Un recurso comunitario
El conjunto completo de datos inmunológicos de 460 ratones silvestres se proporciona como un recurso comunitario (Datos Suplementarios 1). A partir de esto, comparamos en detalle un subconjunto de 181 ratones silvestres (100 machos, 81 hembras) de un solo sitio (sitio HW, Fig. 1a, Tabla Suplementaria 1) con 64 ratones C57BL/6 criados en laboratorio y libres de patógenos (24 machos, 40 hembras). Los resultados de esta comparación se muestran en las Tablas 1,2 y en la Tabla Suplementaria 2, siendo esta última demasiado grande para caber en el texto principal del artículo.
Los ratones salvajes son inmunológicamente diferentes de los de laboratorio
Los parámetros serológicos y morfométricos de los ratones salvajes (HW) y de laboratorio (C57/BL6) se resumen en la Tabla 1. Los ratones silvestres eran mucho más pequeños que los de laboratorio (pesaban sólo la mitad) y entre los ratones silvestres, la edad, la longitud corporal y la masa estaban muy correlacionadas (longitud y masa, correlaciones de Pearson (de dos colas) r=0,79; edad y masa, r≥0,77; edad y longitud, r=0,58, P<0,001, n>80 para ratones machos y hembras por separado) (Datos suplementarios 2). Los ratones salvajes tenían una edad media de 6,6 semanas (rango 1-39,5) y muchos parámetros inmunológicos se correlacionaban con la edad y el tamaño, probablemente debido a la exposición acumulada a la infección (Datos suplementarios 2). De las 62 medidas inmunológicas, la mayoría (57 medidas) diferían entre los ratones salvajes y los de laboratorio (Tabla 1, Tabla 2, Tabla Suplementaria 2). Entre los ratones silvestres había muy pocas (6 de 62 medidas) diferencias inmunológicas significativas entre los ratones machos y las hembras, mientras que los ratones de laboratorio tenían más (18 de 62 medidas) dimorfismo sexual inmunológico (Tabla 1, Tabla 2, Tabla suplementaria 2).
El genotipado del multilocus muestra que los ratones silvestres HW son una población desestructurada y genéticamente diversa (Fig. 1b, Datos suplementarios 3). Los ratones salvajes son genéticamente distintos de diez cepas de ratones de laboratorio, y las cepas de laboratorio son más diversas genéticamente que los ratones salvajes. Sugerimos que esta relación genética entre los ratones salvajes y los de laboratorio se explica por el mosaicismo de los genomas de los ratones de laboratorio4, por el hecho de que los ratones de laboratorio han sido deliberadamente separados unos de otros durante muchas generaciones, y por el hecho de que las cepas de laboratorio son en gran medida homocigóticas.
Los ratones silvestres llevan una carga sustancial de infección
Examinamos los ratones silvestres en busca de pruebas de infección por virus y Mycoplasma pulmonis, y de pruebas de infección por ectoparásitos y nematodos intestinales; los proveedores confirmaron que los ratones de laboratorio estaban libres de infección. La seroprevalencia de las distintas infecciones microbianas osciló entre el 22% para el virus de la minúscula y el 92% para el parvovirus (n=153 para ambos análisis; Tabla Suplementaria 3). Los ratones silvestres se infectaron comúnmente con el nematodo oxiúrido Syphacia spp. (prevalencia del 91%) y con el ácaro Myocoptes musculinus (prevalencia del 82%) (n=181 en ambos casos). La infección de los ratones silvestres era muy común: todos los ratones silvestres habían sido infectados con al menos un patógeno y sólo el 5% (8 de 153) eran seronegativos para todos los virus y M. pulmonis. No hubo ningún efecto del sexo sobre la intensidad o la prevalencia de la infección (Tabla Suplementaria 3).
Los ratones silvestres tienen concentraciones muy altas de proteínas séricas
En los ratones silvestres, las concentraciones séricas de IgG e IgE fueron 20 y 200 veces mayores, respectivamente, en los ratones silvestres que en los de laboratorio (Fig. 2). Entre los ratones silvestres, las concentraciones de IgE eran significativamente mayores entre las hembras que entre los machos (Tabla 1). Por el contrario, las concentraciones fecales de IgA no difirieron significativamente entre los ratones salvajes y los de laboratorio (Fig. 2, Tabla 1). Los ratones silvestres también tenían concentraciones séricas significativamente más altas de las proteínas de fase aguda, el componente amiloide P sérico (SAP) y la haptoglobina que los ratones de laboratorio (Fig. 2, Tabla 1). Estas diferencias no se debieron a mayores concentraciones de proteínas séricas totales en los ratones salvajes, ya que las concentraciones de alfa-1 antitripsina (AAT) -un componente estable del suero normal- no difirieron entre los ratones salvajes y los de laboratorio (Fig. 2, Tabla 1).
Las concentraciones de las inmunoglobulinas G, E y A, y de las proteínas séricas SAP, haptoglobina y AAT de los ratones salvajes (sombreados) y de laboratorio (sin sombrear) se muestran en una escala log10. Los centros de las cajas son las medianas, y los límites de las cajas los percentiles 25 y 75, los bigotes 1,5 veces el rango intercuartil, y los valores atípicos se representan con puntos. Los asteriscos denotan diferencias significativas como ***P<0,001 (prueba U de Mann-Whitney; Tabla 1), y § denota que hay efectos adicionales del sexo detallados en la Tabla 1. Los tamaños de las muestras se muestran en la Tabla 1 y en los Datos Suplementarios 1.
Los ratones salvajes fueron más heterogéneos en sus concentraciones de inmunoglobulinas y proteínas de fase aguda en comparación con los ratones de laboratorio (Fig. 2, Tabla 1, Tabla Suplementaria 4). Aunque las concentraciones basales de SAP están parcialmente determinadas genéticamente13 , la correlación significativa entre las concentraciones de SAP y de haptoglobina (correlaciones de Pearson (de dos colas) r=0,41, P<0,0001, r=0,33, P=0,004 para 96 machos y 77 hembras, respectivamente; Datos suplementarios 2) sugiere que la inflamación y/o la infección son los probables impulsores de esta heterogeneidad. Entre los ratones salvajes, las concentraciones séricas de IgG e IgE estaban correlacionadas de forma significativa y positiva con la edad (correlación de Pearson (dos colas) r>0,2, P<0,05, n≥79; Datos suplementarios 2), lo que probablemente refleja la exposición acumulada a la infección. Esto puede verse explícitamente en el caso de las concentraciones de IgE, que estaban significativamente correlacionadas de forma positiva con el número de infecciones microbianas en los ratones salvajes macho (correlación de Pearson (dos colas) r=0,23, P=0,036, n=80; Datos suplementarios 2). En las hembras de ratones silvestres, la concentración de IgA fecal estaba altamente correlacionada con el número de infecciones microbianas y con el número de ácaros (infecciones microbianas correlaciones de Pearson (dos colas) r=0,58, P<0,0001, n=35; número de ácaros r=-0,380, P=0,01, n=45; Datos suplementarios 2).
Los esplenocitos de los ratones silvestres difieren de los de los ratones de laboratorio
Los bazos de los ratones silvestres eran mucho más pequeños (aproximadamente un tercio de la masa) que los de los ratones de laboratorio y contenían un número significativamente menor (aproximadamente una quinta parte del número) de leucocitos mononucleares viables (Tabla 1). Más sorprendentemente, los bazos de los ratones silvestres eran significativamente más pequeños en proporción (es decir, en comparación con la masa corporal) que los de los ratones de laboratorio (Tabla 1).
La cuantificación por citometría de flujo ex vivo y la caracterización de las poblaciones de células del bazo (Figs. 3, 4, 5, 6, Fig. Suplementaria. 1) reveló que los ratones silvestres tenían un número absoluto menor de células T, células B, células NK, células dendríticas, macrófagos y neutrófilos que los ratones de laboratorio, en consonancia con su menor número absoluto de células mononucleares esplénicas (Datos suplementarios 1). Pero, proporcionalmente, los bazos de los ratones salvajes tenían un número significativamente mayor de células T, una proporción más alta de células T:B y más células mieloides CD11b+, pero menos células NK y células dendríticas, que los ratones de laboratorio (Tabla suplementaria 2); la proporción de células T CD4+: CD8+ también fue significativamente mayor en los ratones salvajes que en los de laboratorio. Estas diferencias son consistentes con la acumulación de células T helper y células fagocíticas en el bazo de los ratones salvajes en respuesta a las infecciones sistémicas.
La estrategia de gating de citometría de flujo y las proporciones de subconjuntos de células T CD3+ en ratones salvajes (sombreados) y de laboratorio (sin sombrear) para (a) las células CD4+, (b) las células Treg CD4+, (c) las células CD8+ y su estado de maduración y (d) las células CD8+ terminalmente diferenciadas. Las células de memoria efectoras/efectoras CD4+ y CD8+ se definen como CD62L- CD44hi y las células de memoria central son CD62L+ CD44hi. Los centros de las cajas son las medianas, y los límites de las cajas los percentiles 25 y 75, los bigotes 1,5 veces el rango intercuartil y los valores atípicos se representan con puntos. Los asteriscos denotan diferencias significativas como *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 (prueba U de Mann-Whitney; Tabla suplementaria 2), y § denota que hay efectos adicionales del sexo detallados en la Tabla suplementaria 2. La estrategia de selección de los linfocitos CD3+ se muestra en la Fig. 1. Los tamaños de las muestras se muestran en la Tabla Suplementaria 2 y en los Datos Suplementarios 1.
(a) La estrategia de separación por citometría de flujo para caracterizar los linfocitos B CD19+ como linfocitos B naïve (N), de memoria (M) o de centro germinal (G) en ratones salvajes y de laboratorio, y (b) las proporciones de estas tres subpoblaciones, (c) su expresión de MHC clase II y (d) la unión de PNA, mostrando esta última en una escala log10. Los ratones son salvajes (sombreados) y de laboratorio (sin sombrear). Los centros de las cajas son las medianas, y los límites de las cajas los percentiles 25 y 75, los bigotes 1,5 veces el rango intercuartil y los valores atípicos se representan con puntos. Los asteriscos denotan diferencias significativas como **P<0,01, ***P<0,001 (prueba U de Mann-Whitney; Tabla suplementaria 2), y § denota que hay efectos adicionales del sexo detallados en la Tabla suplementaria 2. Los tamaños de las muestras se muestran en la Tabla Suplementaria 2 y en los Datos Suplementarios 1. La estrategia de selección de los linfocitos CD19+ se muestra en la Fig. suplementaria 1.
(a) La estrategia de gating de citometría de flujo para identificar las células mieloides CD11b+ CD11c- y la proporción de células mieloides entre los leucocitos esplénicos en ratones salvajes (sombreados) y de laboratorio (sin sombrear), (b) gating de células mieloides en la expresión de F4/80 y Ly6G para definir M1 (macrófagos residentes en el tejido), M2 (monocitos), M3 (células mieloides hipergranulocíticas, HGMC) y M4 (leucocitos polimorfonucleares, PMN), (c) expresión de Ly6G que confirma la presencia de tres poblaciones celulares en los ratones de laboratorio y de cuatro poblaciones en los ratones silvestres, (d) características de dispersión lateral de las poblaciones M1-M4 en ratones silvestres (sombreados, n≥115) y de laboratorio (sin sombrear n≥57); nótese que en los ratones de laboratorio había muy pocas células en la puerta M3 para determinar con precisión una estadística de dispersión lateral, (e) características de dispersión de las células M3 (izquierda) y M4 (derecha), revelando una población de neutrófilos de baja dispersión hacia delante (M5) y una población de células supresoras derivadas de los mieloides de alta dispersión hacia delante (M6) entre las células M4, (f) proporciones de las subpoblaciones M1, M2, M3 y M4 entre la población de células mieloides en ratones salvajes (sombreados) y de laboratorio (sin sombrear), y (g) gating de las células dendríticas CD11c+ y sus proporciones entre los esplenocitos en ratones salvajes y de laboratorio. En los gráficos de cajas, los centros de las cajas son las medianas, y los límites de las cajas los percentiles 25 y 75, los bigotes 1,5 veces el rango intercuartil y los valores atípicos se representan con puntos. Los asteriscos denotan diferencias significativas como *P<0,05, ***P<0,001 (prueba U de Mann-Whitney; Tabla suplementaria 2), y § denota que hay efectos adicionales del sexo detallados en la Tabla suplementaria 2. Los tamaños de las muestras se muestran en la Tabla Suplementaria 2 y en los Datos Suplementarios 1.
(a) La estrategia de gating de citometría de flujo utilizando la expresión de CD27 y CD11b para clasificar las células NKp46+ CD3- esplénicas de ratones salvajes y de laboratorio en los estadios 1-4 de maduración, (b) las proporciones de células NK en cada uno de estos estadios, en ratones salvajes (sombreados) y de laboratorio (sin sombrear), y la expresión de (c) CD69 y (d) KLRG1 por cada subconjunto (Tabla 2). También se muestran (e-h) las estrategias de gating para los receptores Ly49 y las proporciones de células NK que expresan, (e) diferentes combinaciones de Ly49D y Ly49G2, (f) Ly49D, (g) Ly49G2 (células Ly49G2+ gated en células Ly49G2-, Ly49G2low y Ly49G2high) y (h) Ly49H. Los ratones silvestres se muestran como recuadros sombreados, los ratones de laboratorio como no sombreados. Los centros de las cajas son las medianas, y los límites de las cajas los percentiles 25 y 75, los bigotes 1,5 veces el rango intercuartil y los valores atípicos están representados por puntos y algunos ejes están en una escala log10. Los asteriscos denotan diferencias significativas como **P<0,01, ***P<0,001 (prueba U de Mann-Whitney; Tabla 2), y § denota que hay efectos adicionales del sexo detallados en la Tabla 2. La estrategia de selección de los linfocitos NKp46+ CD3- se muestra en la Fig. 1 suplementaria. Los tamaños de las muestras se muestran en la Tabla 2 y en los Datos Suplementarios 1.
El estado de las células T CD4+ y CD8+ fue marcadamente diferente entre los ratones salvajes y los de laboratorio. En el caso de las células T CD4+, las proporciones de células de memoria efectoras/efectoras (CD62L- CD44hi) y de memoria central (CD62L+ CD44hi) eran significativamente mayores (y, por tanto, proporcionalmente menos ingenuas, CD62L+ CD44low), en los ratones silvestres en comparación con los de laboratorio (Tabla suplementaria 2, Fig. 3a). Aunque las proporciones de células T CD4+ que eran células Treg Foxp3+ CD25+ eran marginalmente mayores entre los ratones silvestres que en los de laboratorio (Tabla suplementaria 2, Fig. 3b), esto era insuficiente para compensar la proporción mucho mayor de células T CD4+ efectoras, de modo que las proporciones de células T CD4+ efectoras respecto a las Tregs eran significativamente mayores entre los ratones silvestres que en los de laboratorio (Tabla suplementaria 2).
De forma similar, en el caso de las células T CD8+, los ratones silvestres tenían una proporción significativamente mayor de células efectoras/de memoria (CD62L- CD44hi) y de células terminalmente diferenciadas (KLRG1+) que los ratones de laboratorio (y, por tanto, proporciones significativamente menores de naïve) (Fig. 3c,d). Los ratones silvestres también tenían proporcionalmente menos células T CD8+ de memoria central (CD62L+ CD44hi) que los ratones de laboratorio; esta diferencia se debió en parte a la baja frecuencia de estas células en los ratones machos silvestres (Tabla suplementaria 2), pero también puede reflejar la distribución relativa de las células T CD8+ experimentadas con antígenos entre los subconjuntos de memoria y efectores. De nuevo, la proporción de células T CD8+ de memoria efectoras/efectoras con respecto a las Tregs fue significativamente mayor en los ratones salvajes que en los de laboratorio (Tabla Suplementaria 2).
En consonancia con la idea de que el desafío patógeno frecuente o persistente impulsa la expansión de los subconjuntos de células T CD4+ y CD8+ con experiencia en antígenos en ratones silvestres, hubo correlaciones positivas significativas entre las proporciones de células T CD4+ y CD8+ efectoras y la edad entre los ratones silvestres hembra (correlaciones de Pearson (de dos colas) edad y CD4+ efector r=0,62, P<0,0001, n=51; edad y efector CD8+ r=0,49, P<0,0001, n=50; Datos suplementarios 2). Curiosamente, estos parámetros no estaban fuertemente correlacionados con la edad en los ratones salvajes machos (correlación de Pearson (dos colas) r<0,1, P>0,05, n=66) lo que apunta a diferentes estrategias inmunológicas de los ratones machos y hembras en la naturaleza.
En contraste con el estado altamente cebado/efector de las células T esplénicas, los linfocitos B CD19+ de los ratones salvajes tenían predominantemente un fenotipo naïve. Clasificamos los linfocitos B CD19+ esplénicos como células naïve (CD38+ IgD+), de memoria (CD38+ IgD- GL7-) o de centro germinal (CD38lo IgD- GL7hi)14, e identificamos las células recientemente activadas y experimentadas en antígenos por su expresión de MHC clase II y la unión de la aglutinina de cacahuete (PNA; indicando la expresión del receptor de PNA, PNA-R)15 (Fig. 4a). A pesar de sus elevadas concentraciones de inmunoglobulinas en suero, los bazos de los ratones salvajes contenían proporciones significativamente mayores de células B naïve (y, recíprocamente, proporciones significativamente menores de células B de memoria) que los ratones de laboratorio (Fig. 4b,c). Esta observación, inicialmente contraria a la intuición, probablemente refleja la reubicación de las células B experimentadas en antígenos del bazo a la médula ósea, a otros tejidos linfoides o a los sitios de infección, junto con la repoblación continua del bazo por células B ingenuas derivadas de la médula ósea. Los ratones silvestres tenían proporcionalmente más células B del centro germinal en sus bazos que los ratones de laboratorio y la unión del PNA era comparativamente más alta en todos los subconjuntos de células B en los ratones silvestres, lo que es consistente con la activación reciente15 (Fig. 4d, Tabla Suplementaria 2). En conjunto, estos resultados apuntan a un alto recambio de células B CD19+ activadas en bazos de ratones silvestres.
Los ratones silvestres tienen una población de células mieloides hasta ahora desconocida
A continuación, identificamos las células mieloides como CD11b+ CD11c- (Fig. 5a) y analizamos su expresión de F4/80 y Ly6G, revelando cuatro subpoblaciones de células F4/80+, denominadas M1-M4 (Fig. 5b-d). Éstas incluyen F4/80+ Ly6G- (M1) macrófagos residentes en el tejido, F4/80+ Ly6Glow (M2) monocitos/macrófagos de la pulpa roja y F4/80+/-Ly6Ghigh (M4) células polimorfonucleares (PMN). La población de PMN M4 podía dividirse a su vez en neutrófilos y células supresoras derivadas de los mieloides en función de sus características de dispersión frontal y lateral (Fig. 5e). Es importante destacar que en los ratones salvajes, pero no en los de laboratorio, identificamos una población adicional de células F4/80+ que expresan niveles de Ly6G intermedios entre los monocitos/macrófagos y los PMN (M3). Por lo que sabemos, se trata de una nueva población de células no descrita anteriormente, que hemos denominado células mieloides hipergranulocíticas (HGMC) sobre la base de sus características de dispersión frontal y lateral (Fig. 5c-e). Aunque hay algunas ligeras diferencias en los niveles de expresión de Ly6G entre las poblaciones M2 y M3/M4 en ratones salvajes y de laboratorio (Fig. 5c), la selección de cada población en función de CD11b, CD11c y la dispersión frontal y lateral confirmó que las poblaciones M2 en ratones salvajes y de laboratorio son por lo demás idénticas y que la población de Ly6G alta en ratones de laboratorio es equivalente a la población M4 en ratones salvajes (Fig. 5d). La comparación de la dispersión lateral para cada población también confirma que la población M3 hipergranulocítica de alta dispersión lateral sólo se ve en los ratones salvajes (Fig. 5f). El significado funcional de estas células es aún desconocido, pero su descubrimiento enfatiza que el estudio de los ratones de laboratorio no revela necesariamente el armamento completo del sistema inmune.
Los ratones salvajes no sólo tenían proporcionalmente más células mieloides CD11b+ CD11c- en sus bazos que los ratones de laboratorio, sino que, dentro de la población mieloide, los PMN y HGMC estaban enriquecidos a expensas de los macrófagos y los monocitos (Fig. 5a,f, Tabla Suplementaria 2). La expansión y/o acumulación de neutrófilos y HGMC en los bazos de los ratones salvajes es consistente con la exposición reciente o actual a la infección en los ratones salvajes. Las células dendríticas CD11c+ esplénicas eran proporcionalmente más raras en los ratones salvajes en comparación con los ratones de laboratorio (Fig. 5g, Tabla Suplementaria 2).
Las células NK de los ratones salvajes están altamente activadas
Caracterizamos las células NKp46+ CD3ɛ- (Fig. 6) como células tempranas (estadio 1), medias (estadio 2), tardías (estadio 3) o totalmente maduras (estadio 4) por la expresión de CD27 y CD11b (Fig. 6a). Los ratones silvestres tenían mayores proporciones de células en estadio 1 y 2 y menores proporciones de células NK esplénicas en estadio 3 y 4, resultando en proporciones significativamente mayores de células NK tempranas/medias a células NK tardías/maduras que los ratones de laboratorio (Fig. 6b, Tabla 2). La expresión del marcador de activación reciente/temprana CD69 fue mayor en todos los subconjuntos de células NK de ratones salvajes en comparación con los ratones de laboratorio (Fig. 6c, Tabla 2), pero -salvo en las células del estadio 1- la expresión del marcador de diferenciación terminal KLRG1 tendió a ser menor (Fig. 6, Tabla 2). En conjunto, estos datos son consistentes con la activación, la autorrenovación y la expansión homeostática16 , y por lo tanto con tasas más altas de recambio, de las células NK esplénicas de los ratones salvajes en comparación con los ratones de laboratorio.
A continuación exploramos la expresión de la familia Ly49 de receptores reguladores de lectinas de tipo C en las células NK (Fig. 6e-h) razonando que la expresión estocástica de los miembros de la familia de receptores Ly49 en las células NK individuales, combinada con la diversidad genética de la población, podría conducir a la heterogeneidad de las células NK dentro de un individuo y a una amplia variación en el fenotipo de las células NK entre individuos11. Los receptores Ly49 inhibitorios reconocen el auto-MHC de clase I y evitan que las células NK maten a las células sanas, mientras que los receptores Ly49 que reconocen los ligandos asociados a los patógenos conducen a la activación de las células NK y a la muerte de las células infectadas; el ejemplo mejor descrito de esto es la unión de Ly49H a la glicoproteína m157 del citomegalovirus murino (MCMV), que media la inmunidad protectora contra el MCMV (ref. 17).
Analizamos la expresión de dos receptores activadores (Ly49D y Ly49H) y un receptor inhibidor (Ly49G2). En la mayoría de los ratones de laboratorio C57BL/6, las células NK expresaban Ly49D, Ly49G y Ly49H (Fig. 6e-h) con un 5-45% de células NK que expresaban cada uno de los receptores, lo que coincide con informes anteriores18. Por el contrario, muy pocos ratones salvajes tenían células NK Ly49H+ (10%, n=125, ≥1% de células Ly49H+, Datos Suplementarios 1), lo que sugiere que el gen que codifica este receptor es raro en esta población de ratones salvajes o que la variación alélica impide el reconocimiento por el anticuerpo anti-Ly49H. Hemos genotipado ratones en el locus Ly49h para una deleción que está asociada con la susceptibilidad a MCMV (ref. 17), encontrando que el 18% de los ratones salvajes eran homocigotos para esta deleción (intervalo de confianza del 95% 9,5-30%, n=98 ratones del sitio HW; frecuencia del alelo de la deleción 0,42 asumiendo el equilibrio Hardy-Weinberg). Es probable que esto contribuya en parte a la escasez de células NK Ly49H+ entre los ratones salvajes, pero plantea preguntas sobre la presencia de alelos nulos adicionales en el locus Ly49h, y si otros receptores pueden compensar la falta de Ly49H en los ratones salvajes, especialmente dada la alta prevalencia de MCMV en las poblaciones de ratones salvajes, que se ha informado que es del 62 y 79% (refs 19, 20). La aparente ausencia de Ly49H entre los ratones salvajes puede explicar su expresión mucho más frecuente del receptor activador alternativo Ly49D y sugiere que puede haber diferencias importantes entre los ratones salvajes y los de laboratorio en las contribuciones de las células NK a la inmunidad funcional.
Identificamos tres poblaciones de células Ly49G2: Ly49G2-, Ly49G2low y Ly49G2high (Fig. 6g). Entre los ratones salvajes la mayoría de las células Ly49G2+ eran Ly49G2low, mientras que en los ratones de laboratorio predominaban las células Ly49G2high. Esto sugiere la presencia de diferentes alelos en el locus codificador de Ly49G2 en las poblaciones salvajes y de laboratorio. Entre los ratones de laboratorio, las diferencias entre cepas en la expresión del receptor Ly49G se han relacionado con la variación alélica en la actividad del promotor21 y pueden influir en el umbral de activación de las células NK18. Estos datos apoyan la idea de que existe una amplia diversidad alélica, hasta ahora no documentada, entre los receptores Ly49, con probables consecuencias importantes para la función de las células NK en estado salvaje.
Queríamos entender el equilibrio de la expresión de los receptores Ly49 activadores e inhibidores en las células NK, y por ello comparamos las proporciones de células NK que expresan o no Ly49D y Ly49G2 (Fig. 6e). Los ratones silvestres tenían proporciones significativamente mayores de células Ly49D+G- que los ratones de laboratorio, mientras que los ratones de laboratorio tenían proporciones significativamente mayores de células Ly49D-G+ que los ratones silvestres (Tabla 2), lo que sugiere que las células NK de los ratones silvestres pueden tener un umbral más bajo para la activación, aunque esto estará muy influenciado por el genotipo del MHC clase I y la expresión de otros receptores Ly49 no ensayados aquí. En conjunto, estos resultados muestran que las células NK de los ratones salvajes pueden ser, y son, mucho más fácilmente activadas que las de los ratones de laboratorio, lo que puede ser una respuesta necesaria a la alta carga de patógenos del entorno salvaje.
Los ratones salvajes tienen respuestas reducidas de citoquinas a los PAMPs
A la luz del estado altamente activado del sistema inmune celular de los ratones salvajes medimos la respuesta inmune funcional cultivando esplenocitos en presencia de PAMPs (CpG, el ligando para el TLR9 expresado en el endosoma; PG, un agonista de TLR2; LPS bacteriano, un ligando para TLR4) y un mitógeno (anticuerpos monoclonales para las moléculas de superficie de las células T CD3 y CD28). Entre las 45 comparaciones realizadas entre ratones silvestres y de laboratorio (5 condiciones de cultivo × 9 citocinas) sólo se observaron 16 diferencias significativas entre los ratones silvestres y los de laboratorio, y en 13 de ellas las concentraciones de analitos fueron significativamente menores en los ratones silvestres (Fig. 7, Datos suplementarios 1, Tabla suplementaria 5). Cabe destacar que los ratones silvestres produjeron significativamente menos IL-12 (p40 y p70) y menos IL-13 que los ratones de laboratorio en respuesta a los ligandos relacionados con los patógenos y también hubo una tendencia a que la producción de IL-10 fuera menor en los ratones silvestres, aunque esto sólo fue significativo al inicio. Estas respuestas de citoquinas comparativamente reducidas contrastan significativamente con el estado inmunitario celular altamente activado de los ratones salvajes. Especulamos que alguna forma de tolerancia inmune innata puede estar operando para limitar el grado de inflamación en ratones salvajes crónicamente y altamente expuestos a patógenos. Las únicas respuestas de citoquinas que fueron significativamente mayores en los ratones silvestres que en los de laboratorio fueron las respuestas de IFN-γ, IL-4 y MIP-2α a los anti-CD3/anti-CD28, que son coherentes con las mayores proporciones de células T efectoras y de memoria en los ratones silvestres. Estos resultados sugieren que las respuestas de citoquinas innatas, y sus efectos funcionales, pueden necesitar ser reevaluadas en los ratones de laboratorio.
Las concentraciones de nueve citoquinas (IFN-γ, IL-1β, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12p40, IL-12p70, IL-13, MIP-2α) producidas por linfocitos esplénicos estimulados con anti-CD3/anti-CD28, CpG, LPS o PG en comparación con el control RPMI en ratones salvajes (sombreados) y de laboratorio (sin sombrear), mostradas en una escala log10. Los centros de las cajas son las medianas, y los límites de las cajas los percentiles 25 y 75, los bigotes 1,5 veces el rango intercuartil, y los valores atípicos se representan con puntos. Las líneas horizontales punteadas muestran la mediana del límite inferior de cuantificación definida a partir de las curvas estándar en todas las placas analizadas para cada citoquina. Los asteriscos denotan diferencias significativas como *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 (prueba U de Mann-Whitney; Tabla suplementaria 5). Los tamaños de las muestras se muestran en los datos suplementarios 1 y en la tabla suplementaria 5.