A community resource
野生マウス460匹の免疫学データセットをコミュニティリソースとして提供（補足データ1）しています。 この中から、1つのサイト（サイトHW、図1a、補足表1）から得られた181匹の野生マウスのサブセット（雄100匹、雌81匹）を、実験室で飼育された病原体を持たないC57BL/6マウス64匹（雄24匹、雌40匹）と詳細に比較する。 この比較の結果を表1,2および補足表2に示すが、後者は大きすぎて本文に収まらない。
Wild mice are immunologically different from laboratory mice
野生（HW）マウスと実験（C57/BL6）マウスの血清学および形態学パラメータは表1にまとめた。 野生マウスは実験用マウスよりはるかに小さく（体重は半分程度）、野生マウスの中では、年齢、体長、質量はいずれも高い相関を示した（体長と質量、ピアソン相関（両側）r=0.79、年齢と質量、r=≧0.77、年齢と体長、r=0.58、P<0.001、n>80で雄雌別）（補足資料2）。 野生マウスの年齢中央値は6.6週（範囲1-39.5）であり、多くの免疫パラメータは年齢や体格と相関していたが、これは感染への累積曝露によるものと思われた（補足データ2）。 62の免疫学的測定項目のうち、最も多くの項目（57項目）が野生マウスと実験室マウスの間で異なっていた（表1、表2、補足表2）。 また、野生マウスでは雄雌の免疫学的な有意差はほとんどなく（62項目中6項目）、実験用マウスでは免疫学的に性差があった（62項目中18項目）（表1、表2、補足表2）
多座遺伝子型判定では、HW野生マウスは構造化されていない、遺伝的に多様な集団であることがわかった（図1b、補遺データ3）。 野生マウスは実験用マウス10系統とは遺伝的に異なり、実験用系統は野生マウスよりも遺伝的に多様である。 このような野生マウスと実験用マウスの遺伝的関係は、実験用マウスゲノムのモザイク化4、実験用マウスが何世代にもわたって意図的に分離されてきたこと、実験用系統がほぼホモ接合体であることなどで説明できることが示唆された。
野生マウスの感染負担は大きい
野生マウスについて、ウイルスや肺マイコプラズマの感染、外部寄生虫や腸管線虫の感染の有無をスクリーニングし、供給者は実験マウスの無感染を確認している。 各微生物感染の血清有病率は，ミニッツウイルス22%からパルボウイルス92%であった（両解析ともn=153，補足表3）． 野生マウスは，オキシライド線虫Syphacia spp.（有病率91％）およびダニMyocoptes musculinus（有病率82％）によく感染していた（いずれもn=181）． 野生のマウスへの感染は非常に多く，すべての野生のマウスが少なくとも1つの病原体に感染しており，すべてのウイルスとM. pulmonisに対して血清陰性を示したのは5%（153匹中8匹）だけであった． 野生マウスは血清タンパクの濃度が非常に高い
野生マウスの血清中のIgGとIgE濃度は実験室マウスの20倍と200倍であった（図2）． 野生マウスでは、IgE濃度は雄よりも雌で有意に高かった（表1）。 一方、糞便中のIgA濃度は、野生マウスと実験室マウスの間で有意な差はなかった（図2、表1）。 野生マウスは、急性期タンパク質である血清アミロイドP成分（SAP）およびハプトグロビンの血清濃度も実験用マウスに比べ有意に高かった（図2、表1）。 正常血清の安定成分であるα-1アンチトリプシン（AAT）の濃度は野生マウスと実験室マウスで差がなかったため、これらの差は野生マウスの血清総タンパク質濃度が高いことによるものではなかった（図2, 表1）。
野生（斜線）マウスと実験（斜線なし）マウスの免疫グロブリンG、E、AおよびSAP、ハプトグロビンおよびAAT血清タンパク質濃度を対数の単位で示す。 箱の中心は中央値、箱の限界は25％と75％、ひげは四分位範囲の1.5倍、外れ値はドットで表している。 アステリスクは ***P<0.001 (Mann-Whitney U test; Table 1) のように有意差を示し、§は Table 1 で詳述した性差の影響が追加されていることを示す。 サンプルサイズは表1および補足データ1に示す。
野生マウスは実験用マウスと比較して、免疫グロブリンおよび急性期タンパク質の濃度がより不均一であった（図2、表1、補足表4）。 ベースラインのSAP濃度は部分的に遺伝的に決定されるが13、SAPとハプトグロビン濃度の間の有意な相関（ピアソン相関（両側）、雄96匹と雌77匹、それぞれr = 0.41, P<0.0001, r=0.33, P=0.004; 補足資料2）は、炎症や感染がこの不均一性を引き起こす可能性が高いと示唆された。 野生マウスでは、IgGとIgEの血清濃度は年齢と有意に正の相関があり（ピアソン相関（両側）r>0.2, P<0.05, n≥79; Supplementary Data 2）、感染への累積暴露を反映していると考えられた。 これはIgE濃度に顕著で、雄の野生マウスでは微生物感染回数と有意な正の相関が見られた（ピアソン相関（両側）r=0.23, P=0.036, n=80; Supplementary Data 2）。 雌の野生マウスでは、糞便中IgA濃度は微生物感染数およびダニ数と高い相関を示した（微生物感染 ピアソン相関（両側） r=0.58, P<0.0001, n=35; ダニ数 r=-0.380, P=0.01, n=45; Supplemental Data 2）。
野生マウスの脾臓細胞は実験用マウスと異なる
野生マウスの脾臓は実験用マウスに比べてかなり小さく（約1/3の質量）、生存する単核白血球はかなり少ない（約1/5の数）（Table 1）。 さらに驚くべきことに、野生マウスの脾臓は実験用マウスの脾臓よりも有意に比例して（つまり、体格と比較すると）小さかった（表1）。
脾臓細胞集団のex vivoフローサイトメトリー定量および特性評価（図3、4、5、6、補足図、Subsupplement Fig. 1）の結果、野生マウスは実験用マウスに比べてT細胞、B細胞、NK細胞、樹状細胞、マクロファージ、好中球の絶対数が少なく、脾臓単核細胞の絶対数の少なさと一致していた（Supplementary Data 1）。 しかし、比例して、野生マウスの脾臓は実験用マウスに比べてT細胞が有意に多く、T：B細胞比が高く、CD11b+骨髄系細胞が多いが、NK細胞と樹状細胞は少なかった（補足表2）； CD4+…の比率は実験用マウスに比べて低かった。 CD4+：CD8+T細胞の比率も実験用マウスに比べ野生マウスで有意に高かった。 これらの違いは、全身感染に反応して野生マウスの脾臓にTヘルパー細胞や食細胞が蓄積することと一致する。
野生（斜線）マウスおよび実験（斜線なし）マウスにおけるCD3+T細胞のサブセットのフローサイトメトリ・ゲーティング戦略と割合について（a）CD4+細胞、（b）CD4+Treg細胞、（c）CD8+細胞とその成熟状態、（d）終末分化CD8+細胞について説明。 CD4+およびCD8+エフェクター/エフェクターメモリー細胞はCD62L- CD44hi、セントラルメモリー細胞はCD62L+ CD44hiと定義される。 箱の中心は中央値、箱の限界は25％と75％、ひげは四分位範囲の1.5倍、外れ値はドットで表している。 アスタリスクは、*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 (Mann-Whitney U test; Supplementary Table 2) のように有意差を示し、§は補足表2に詳述した追加の性差があることを示す。 CD3+リンパ球のゲーティング戦略を補足図1に示す。 サンプルサイズは補足表2および補足データ1に示す。
(a) CD19+B細胞を野生マウスおよび実験マウスにおいてナイーブ（N）、メモリー（M）または胚中心（G）B細胞として特徴付けるためのフローサイトメトリゲーション戦略、および（b）これら3つの亜集団の割合、（c）それらのMHCクラスIIの発現および（d）PNAの結合、後者はログ10スケールで示してある。 マウスは野生型（網掛け）と実験室型（網掛けなし）である。 箱の中心は中央値、箱の限界は25％と75％、ひげは四分位範囲の1.5倍、外れ値はドットで表している。 アスタリスクは **P<0.01, ***P<0.001 (Mann-Whitney U test; Supplementary Table 2) のように有意差を示し、§は Supplementary Table 2 に詳述した性差の影響があることを示す。 サンプルサイズは、補足表2および補足データ1に示した。 CD19+リンパ球のゲーティング戦略を補足図1に示す。
(a) CD11b+ CD11c-骨髄系細胞を識別するフローサイトメトリゲーティング戦略と野生（斜線）マウスおよび実験（未斜線）マウスにおける脾白血球中の骨髄系細胞の割合、（b）M1（組織常在大食細胞）を定義するF4／80およびLy6G発現に関する骨髄系細胞ゲーテイングの結果。 M2（単球）、M3（顆粒球性骨髄球、HGMC）、M4（多形核白血球、PMN）サブセット、（c）Ly6G発現により、実験用マウスでは3個体、野生マウスでは4個体の存在を確認、（d）野生マウス（網掛け、n≧115）および実験用（網掛けなし n≧57）のM1-M4集団の側面散布の特徴。 (e) M3（左）とM4（右）細胞の散乱特性。M4細胞には前方散乱の少ない好中球集団（M5）と前方散乱の多い骨髄由来抑制細胞集団（M6）が存在することが明らかになった。 (f) 野生マウス（網掛け）と実験用マウス（網掛けなし）の骨髄系細胞集団におけるM1、M2、M3、M4亜集団の割合、および (g) 野生マウスと実験用マウスの脾臓細胞におけるCD11c+樹状細胞とその割合のゲーティング。 箱ひげ図では、箱の中心は中央値、箱の限界は25％と75％、ひげは四分位範囲の1.5倍、外れ値はドットで表している。 アスタリスクは *P<0.05, ***P<0.001 (Mann-Whitney U test; Supplementary Table 2) のように有意差を示し、§は Supplementary Table 2 に詳述した性差の影響があることを示す。 サンプルサイズは補足表2および補足データ1に示す。
(a) CD27およびCD11bの発現を用いて、野生マウスおよび実験動物のNKp46+ CD3-脾臓NK細胞を成熟期1〜4に分類するフローサイトメトリ・ゲーティング戦略を示す。 (b) 野生マウス（網掛け）と実験室マウス（網掛けなし）の各ステージにおけるNK細胞の割合、および各サブセットによる(c) CD69および(d) KLRG1の発現（表2）。 また、（e-h）Ly49受容体のゲーティング戦略と、NK細胞の発現割合、（e）Ly49DとLy49G2の異なる組み合わせ、（f）Ly49D、（g）Ly49G2（Ly49G2+細胞がLy49G2-、Ly49G2low、Ly49G2highにゲーティング）および（h）Ly49Hを示している。 野生マウスは網掛け箱ひげ図、実験用マウスは網掛け無しで示した。 箱の中心は中央値、箱の限界は25％と75％、ひげは四分位範囲の1.5倍、外れ値はドットで表し、一部の軸はlog10スケールで表示した。 アスタリスクは、**P<0.01, ***P<0.001 (Mann-Whitney U test; Table 2)として有意差を示し、§は表2に詳述した追加の性差が存在することを表す。 NKp46+ CD3-リンパ球のゲーティング戦略を補足図1に示す。 サンプルサイズは表2および補足データ1に示す。
CD4+およびCD8+ T細胞の状態は、野生マウスと実験用マウスで顕著に異なっていた。 CD4+T細胞については、実験用マウスと比較して野生マウスでは、エフェクター／エフェクターメモリー（CD62L- CD44hi）およびセントラルメモリー（CD62L+ CD44hi）細胞の割合が著しく大きかった（したがって、ナイーブ、CD62L+ CD44lowの割合は少ない）（補足表2、図3a）。 Foxp3+ CD25+ Treg細胞であるCD4+ T細胞の割合は、実験室マウスより野生マウスでわずかに高かったが（補足表2、図3b）、これは、Tregに対するエフェクターCD4+ T細胞の比率が実験室マウスより野生で有意により高いように、エフェクターCD4+ T細胞のはるかに大きな割合を相殺するには不十分であった（補足表2）。
同様にCD8+ T細胞についても、野生マウスは実験室マウスよりもエフェクター／エフェクターメモリー（CD62L- CD44hi）および終末分化（KLRG1+）細胞の割合が有意に高く（したがってナイーブの割合は有意に低く）（図3c、d）、エフェクターの割合は、実験室マウスよりも高い（図3d）。 この差は、野生の雄マウスではこれらの細胞の頻度が低いこともあるが（補足表2）、メモリーサブセットとエフェクターサブセット間の抗原経験CD8+ T細胞の相対的分布を反映していると思われる。 ここでも、エフェクター／エフェクターメモリーCD8+ T細胞のTregに対する比率は、実験用マウスよりも野生マウスで有意に高かった（補足表2）。
頻繁あるいは持続的な病原体チャレンジが、野生マウスにおいて抗原経験CD4+およびCD8+ T細胞サブセットの拡大を駆動するという考えと一致して、雌野生マウスにおいてエフェクターCD4+およびCD8+ T細胞の割合と年齢の間に有意な正の相関があった（Pearson correlations (two-tailed) age and effector CD4+ r=0.62, P<0.0001、n=51; 年齢とエフェクターCD8+ r=0.49, P<0.0001, n=50; Supplementary Data 2)である。 興味深いことに、雄の野生マウスではこれらのパラメータは年齢と強い相関はなかった（ピアソン相関（両側）r<0.1, P>0.05, n=66）。これは野生マウスの雄と雌で異なる免疫学的戦略を示唆している。 我々は脾臓CD19+ Bリンパ球をナイーブ（CD38+ IgD+）、メモリー（CD38+ IgD- GL7-）、胚中心（CD38lo IgD- GL7hi）細胞に分類し14、MHCクラスII発現とピーナッツアグルチニン（PNA、PNA受容体の発現を示す）15により最近活性化して抗原経験のある細胞を特定した（図4a）。 血清中の免疫グロブリン濃度が非常に高いにもかかわらず、野生マウスの脾臓には実験用マウスに比べてナイーブB細胞の割合が有意に高く（逆にメモリーB細胞の割合は有意に低く）なっていた（Fig. 4b,c）。 この最初は直感に反するような観察は、おそらく抗原を経験したB細胞が脾臓から骨髄、他のリンパ組織、あるいは感染部位に再配置され、さらにナイーブな骨髄由来のB細胞が脾臓に継続的に再増殖していることを反映していると思われる。 野生マウスは実験用マウスに比べて脾臓の胚中心B細胞が割合的に多く、野生マウスのすべてのB細胞サブセットでPNA結合が比較的高く、最近の活性化と一致していた15 (Fig. 4d, Supplementary Table 2)。 これらの結果から、野生マウスの脾臓では活性化されたCD19+ B細胞の回転が速いことが示された。
野生マウスにはこれまで知られていなかった骨髄系細胞集団がある
次に骨髄系細胞をCD11b+ CD11c-として識別し（図5a）、F4/80とLy6Gを発現解析するとF4/80+細胞の4亜集団（M1-M4と呼ぶ）が見つかった（図5b-d）。 これらは、F4/80+ Ly6G-（M1）組織常在マクロファージ、F4/80+ Ly6Glow（M2）単球/赤肉マクロファージおよびF4/80+/Ly6Ghigh（M4）多形核細胞（PMN）である。 M4 PMN集団は、その前方および側方散乱特性に基づいて、さらに好中球と骨髄由来抑制細胞に分けることができた（図5e）。 重要なことは、実験用マウスではなく野生マウスにおいて、単球／マクロファージとPMN（M3）の中間レベルのLy6Gを発現するF4/80+細胞の集団がさらに確認されたことである。 私たちの知る限り、これはこれまで報告されていない新しい細胞集団であり、その前方散乱と側方散乱の特徴に基づいて、超顆粒球性骨髄球（HGMC）と名付けた（図5c-e）。 野生マウスと実験マウスのM2集団とM3/M4集団の間には、Ly6Gの発現レベルに若干の違いがあるが（図5c）、CD11b、CD11c、前方散乱と側方散乱で各集団をバックゲーティングすると、野生マウスのM2集団と実験マウスのLy6Ghigh集団はそれ以外は同一であること、実験マウスのLy6Ghigh集団が野生マウスのM4集団と同等であることが確認できた(図5d). 各集団の側方散乱を比較すると、高側方散乱、高顆粒球性M3集団は、確かに野生マウスにのみ見られることが確認された（図5f）。 これらの細胞の機能的意義はまだ不明であるが、その発見は、実験用マウスの研究が必ずしも免疫系の全容を明らかにするものではないことを強調している。
野生マウスは実験用マウスに比べて脾臓のCD11b+ CD11c-骨髄系細胞が割合的に多いだけでなく、骨髄系集団ではPMNとHGMCがマクロファージや単球を差し置いて豊富に存在していた（図5a、f、補足表2）。 野生マウスの脾臓における好中球およびHGMCの拡大および/または蓄積は、野生マウスが最近または現在感染にさらされたことと一致する。 野生マウスの脾臓のCD11c+樹状細胞は実験室マウスと比較して割合的に少なかった（図5g、補足表2）。
Wild mouse NK cells are highly activated
我々はNKp46+ CD3ɛ- NK細胞（図6）をCD27およびCD11bの発現により初期（ステージ1）、中期（ステージ2）、後期（ステージ3）または完全（ステージ4）の成熟細胞に分けた(図6a）。 野生マウスでは、ステージ1およびステージ2の細胞の割合が高く、ステージ3およびステージ4の脾臓NK細胞の割合が低かったため、実験用マウスと比較して、初期／中期NK細胞と後期／成熟NK細胞の比率が有意に高くなった（図6b、表2）。 野生マウスNK細胞のすべてのサブセットにおいて、最近／早期の活性化マーカーCD69の発現は実験室マウスと比較して高かったが（図6c、表2）、ステージ1細胞以外では、終末分化マーカーKLRG1の発現は低い傾向があった（図6、表2）。 これらのデータを総合すると、野生マウスの脾臓NK細胞は実験室マウスに比べて活性化、自己複製、恒常的拡大16、すなわちターンオーバーの速度が速いということと矛盾しない
次に、NK細胞上のC型レクチン調節受容体のLy49ファミリーの発現について調べた（図6）。 その理由は、個々のNK細胞におけるLy49受容体ファミリーの確率的発現と集団の遺伝的多様性とが相まって、個体内のNK細胞の不均一性と個体間のNK細胞表現型の広範な変異をもたらす可能性があるためである11。 抑制性Ly49受容体は自己MHCクラスIを認識して、NK細胞が健康な細胞を殺すのを阻止するが、病原体関連リガンドを認識するLy49受容体は、NK細胞の活性化と感染細胞の殺傷を引き起こす。この最も良い例は、マウスサイトメガロウイルス (MCMV) m157糖タンパク質とLy49Hの結合で、MCMVに対する防御免疫を仲介する（参考文献1）。 17）
我々は、2つの活性化受容体（Ly49DとLy49H）と1つの抑制性受容体（Ly49G2）の発現を分析した。 ほとんどのC57BL/6実験用マウスにおいて、NK細胞はLy49D、Ly49GおよびLy49Hを発現し（図6e-h）、5-45%のNK細胞がそれぞれの受容体を発現しており、過去の報告18と一致している。 一方、野生マウスではLy49H+ NK細胞はほとんど見られず（10%、 n=125, ≥1% of Ly49H+ cells, Supplementary Data 1）、このことはこの受容体をコードする遺伝子がこの野生マウス集団では稀であるか、対立遺伝子変異が抗Ly49H抗体による認識を妨げていることを示唆している。 Ly49h遺伝子座の遺伝子型を調べると、MCMV感受性に関連する欠失があり（文献17）、野生マウスの18%がこの欠失をホモ接合していた（95%信頼区間9.5-30%、HWサイトのn=98マウス、Hardy-Weinberg平衡を仮定すると欠失アレルの頻度は0.42である）。 このことは、野生マウスにおけるLy49H+ NK細胞の不足に部分的に寄与していると思われるが、Ly49h遺伝子座におけるさらなるヌル対立遺伝子の存在や、野生マウスにおけるLy49Hの欠如を他の受容体が補うことができるかどうかについて、特に62％と79％という野生マウス集団におけるMCMVの高い流行率を考えると疑問を呈する（参考文献19、20）。 野生マウスにLy49Hが存在しないことは、代替活性化受容体Ly49Dがより頻繁に発現していることを説明し、機能的免疫に対するNK細胞の寄与において野生マウスと実験用マウスの間に重要な違いがある可能性を示唆している。 Ly49G2-、Ly49G2lowおよびLy49G2highである（図6g）。 野生マウスでは、ほとんどのLy49G2+細胞はLy49G2lowであったが、実験用マウスではLy49G2highが優勢であった。 このことは、Ly49G2コード遺伝子座の異なる対立遺伝子が野生個体群と実験個体群に存在することを示唆している。 実験用マウスでは、Ly49G受容体発現の系統間差は、プロモーター活性の対立遺伝子変異に関連しており21、NK細胞活性化の閾値に影響を及ぼす可能性がある18。 これらのデータは、Ly49受容体には広範な、これまで記録されていない対立遺伝子の多様性があり、それが野生のNK細胞機能に重要な影響を与えると考えられるという考えを支持している
我々は、NK細胞上の活性化および抑制Ly49受容体の発現バランスを理解したかったので、NK細胞のLy49DおよびLy49G2発現比率または非発現比率を比較した（図6e）。 野生マウスは実験用マウスよりもLy49D+G-細胞の割合が有意に高かったのに対し、実験用マウスは野生マウスよりもLy49D-G+細胞の割合が有意に高かった（表2）。これは、野生マウスのNK細胞が活性化に対する閾値を低くしている可能性を示唆しているが、これはMHCクラスI遺伝子型や今回測定しなかった他のLy49受容体の発現によって大きく左右されるであろう。 これらの結果は、野生マウスのNK細胞は実験用マウスのNK細胞よりもはるかに容易に活性化されうること、また活性化されていることを示しており、これは野生環境における高い病原体負荷に対する必要な反応である可能性がある。
野生マウスはPAMPsに対するサイトカイン応答が低下している
野生マウスの細胞性免疫系の高活性化に鑑み、脾臓細胞をPAMPs（CpG、エンドソームに発現するTLR9のリガンド）の存在下に培養して機能的免疫応答を測定した。 T細胞表面分子CD3およびCD28に対するモノクローナル抗体）およびマイトジェン（T細胞表面分子CD3およびCD28に対するモノクローナル抗体）の存在下で脾臓細胞を培養し、機能的な免疫反応を測定した。 野生マウスと実験室マウスの45の比較（5つの培養条件×9つのサイトカイン）のうち、野生マウスと実験室マウスの有意差は16のみであり、そのうち13の分析物濃度は野生マウスで有意に低かった（図7、補遺データ1、補遺表5）。 特に注目すべきは、野生マウスは病原体関連のリガンドに反応して、IL-12（p40とp70）の産生が実験室マウスより有意に少なく、IL-13の産生も少なく、また、ベースライン時のみ有意ではあるが、IL-10の産生が野生マウスで低い傾向もみられたことである。 これらの比較的低下したサイトカイン応答は、野生マウスの高度に活性化された細胞性免疫状態とは著しい対照をなしている。 我々は、慢性的に高度に病原体に曝露された野生マウスでは、何らかの自然免疫寛容が働いて炎症の程度を制限しているのではないかと推測している。 野生マウスで実験用マウスより有意に高いサイトカイン応答は、抗CD3/抗CD28に対するIFN-γ、IL-4およびMIP-2α応答のみであり、これは野生マウスでメモリーおよびエフェクターT細胞の割合が高いことと一致する。 これらの結果は、実験用マウスにおいて、自然界のサイトカイン応答、およびその機能的効果を再評価する必要があることを示唆している。
9つのサイトカインの濃度（IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-13。 MIP-2α）は、野生マウス（網掛け）と実験用マウス（網掛けなし）のRPMIコントロールと比較して、抗CD3/抗CD28、CpG、LPSまたはPGで刺激した脾臓リンパ球によって産生され、ログ10スケールで表示した。 箱の中心は中央値、箱の限界は25％と75％、ひげは四分位範囲の1.5倍、外れ値はドットで表している。 点線の水平線は、各サイトカインについて、分析されたすべてのプレートの標準曲線から定義された定量下限の中央値を示している。 アスタリスクは、*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 (Mann-Whitney U test; Supplementary Table 5) として有意差を示している。 サンプルサイズは補足データ1および補足表5に示す。