Una risorsa comunitaria

Il set completo di dati immunologici di 460 topi selvatici è fornito come risorsa comunitaria (dati supplementari 1). Da questo confrontiamo in dettaglio un sottoinsieme di 181 topi selvatici (100 maschi, 81 femmine) da un singolo sito (sito HW, Fig. 1a, Tabella supplementare 1) con 64 topi C57BL/6 (24 maschi, 40 femmine) allevati in laboratorio e privi di patogeni. I risultati di questo confronto sono riportati nelle tabelle 1,2 e nella tabella supplementare 2, quest’ultima troppo grande per essere inserita nel testo principale dell’articolo.

I topi selvatici sono immunologicamente diversi dai topi di laboratorio

I parametri sierologici e morfometrici per i topi selvatici (HW) e di laboratorio (C57/BL6) sono riassunti nella tabella 1. I topi selvatici erano molto più piccoli dei topi di laboratorio (pesavano solo la metà) e tra i topi selvatici, l’età, la lunghezza del corpo e la massa erano tutti altamente correlati (lunghezza e massa, correlazioni Pearson (a due code) r=0.79; età e massa, r≥0.77; età e lunghezza, r=0.58, P<0.001, n>80 per topi maschi e femmine separatamente) (Dati supplementari 2). I topi selvatici avevano un’età mediana di 6,6 settimane (range 1-39,5) e molti parametri immunitari correlavano con l’età e le dimensioni, probabilmente a causa dell’esposizione cumulativa all’infezione (dati supplementari 2). Da 62 misure immunologiche più (57 misure) differiva tra i topi selvatici e di laboratorio (Tabella 1, Tabella 2, Tabella supplementare 2). Tra i topi selvatici c’erano pochissime (6 di 62 misure) differenze immunologiche significative tra topi maschi e femmine, mentre i topi di laboratorio erano più (18 di 62 misure) immunologicamente sessualmente dimorfici (Tabella 1, Tabella 2, Tabella supplementare 2).

La genotipizzazione multilocus mostra che i topi selvatici HW sono una popolazione non strutturata e geneticamente diversa (Fig. 1b, Dati supplementari 3). I topi selvatici sono geneticamente distinti da dieci ceppi di topi di laboratorio, e i ceppi di laboratorio sono più geneticamente diversi rispetto ai topi selvatici. Suggeriamo che questo rapporto genetico tra i topi selvatici e di laboratorio è spiegato dal mosaicismo dei genomi dei topi di laboratorio4, dal fatto che i topi di laboratorio sono stati deliberatamente separati gli uni dagli altri per molte generazioni, e dal fatto che i ceppi di laboratorio sono in gran parte omozigoti.

I topi selvatici sono portatori di un notevole carico di infezioni

Abbiamo esaminato i topi selvatici alla ricerca di prove di infezione da virus e Mycoplasma pulmonis, e di prove di infezione da ectoparassiti e nematodi intestinali; i fornitori hanno confermato che i topi di laboratorio sono privi di infezioni. La sieroprevalenza delle diverse infezioni microbiche variava dal 22% per il virus minuto al 92% per il parvovirus (n=153 per entrambe le analisi; tabella 3 supplementare). I topi selvatici erano comunemente infettati dal nematode Oxyurid Syphacia spp. (prevalenza 91%) e dall’acaro Myocoptes musculinus (prevalenza 82%) (n=181 in entrambi i casi). L’infezione dei topi selvatici era molto comune: tutti i topi selvatici erano stati infettati da almeno un patogeno e solo il 5% (8 su 153) erano sieronegativi per tutti i virus e M. pulmonis. Non c’era alcun effetto del sesso sull’intensità o la prevalenza dell’infezione (Tabella supplementare 3).

I topi selvatici hanno concentrazioni molto elevate di proteine sieriche

Nei topi selvatici, le concentrazioni sieriche di IgG e IgE erano 20 e 200 volte superiori, rispettivamente, nei topi selvatici che nei topi di laboratorio (Fig. 2). Tra i topi selvatici, le concentrazioni di IgE erano significativamente più alte tra le femmine che tra i maschi (Tabella 1). Al contrario, le concentrazioni di IgA fecali non differivano significativamente tra topi selvatici e di laboratorio (Fig. 2, Tabella 1). I topi selvatici avevano anche concentrazioni sieriche significativamente più alte delle proteine della fase acuta, della componente sierica dell’amiloide P (SAP) e dell’aptoglobina rispetto ai topi di laboratorio (Fig. 2, Tabella 1). Queste differenze non erano dovute a concentrazioni di proteine sieriche totali più elevate nei topi selvatici poiché le concentrazioni di alfa-1 antitripsina (AAT) – un componente stabile del siero normale – non differivano tra topi selvatici e di laboratorio (Fig. 2, Tabella 1).

I topi selvatici erano più eterogenei nelle loro concentrazioni di immunoglobuline e proteine di fase acuta rispetto ai topi di laboratorio (Fig. 2, tabella 1, tabella supplementare 4). Anche se le concentrazioni di SAP al basale sono parzialmente determinate geneticamente13, la correlazione significativa tra SAP e concentrazioni di aptoglobina (correlazioni di Pearson (a due code) r=0,41, P<0,0001, r=0,33, P=0,004 per 96 maschi e 77 femmine, rispettivamente; Dati supplementari 2) suggerisce che l’infiammazione e/o l’infezione sono i probabili driver di questa eterogeneità. Tra i topi selvatici, le concentrazioni sieriche di IgG e IgE erano significativamente, positivamente correlate con l’età (correlazione Pearson (a due code) r>0.2, P<0.05, n≥79; Dati supplementari 2) che probabilmente riflette l’esposizione cumulativa all’infezione. Questo può essere visto esplicitamente per le concentrazioni di IgE che erano significativamente correlate positivamente con il numero di infezioni microbiche nei topi selvatici maschi (correlazione Pearson (a due code) r=0.23, P=0.036, n=80; dati supplementari 2). Nelle femmine di topo selvatico, la concentrazione fecale di IgA era altamente correlata con il numero di infezioni microbiche e con il numero di acari (correlazioni Pearson (a due code) r=0.58, P<0.0001, n=35; numero di acari r=-0.380, P=0.01, n=45; Dati supplementari 2).

Gli splenociti dei topi selvatici differiscono da quelli dei topi da laboratorio

Le milze dei topi selvatici erano molto più piccole (circa un terzo della massa) di quelle dei topi da laboratorio e contenevano significativamente meno (circa un quinto del numero) leucociti mononucleari vitali (tabella 1). Più sorprendentemente, le milze dei topi selvatici erano significativamente più piccole in proporzione (cioè rispetto alla massa corporea) di quelle dei topi di laboratorio (Tabella 1).

La quantificazione citometrica a flusso ex vivo e la caratterizzazione delle popolazioni di cellule della milza (Figg. 3, 4, 5, 6, Fig. 1) ha rivelato che i topi selvatici avevano un numero assoluto inferiore di cellule T, cellule B, cellule NK, cellule dendritiche, macrofagi e neutrofili rispetto ai topi di laboratorio, coerentemente con il loro numero assoluto inferiore di cellule mononucleate spleniche (dati supplementari 1). Ma, in proporzione, le milze dei topi selvatici avevano significativamente più cellule T, un più alto rapporto cellule T:B e più cellule mieloidi CD11b+, ma meno cellule NK e cellule dendritiche, rispetto ai topi di laboratorio (Tabella supplementare 2); il rapporto di cellule T CD4+: cellule T CD8+ era anche significativamente più alto nei topi selvatici che nei topi di laboratorio. Queste differenze sono coerenti con l’accumulo di cellule T helper e fagocitarie nella milza dei topi selvatici in risposta alle infezioni sistemiche.

Lo stato delle cellule T CD4+ e CD8+ era notevolmente diverso tra i topi selvatici e quelli di laboratorio. Per le cellule T CD4+, proporzioni significativamente maggiori erano cellule di memoria effettrice/effettrice (CD62L- CD44hi) e di memoria centrale (CD62L+ CD44hi) (e quindi proporzionalmente meno ingenue, CD62L+ CD44low), nei topi selvatici rispetto ai topi di laboratorio (Tabella supplementare 2, Fig. 3a). Anche se le proporzioni di cellule T CD4+ che erano Foxp3+ CD25+ cellule Treg erano marginalmente più alte tra i topi selvatici rispetto ai topi di laboratorio (Tabella supplementare 2, Fig. 3b), questo non era sufficiente a compensare la proporzione molto più grande di cellule T CD4+ effettrici, così che i rapporti tra cellule T CD4+ effettrici e Tregs erano significativamente più alti tra i topi selvatici che quelli di laboratorio (Tabella supplementare 2).

Similmente, per le cellule T CD8+ i topi selvatici avevano una proporzione significativamente più alta di cellule effettrici/effettrici di memoria (CD62L- CD44hi) e differenziate terminalmente (KLRG1+) rispetto ai topi di laboratorio (e quindi proporzioni significativamente inferiori di naïve) (Fig. 3c,d). I topi selvatici avevano anche proporzionalmente meno cellule T CD8+ di memoria centrale (CD62L+ CD44hi) rispetto ai topi di laboratorio; questa differenza era dovuta in parte alla bassa frequenza di queste cellule nei topi maschi selvatici (tabella 2 supplementare), ma può anche riflettere la distribuzione relativa delle cellule T CD8+ con esperienza dell’antigene tra i sottoinsiemi di memoria ed effettori. Ancora una volta, il rapporto tra cellule T CD8+ di memoria effettrici/effettrici e Tregs era significativamente più alto nei topi selvatici che in quelli di laboratorio (Tabella supplementare 2).

Consistente con l’idea che la sfida patogena frequente o persistente guida l’espansione dei sottoinsiemi di cellule T CD4+ e CD8+ esperti dell’antigene nei topi selvatici, c’erano correlazioni positive significative tra le proporzioni di cellule T CD4+ e CD8+ effettrici e l’età tra i topi selvatici femmina (correlazioni Pearson (a due code) età e CD4+ effettori r=0.62, P<0.0001, n=51; età ed effettore CD8+ r=0.49, P<0.0001, n=50; Dati supplementari 2). È interessante notare che questi parametri non erano fortemente correlati con l’età nei topi selvatici maschi (correlazione di Pearson (a due code) r<0,1, P>0,05, n=66), indicando diverse strategie immunologiche dei topi maschi e femmine in natura.

In contrasto con lo stato altamente adescato/effettore delle cellule T spleniche, i linfociti B CD19+ dei topi selvatici avevano prevalentemente un fenotipo ingenuo. Abbiamo classificato i linfociti B CD19+ splenici come ingenui (CD38+ IgD+), memoria (CD38+ IgD- GL7-) o cellule del centro germinale (CD38lo IgD- GL7hi) 14, e abbiamo identificato le cellule recentemente attivate e provate dall’antigene tramite la loro espressione MHC di classe II e il legame dell’agglutinina di arachidi (PNA; che indica l’espressione del recettore PNA, PNA-R)15 (Fig. 4a). Nonostante le loro concentrazioni sieriche di immunoglobuline molto alte, le milze dei topi selvatici contenevano proporzioni significativamente più alte di cellule B naïve (e, reciprocamente, proporzioni significativamente più basse di cellule B di memoria) rispetto ai topi di laboratorio (Fig. 4b,c). Questa osservazione inizialmente controintuitiva riflette probabilmente la riallocazione delle cellule B con esperienza dell’antigene dalla milza al midollo osseo, ad altri tessuti linfoidi, o ai siti di infezione, insieme al continuo ripopolamento della milza con cellule B ingenue, derivate dal midollo osseo. I topi selvatici avevano proporzionalmente più cellule B del centro germinale nelle loro milze rispetto ai topi di laboratorio e il legame PNA era comparativamente più alto su tutti i sottoinsiemi di cellule B nei topi selvatici, coerentemente con la recente attivazione15 (Fig. 4d, Tabella supplementare 2). Insieme questi risultati indicano un elevato turnover di cellule B CD19+ attivate nella milza dei topi selvatici.

I topi selvatici hanno una popolazione di cellule mieloidi finora sconosciuta

Abbiamo identificato le cellule mieloidi come CD11b+ CD11c- (Fig. 5a) e analizzato la loro espressione di F4/80 e Ly6G, rivelando quattro sottopopolazioni di cellule F4/80+, denominate M1-M4 (Fig. 5b-d). Questi includono F4/80+ Ly6G- (M1) macrofagi residenti nel tessuto, F4/80+ Ly6Glow (M2) monociti/macrofagi della polpa rossa e F4/80+/-Ly6Ghigh (M4) cellule polimorfonucleate (PMN). La popolazione M4 PMN potrebbe essere ulteriormente suddivisa in neutrofili e cellule soppressorie di derivazione mieloide in base alle loro caratteristiche di diffusione in avanti e laterale (Fig. 5e). È importante notare che nei topi selvatici, ma non in laboratorio, abbiamo identificato un’ulteriore popolazione di cellule F4/80+ che esprimono livelli di Ly6G che sono intermedi tra monociti/macrofagi e PMN (M3). Per quanto ne sappiamo, si tratta di una nuova popolazione di cellule non descritte in precedenza, che abbiamo chiamato cellule mieloidi ipergranulocitiche (HGMC) sulla base delle loro caratteristiche di diffusione in avanti e laterale (Fig. 5c-e). Anche se ci sono alcune lievi differenze nei livelli di espressione Ly6G tra le popolazioni M2 e M3/M4 nei topi selvatici e di laboratorio (Fig. 5c) gating posteriore di ogni popolazione su CD11b, CD11c, e avanti e la diffusione laterale confermato che le popolazioni M2 in topi selvatici e di laboratorio sono altrimenti identici e che la popolazione Ly6Ghigh nei topi di laboratorio è equivalente alla popolazione M4 nei topi selvatici (Fig. 5d). Il confronto della dispersione laterale per ogni popolazione conferma anche che l’alta dispersione laterale, la popolazione ipergranulocitica M3 è effettivamente visto solo nei topi selvatici (Fig. 5f). Il significato funzionale di queste cellule è ancora sconosciuto, ma la loro scoperta sottolinea che lo studio dei topi di laboratorio non rivela necessariamente l’intero armamentario del sistema immunitario.

I topi selvatici non solo avevano proporzionalmente più CD11b + CD11c- cellule mieloidi nella loro milza rispetto ai topi di laboratorio, ma, all’interno della popolazione mieloide, PMN e HGMC sono stati arricchiti a scapito di macrofagi e monociti (Fig. 5a,f, Tabella supplementare 2). L’espansione e / o l’accumulo di neutrofili e HGMC nella milza dei topi selvatici è coerente con l’esposizione recente o attuale di infezione nei topi selvatici. Le cellule dendritiche CD11c+ spleniche erano proporzionalmente più rare nei topi selvatici rispetto ai topi di laboratorio (Fig. 5g, Tabella supplementare 2).

Le cellule NK dei topi selvatici sono altamente attivate

Abbiamo caratterizzato le cellule NKp46+ CD3ɛ- NK (Fig. 6) come precoci (stadio 1), medie (stadio 2), tardive (stadio 3) o completamente (stadio 4) cellule mature per espressione di CD27 e CD11b (Fig. 6a). I topi selvatici avevano proporzioni più alte di cellule dello stadio 1 e dello stadio 2 e proporzioni più basse di cellule NK dello stadio 3 e dello stadio 4, risultando in rapporti significativamente più alti di cellule NK precoci/di medio stadio e di cellule NK tardive/mature rispetto ai topi di laboratorio (Fig. 6b, Tabella 2). L’espressione del marcatore di attivazione recente/precoce CD69 era più alta su tutti i sottoinsiemi di cellule NK del topo selvatico rispetto ai topi di laboratorio (Fig. 6c, Tabella 2) ma, a parte le cellule di stadio 1, l’espressione del marcatore di differenziazione terminale KLRG1 tendeva a essere più bassa (Fig. 6, Tabella 2). Insieme, questi dati sono coerenti con l’attivazione, l’auto-rinnovamento e l’espansione omeostatica16, e quindi più alti tassi di turnover, delle cellule NK spleniche dei topi selvatici rispetto ai topi di laboratorio.

Abbiamo poi esplorato l’espressione della famiglia Ly49 dei recettori regolatori di lectina di tipo C sulle cellule NK (Fig. 6e-h) ragionando sul fatto che l’espressione stocastica dei membri della famiglia di recettori Ly49 sulle singole cellule NK combinata con la diversità genetica della popolazione potrebbe portare all’eterogeneità delle cellule NK all’interno di un individuo e ad un’ampia variazione del fenotipo delle cellule NK tra gli individui11. I recettori Ly49 inibitori riconoscono self-MHC di classe I e impediscono alle cellule NK di uccidere le cellule sane, mentre i recettori Ly49 che riconoscono i ligandi associati ai patogeni portano all’attivazione delle cellule NK e all’uccisione delle cellule infette; l’esempio meglio descritto di questo è il legame di Ly49H alla glicoproteina m157 del citomegalovirus murino (MCMV) che media l’immunità protettiva al MCMV (rif. 17).

Abbiamo analizzato l’espressione di due recettori attivatori (Ly49D e Ly49H) e un recettore inibitorio (Ly49G2). Per la maggior parte dei topi di laboratorio C57BL/6, le cellule NK esprimevano Ly49D, Ly49G e Ly49H (Fig. 6e-h) con il 5-45% delle cellule NK che esprimevano ciascuno dei recettori, coerentemente con i rapporti precedenti18. Al contrario molto pochi topi selvatici aveva qualsiasi Ly49H + cellule NK (10%, n = 125, ≥ 1% delle cellule Ly49H +, dati supplementari 1), suggerendo che il gene che codifica questo recettore è rara in questa popolazione di topi selvatici o che la variazione allelica preclude il riconoscimento da parte dell’anticorpo anti-Ly49H. Abbiamo genotipizzato i topi al locus Ly49h per una delezione che è associata alla suscettibilità al MCMV (rif. 17), trovando che il 18% dei topi selvatici erano omozigoti per questa delezione (95% intervallo di confidenza 9.5-30%, n = 98 topi dal sito HW; frequenza di allele delezione 0.42 assumendo equilibrio Hardy-Weinberg). Questo probabilmente contribuisce in parte alla scarsità di Ly49H + cellule NK tra i topi selvatici, ma solleva questioni circa la presenza di ulteriori alleli nulli al locus Ly49h, e se altri recettori possono compensare la mancanza di Ly49H nei topi selvatici, soprattutto data l’alta prevalenza di MCMV nelle popolazioni di topi selvatici, segnalato per essere 62 e 79% (rifs 19, 20). L’apparente assenza di Ly49H tra i topi selvatici può spiegare la loro espressione molto più frequente del recettore attivante alternativo Ly49D e suggerisce che ci possono essere importanti differenze tra topi selvatici e di laboratorio nei contributi delle cellule NK all’immunità funzionale.

Abbiamo identificato tre popolazioni di cellule Ly49G2: Ly49G2-, Ly49G2low e Ly49G2high (Fig. 6g). Tra i topi selvatici la maggior parte delle cellule Ly49G2+ erano Ly49G2low, mentre nei topi di laboratorio predominavano le cellule Ly49G2high. Questo suggerisce la presenza di diversi alleli al locus codificante Ly49G2 nelle popolazioni selvatiche e di laboratorio. Tra i topi di laboratorio, le differenze tra ceppi nell’espressione del recettore Ly49G sono state collegate alla variazione allelica nell’attività del promotore21 e possono influenzare la soglia di attivazione delle cellule NK18. Questi dati supportano l’idea che ci sia un’ampia, finora non documentata, diversità allelica tra i recettori Ly49 con probabili importanti conseguenze per la funzione delle cellule NK in natura.

Abbiamo voluto capire l’equilibrio di espressione dei recettori Ly49 attivanti e inibitori sulle cellule NK, e quindi confrontato le proporzioni di cellule NK che esprimono o meno Ly49D e Ly49G2 (Fig. 6e). I topi selvatici avevano proporzioni significativamente più alte di cellule Ly49D+G- rispetto ai topi di laboratorio, mentre i topi di laboratorio avevano proporzioni significativamente più alte di cellule Ly49D-G+ rispetto ai topi selvatici (Tabella 2), suggerendo che le cellule NK dei topi selvatici possono avere una soglia inferiore per l’attivazione, anche se questo sarà fortemente influenzato dal genotipo MHC classe I e l’espressione di altri recettori Ly49 non testati qui. Insieme questi risultati mostrano che le cellule NK dei topi selvatici possono essere, e sono, molto più prontamente attivate di quelle dei topi di laboratorio, che può essere una risposta necessaria all’elevato carico di patogeni dell’ambiente selvatico.

I topi selvatici hanno ridotte risposte citochiniche alle PAMPs

Alla luce dello stato altamente attivato del sistema immunitario cellulare dei topi selvatici abbiamo misurato la risposta immunitaria funzionale coltivando gli splenociti in presenza di PAMPs (CpG, il ligando per TLR9 espresso a livello endosomico; PG, un agonista TLR2; LPS batterico, un ligando per TLR4) e un mitogeno (anticorpi monoclonali per le molecole di superficie delle cellule T CD3 e CD28). Tra i 45 confronti effettuati tra topi selvatici e di laboratorio (5 condizioni di cultura × 9 citochine) solo 16 differenze significative tra topi selvatici e di laboratorio sono stati osservati, e in 13 di queste concentrazioni di analiti erano significativamente inferiori nei topi selvatici (Fig. 7, dati supplementari 1, tabella supplementare 5). In particolare, i topi selvatici hanno prodotto significativamente meno IL-12 (p40 e p70) e meno IL-13 rispetto ai topi di laboratorio in risposta ai ligandi legati al patogeno e c’era anche una tendenza per la produzione di IL-10 per essere inferiore nei topi selvatici, anche se questo era solo significativo al basale. Queste risposte citochine comparativamente depresse sono in significativo contrasto con lo stato immunitario cellulare altamente attivato dei topi selvatici. Noi ipotizziamo che una qualche forma di tolleranza immunitaria innata possa operare per limitare il grado di infiammazione nei topi selvatici cronicamente e altamente esposti ai patogeni. Le uniche risposte citochiniche che erano significativamente più alte nei topi selvatici che nei topi di laboratorio erano le risposte IFN-γ, IL-4 e MIP-2α all’anti-CD3/anti-CD28, che sono coerenti con le proporzioni più alte di memoria e cellule T effettrici nei topi selvatici. Questi risultati suggeriscono che le risposte innate delle citochine, e i loro effetti funzionali, potrebbero dover essere rivalutati nei topi di laboratorio.