WYNIKI I DYSKUSJA

Ogólną ważność równania 3 można ocenić na kilka sposobów. Po pierwsze, stosując wyrażenie na szybkość reakcji katalizowanej przez WWA, z uwzględnieniem stałych kinetycznych podanych w równaniu, obliczono, że podstawowa szybkość reakcji hydroksylacji wynosi 0,010 μmol/ml na h. Wartość ta dobrze zgadza się z następującymi wartościami. Wartość ta dobrze zgadza się z następującymi wartościami podanymi dla osób zdrowych na podstawie doświadczeń, w których osobom tym podawano l-fenyloalaninę: 0,013 μmol/ml na h; 0,008 μmol/ml na h (34); 0,012 μmol/ml na h (5); 0,010 μmol/ml na h (6). Wartość 0,020 μmol/ml na h stwierdzono w ostatnim badaniu, gdy badanym podawano infuzję l-fenyloalaniny (6). Przytoczone wskaźniki in vivo dla konwersji fenyloalaniny do tyrozyny wszystkie zostały zgłoszone jako μmol/h na kg. Zostały one przeliczone na μmol/ml na godzinę na podstawie tych samych założeń, które zastosowano poprzednio, tj. że dystrybucja objętościowa metabolitów takich jak fenyloalanina wynosi 500 ml/kg masy ciała. Wyniki te pokazują, że obliczona szybkość hydroksylacji fenyloalaniny zgadza się dobrze z doświadczalnie wyznaczonymi szybkościami.

Innym testem ważności modelu jest obliczenie poziomu fenyloalaniny we krwi w stanie ustalonym zarówno dla osób z grupy kontrolnej, jak i dla heterozygot PKU, u których zakłada się, że mają 50% normalnej aktywności PAH, a także t1/2 dla klirensu ładunku fenyloalaniny (tj, czas wymagany do tego, aby początkowe stężenie fenyloalaniny zmniejszyło się do połowy swojej pierwotnej wartości) z krwi dla tych dwóch grup. Poziom fenyloalaniny w stanie stacjonarnym dla osób z grupy kontrolnej, obliczony na podstawie równania 3 (poprzez ustawienie terminu „-dPhe/dt” równego zero i obliczenie stężenia fenyloalaniny), wynosi 0,059 mM, a dla osób z 50% resztkową aktywnością PAH wynosi 0,079 mM, czyli jest 1,34-krotnie wyższy od poziomu kontrolnego. Chociaż wartość 0,059 mM dla normalnych osób zgadza się dobrze z przyjętą wartością 0,058 ± 0,015 mM (średnia i SD) (35), wartość 0,079 mM dla heterozygot, u których można się spodziewać 50% normalnego poziomu PAH, wydaje się być zbyt niska. Stosunek poziomów fenyloalaniny we krwi dla kontroli i dla obowiązkowych heterozygot PKU został zgłoszony w zakresie 1,57-1,61 (36-38), a nie stosunek 1,34, który został przewidziany przez model.

Ta obliczona wartość podnosi możliwość, że heterozygoty PKU mogą mieć mniej niż 50% kontrolnej aktywności PAH. Podstawienie wartości 40% kontrolnej aktywności PAH dla heterozygot do Eq. 3 daje stężenie fenyloalaniny w stanie stacjonarnym 0,093 mM; używając tej wartości i wartości 0,058 mM dla kontroli, uzyskuje się stosunek 1,60, który jest bliski zakresowi zgłoszonemu dla heterozygot i kontroli (patrz wyżej). W związku z tym należy zauważyć, że aktywność resztkowa PAH w próbkach biopsji wątroby stwierdzona u sześciu heterozygot HPA obligate wahała się od 5,8 do 31% wartości kontrolnych (39). Wyniki te stanowiły pierwsze wskazanie, że heterozygoty HPA mają znacznie mniej niż 50% aktywności kontrolnej. Dwa późniejsze większe badania rodziców pacjentów z PKU były zgodne z tymi wcześniejszymi wynikami: w jednym badaniu odnotowano średnią wartość 29,3% kontroli (n = 9) (40), a w innym średnią wartość 28,1% (n = 8) (41).

Model przewiduje również wartości t1/2 dla klirensu fenyloalaniny z krwi zarówno dla normalnych, jak i heterozygot, które są zgodne z rzeczywistymi wynikami klinicznymi. Dla normalnych ludzi uzyskano wartość 65 min, która jest niższa od średniej wartości 89 min, ale mieści się w zakresie 60-120 min (10). Dla heterozygot z 50 i 40% resztkową aktywnością PAH, wartości t1/2 obliczone z Eq. 3 wynoszą odpowiednio 144 i 180 min, w porównaniu z podawaną średnią wartością 159 min .

Odniesiono się wcześniej do raportu dwóch pacjentów HPA, których niezdolność do metabolizowania fenyloalaniny wydawała się być wynikiem niedoboru transaminazy (11) i dowodów przeciwko temu wnioskowi (12). Obecny model dostarcza dodatkowych powodów, aby spojrzeć na to twierdzenie sceptycznie. Rys. 2 pokazuje przebieg czasowy zaniku 1 mM fenyloalaniny z osocza osoby kontrolnej (krzywa A), jak również osoby pozbawionej transaminazy, ale z normalnym poziomem PAH (krzywa B). Jak widać, oba wskaźniki są prawie takie same, co czyni niezwykle mało prawdopodobnym, że wyraźne HPA może być spowodowane przez brak transaminazy. Powodem bliskiej identyczności tych dwóch szybkości jest to, że szybkość znikania fenyloalaniny w całkowitej nieobecności PAH (krzywa D) jest bardzo mała, początkowa szybkość wynosi tylko 2,6% tej w kontroli z normalnym poziomem PAH. Rys. 2 (krzywa C) pokazuje również szybkość usuwania fenyloalaniny u osobnika z 40% normalnego poziomu PAH, deficyt aktywności PAH, który, jak omówiono powyżej, może reprezentować średnią dla heterozygot PKU.

Ostatnio pacjenci z PKU byli klasyfikowani poprzez przypisanie ich do kategorii fenotypu na podstawie ich tolerancji fenyloalaniny w diecie. Pacjenci z klasycznym PKU tolerują mniej niż 20 mg/kg fenyloalaniny dziennie, aby utrzymać poziom fenyloalaniny we krwi na akceptowanym poziomie 0,3 mM, ci z „umiarkowanym PKU” tolerują 20-25 mg/kg dziennie, a ci z „łagodnym PKU” tolerują 25-50 mg/kg dziennie (42).

Aby sprawdzić, czy te wartości tolerancji fenyloalaniny w diecie są spójne z przewidywaniami dokonanymi przez Eq. 3, założono, że spożycie dozwolonej ilości fenyloalaniny zostało podzielone równo na trzy „posiłki”. Dla klasycznych pacjentów z PKU, u których spożycie fenyloalaniny wynosi 15 mg/kg dziennie, każdy posiłek zawierałby 5 mg/kg dziennie i dodawałby 0,06 μmol/ml do wartości wyjściowej 0,30 μmol/ml dla całkowitego poziomu fenyloalaniny w osoczu 0,30 + 0,06 = 0,36 μmol/ml. Podstawiając tę wartość do Równania 3 (zakładając, że Vmax dla klasycznego pacjenta PKU jest równe zeru), -dPhe/dt jest równe 0.001 μmol/ml na godzinę, tj. przy tym poziomie fenyloalaniny, prędkość znikania fenyloalaniny poprzez reakcję transaminacji ledwo przekracza prędkość wejścia fenyloalaniny do puli osoczowej poprzez degradację białek netto. Dlatego też, Eq. 3 przewiduje, że ci pacjenci PKU mogliby tolerować spożycie fenyloalaniny na poziomie 15 mg/kg dziennie.

Obliczone w ten sam sposób, „umiarkowane PKU” pacjentów z tolerancją diety fenyloalaniny 25 mg/kg dziennie wymagałoby resztkowej aktywności PAH równej 15% aktywności dzikiego typu, aby zmetabolizować ją w 3.5 h. Podobnie, pacjenci z „łagodnym PKU” z tolerancją fenyloalaniny w diecie wynoszącą 50 mg/kg dziennie wymagaliby resztkowego poziomu PAH równego 25% poziomu typu dzikiego, aby zmetabolizować dodaną fenyloalaninę w czasie około 3.5 h. Wyniki te wskazują, że Eq. 3 może stanowić o tolerancji diety fenyloalaniny widzianej w tych różnych grupach pacjentów.

Byłoby użyteczne, aby spróbować skorelować te szacunki resztkowej aktywności PAH dla „łagodnego PKU” i „umiarkowanego PKU” pacjentów z resztkową aktywnością hydroksylazy mierzoną in vitro dla zmutowanych gatunków PAH przechowywanych przez pacjentów. W chwili obecnej, jednakże, taka próba jest utrudniona z powodu zbyt dużego rozrzutu danych in vitro. Tak więc, kilku pacjentów sklasyfikowanych jako posiadających „umiarkowane PKU” (42) okazało się być nosicielami następujących trzech zmutowanych form PAH (z ich pozostałą aktywnością PAH in vitro wyrażoną jako procent aktywności typu dzikiego, pokazaną w nawiasie): L348V (25%), R261Q (30%, 47%), i R158Q (10%) (43). Można zauważyć, że wartości te różnią się prawie 5-krotnie. Jak omówiono wcześniej (2, 43), ogólnie rzecz biorąc, szacunki in vitro dotyczące aktywności resztkowej hydoksylazy mutantów PAH są zwykle wyższe niż te obserwowane w biopsjach wątroby. Przynajmniej jednym z powodów tej tendencji jest to, że aktywność PAH in vitro jest zwyczajowo mierzona przy użyciu nasycających stężeń fenyloalaniny i BH4, jak to miało miejsce w przypadku mutanta R261Q (44). Biorąc pod uwagę tę sytuację, możliwe jest, że resztkowe aktywności PAH oszacowane przy użyciu Eq. 3 może okazać się lepszym odzwierciedleniem w in vivo działalności niż te mierzone in vitro.

Ten model metabolizmu fenyloalaniny jest istotne dla wniosku osiągniętego przez Thompson i jego współpracowników (45, 46), na podstawie wyników uzyskanych przez infuzji przedmiotów z deuteru znakowanych fenyloalaniny i tyrozyny, że klasyczne PKU pacjenci mają „znaczne” PAH aktywności, która jest równa około 76%, że z przedmiotów kontrolnych. Ta zadziwiająco wysoka aktywność hydroksylacji fenyloalaniny została przypisana hydroksylazie tyrozyny (45). Jak już omówiono, wyniki podsumowane na ryc. 2 pokazują, że przy braku PAH, dawka fenyloalaniny jest usuwana z krwi w tempie mniejszym niż 3% tempa obserwowanego u osób kontrolnych. Nie ma żadnych wskazań z obecnej analizy, że jakakolwiek alternatywna ścieżka istnieje u ludzi, która może pozbyć się dużych ilości fenyloalaniny. Ostatnio van Spronsen et al. (34) zwrócili uwagę na potencjalny problem metodologiczny z metodą zastosowaną przez Thompsona i coworkers.

Podsumowując, ilościowe wyniki uzyskane za pomocą modelu metabolizmu PAH są spójne z danymi, które pośrednio odzwierciedlają aktywność in vivo PAH, takimi jak poziomy fenyloalaniny we krwi w stanie stacjonarnym, szybkości klirensu (konwencjonalnie wyrażone jako wartości t1/2) fenyloalaniny z krwi po obciążeniu fenyloalaniną i tolerancji diety dla fenyloalaniny. Model ma potencjał do ilościowego oszacowania aktywności resztkowej WWA na podstawie każdej z tych wartości, w szczególności na podstawie zmierzonych szybkości oczyszczania ładunku fenyloalaniny. Przewidywane poziomy resztkowych PAH lub wartości uzyskane na ich podstawie mogą być pomocne w podejmowaniu decyzji o tym, jak rygorystyczne musi być dietetyczne ograniczenie fenyloalaniny, aby osiągnąć pożądany poziom fenyloalaniny we krwi. Tabela 1 podsumowuje wartości t1/2 i poziomy fenyloalaniny we krwi w stanie stacjonarnym obliczone na podstawie równania 3 (zakładając brak spożycia fenyloalaniny w okresie badania) dla różnych poziomów aktywności resztkowej PAH, a także porównywalne wartości z odpowiednich danych klinicznych.