 não ensaiados aqui. Juntos estes resultados mostram que as células NK de ratos selvagens podem ser, e são, muito mais facilmente activadas do que as de ratos de laboratório, o que pode ser uma resposta necessária à elevada carga patogénica do ambiente selvagem.

Ratos selvagens têm respostas reduzidas de citocinas aos PAMPs

Tendo em conta o estado altamente activado do sistema imunitário celular dos ratos selvagens, medimos a resposta imunitária funcional através do cultivo de esplenócitos na presença de PAMPs (CpG, o ligante para o TLR9 expresso endossomicamente; PG, um agonista TLR2; LPS bacteriano, um ligante para TLR4) e um mitógeno (anticorpos monoclonais para as moléculas de superfície das células T CD3 e CD28). Entre as 45 comparações feitas entre ratos selvagens e de laboratório (5 condições de cultura × 9 citocinas) apenas 16 diferenças significativas entre ratos selvagens e de laboratório foram observadas, e em 13 dessas concentrações de analito foram significativamente mais baixas nos ratos selvagens (Fig. 7, Dados Suplementares 1, Tabela Suplementar 5). Particularmente, ratos selvagens produziram significativamente menos IL-12 (p40 e p70) e menos IL-13 que os ratos de laboratório em resposta aos ligandos patogênicos e também houve uma tendência para a produção de IL-10 ser menor em ratos selvagens, embora isso só tenha sido significativo na linha de base. Estas respostas comparativamente deprimidas de citocinas contrastam significativamente com o estado imunológico celular altamente ativado de camundongos silvestres. Especulamos que alguma forma de tolerância imunológica inata pode estar operando para limitar o grau de inflamação em ratos selvagens cronicamente e altamente expostos a patógenos. As únicas respostas de citocinas que foram significativamente mais elevadas em ratos selvagens do que em ratos de laboratório foram as respostas IFN-γ, IL-4 e MIP-2α ao anti-CD3/anti-CD28, que são consistentes com as maiores proporções de memória e células T effector em ratos selvagens. Estes resultados sugerem que as respostas inatas de citocinas, e seus efeitos funcionais, podem precisar ser reavaliadas em ratos de laboratório.

As concentrações de nove citocinas (IFN-γ, IL-1β, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12p40, IL-12p70, IL-13, MIP-2α) produzido por linfócitos esplênicos estimulados com anti-CD3/anti-CD28, CpG, LPS ou PG em comparação com o controle RPMI em ratos selvagens (sombreados) e de laboratório (não sombreados), mostrado em uma escala log10. Os centros da caixa são medianas, e a caixa limita os percentis 25 e 75, os bigodes 1,5 vezes o intervalo interquartil, e os outliers são representados por pontos. As linhas horizontais pontilhadas mostram o limite inferior médio de quantificação definido a partir de curvas padrão em todas as placas analisadas para cada citocina. Os asteriscos denotam diferenças significativas como *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 (Teste Mann-Whitney U; Tabela suplementar 5). Os tamanhos das amostras são mostrados nos Dados Suplementares 1 e na Tabela Complementar 5.