Arystoteles uczył Aleksandra (356-323 p.n.e.), zanim książę odziedziczył tron Macedonii w 336 r. p.n.e. i zaczął rozszerzać imperium, które jego ojciec zdobył w drodze podboju. Później w ogrodzie przy Liceum w Atenach pojawiły się rośliny wniesione przez zwolenników wojsk Aleksandra. Teofrast oparł wiele opisów roślin na relacjach uzyskanych od podróżników, którzy odwiedzili odległe regiony imperium Aleksandra. Biblioteka w Aleksandrii, z której prawdopodobnie korzystał Dioscorides, została otwarta za panowania generała Aleksandra, Ptolemeusza I Sotera (ok. 367 p.n.e.-ok. 283 p.n.e.). Ptolemeusz I był bliskim osobistym przyjacielem Aleksandra i być może uczniem, którego uczył Arystoteles. Został władcą Egiptu w 323 r. p.n.e. po śmierci Aleksandra. Faktyczną pracę przy planowaniu i nadzorowaniu biblioteki powierzono Demetriuszowi z Faleronu (ok. 350- ok. 280 p.n.e.), uczniowi Teofrasta z Liceum.

Aleksander rządził Macedonią jako regent od 340 p.n.e., podczas gdy jego ojciec, Filip II, prowadził wielką armię macedońską, która najechała Trację, kraj graniczący z Macedonią na wschodzie. Później Aleksander pokłócił się z Filipem i opuścił Macedonię, ale w 336 r. p.n.e. Filip został zamordowany, a Aleksander, w wieku 20 lat, został Aleksandrem III Macedońskim, później nazwanym Aleksandrem Wielkim. Gdy wieści o śmierci Filipa rozeszły się, ludzie w krajach podbitych przez Macedończyków dostrzegli szansę na odzyskanie wolności, a Aleksander musiał działać. Zaczął od egzekucji wszystkich swoich przeciwników w Macedonii, a następnie przywrócił macedońskie rządy w Grecji, Tracji i Ilirii.

Pozostawiając doświadczonego generała Antypatera (ok. 398-319 p.n.e.) do utrzymania porządku w kraju, w 334 p.n.e. Aleksander poprowadził duże siły do Azji Mniejszej jako pierwszy etap swojej imperialnej ekspansji. Macedończycy pokonali dużą armię perską, zabezpieczyli wybrzeże Azji Mniejszej, a w 333 r. p.n.e. walczyli i pokonali kolejną armię perską, tą dowodzoną przez perskiego króla Dariusza III. Następnie wojska Aleksandra ruszyły na południe przez Syrię i Fenicję. Wiosną 331 r. p.n.e. Macedończycy wkroczyli do Egiptu. Po kilku miesiącach wrócili do Tyru, gdzie otrzymali posiłki z Europy i ruszyli na wschód. Ponownie pokonali Persów pod Gaugemala, na wschód od rzeki Tygrys, zajęli Babilon, a następnie zdobyli Suzę i perską stolicę, Persepolis, a Aleksander został ogłoszony królem Azji. Macedończycy wznowili pościg za Dariuszem, którego znaleźli umierającego od ran zadanych przez jednego z jego własnych szlachciców – który później został schwytany przez Macedończyków i ukarany z rozkazu Aleksandra. Posuwając się na wschód w kierunku Azji Środkowej, dotarli do gór Tian Shan w zachodnich Chinach, gdzie w miejscu pochówku znaleziono statuetkę greckiego żołnierza.

W 326 r. p.n.e. Aleksander zaprosił wodzów z dzisiejszego północnego Pakistanu do poddania się jego władzy. Niektórzy się zgodzili, ale inni sprzeciwili się Macedończykom i zostali pokonani dopiero po ciężkich walkach, w których Aleksander został ranny. Żołnierze macedońscy, którzy tęsknili za swoimi domami i rodzinami, sprzeciwili się planom Aleksandra, by posunąć się dalej w głąb Indii i przekonali go, by zawrócił. Dotarli do Babilonu, gdzie Aleksander zmarł 11 czerwca 323 r. p.n.e. w pałacu Nabuchodonozora II. Historycy nie są pewni co do przyczyny jego śmierci, ale najprawdopodobniej była ona spowodowana chorobą. Za miesiąc Aleksander skończyłby 33 lata. Jak pokazuje poniższa mapa, w szczytowym okresie jego imperium rozciągało się od Macedonii na zachodzie do doliny Indusu na wschodzie i od południowych wybrzeży Morza Czarnego i Kaspijskiego do Egiptu. Imperium zaczęło się rozpadać w ciągu kilku lat od śmierci Aleksandra, rozpadając się na wiele niezależnych królestw.

Aleksander był uczniem Arystotelesa, i chociaż edukacja młodego człowieka została przerwana, był bardzo inteligentny, a Arystoteles wywarł silny wpływ na jego rozwój. Arystoteles zachęcał wszystkich swoich uczniów do obserwowania i badania świata przyrody, a Aleksander był żywo zainteresowany roślinami i zwierzętami. Duży orszak uczonych towarzyszył mu, gdy prowadził swoje armie. Mierzyli odległości, przygotowywali mapy, studiowali nieznane religie, a także florę i faunę. Gdy natrafiali na nieznane gatunki roślin i zwierząt, Aleksander wysyłał okazy do Europy, a wiele z nich do Liceum w Atenach, by zainteresował się nimi sam Arystoteles. Zbierał wszelkie możliwe informacje na temat miejscowego ziołolecznictwa i praktykował medycynę, osobiście lecząc niektóre z urazów i chorób trapiących jego żołnierzy.

W 332 roku p.n.e. Aleksander założył miasto Aleksandria na miejscu Rhakotis, egipskiego portu rybackiego. Zamierzał, aby miasto stało się pomostem między kulturami Grecji i Egiptu, ale pozostał tam tylko przez kilka miesięcy po rozpoczęciu budowy i nigdy nie wrócił. Po śmierci Aleksandra, Ptolemeuszowi I udało się sprowadzić jego ciało do miasta. Biblioteka w Aleksandrii została zbudowana jako replika Liceum, z kolumnadą i ogrodami. Były tam sale wykładowe, czytelnie i wspólna jadalnia, a biblioteka znajdowała się obok i w służbie Musaeum, które było świątynią wykorzystywaną jako instytucja naukowa – od niego pochodzi słowo muzeum. Kierownicy biblioteki otrzymali polecenie zbierania wszelkich informacji na świecie. Przedstawiciele biblioteki uczestniczyli w targach książki w Atenach i na Rodos, a za każdym razem, gdy do portu przybijał statek, wszystkie przewożone przez niego książki były przejmowane i kopiowane, przy czym biblioteka zatrzymywała oryginały, a kopie zwracała kapitanowi statku. To właśnie w tej bibliotece mógł studiować Pedanius Dioscorides. Znaczna część biblioteki została przypadkowo spalona w 48 r. p.n.e. podczas wojny domowej, i chociaż filia biblioteki, znana jako biblioteka-córka, nadal funkcjonowała na południe od miasta, ona również została zniszczona w 391 r. p.n.e., kiedy cesarz rzymski Teodozjusz I (347-395) nakazał zniszczenie wszystkich pogańskich świątyń.

.