I.U.B.: 3.4.21.1
C.A.S.: 9004-07-3

Reakcja enzymatyczna (obrazek otworzy się w nowym oknie)

Chymotrypsyna jest endopeptydazą serynową produkowaną przez komórki brzeżne trzustki. Chymotrypsyna uaktywnia się po proteolizie chymotrypsynogenu przez trypsynę. Podczas gdy trypsyna hydrolizuje lizynę i argininę, chymotrypsyna selektywnie rozszczepia wiązania peptydowe utworzone przez reszty aromatyczne (tyrozynę, fenyloalaninę i tryptofan) (Hedstrom i wsp. 1992). Dwie dominujące formy chymotrypsyny, A i B, występują w równych ilościach w trzustce bydlęcej. Są one bardzo podobnymi białkami (80% identyczności), ale mają znacząco różne właściwości proteolityczne (Hartley 1964, Meloun i wsp. 1966, Smillie i wsp. 1968 oraz Gráf i wsp. 2004). Poniższe informacje odnoszą się głównie do formy A chymotrypsynogenu i chymotrypsyny.

Historia:

Na początku lat 1900, Vernon zaproponował, że preparaty trzustkowe mogą dać początek wewnętrznemu aktywatorowi własnych enzymów (Vernon 1901). Vernon’s mleko-krzepnięcie eksperymenty określić tam były co najmniej dwa enzymy obecne i że jeden był bardziej stabilny niż inne (Vernon 1902). Idea ta nie została jednak powszechnie zaakceptowana aż do 1934 roku, kiedy to Kunitz i Northrop potwierdzili obecność dodatkowego enzymu oprócz trypsyny, nadając mu nazwę chymotrypsyny. Udało im się skrystalizować zarówno chymotrypsynę, jak i nieaktywny prekursor, chymotrypsynogen (Kunitz i Northrop 1934). W 1938 r. Kunitz wyizolował różne aktywne formy chymotrypsyny, określając je jako alfa, beta i gamma (Kunitz 1938).

Na początku lat czterdziestych Fruton i Bergmann dalej badali specyficzność chymotrypsyny, donosząc o kilku nowych substratach (Fruton i Bergmann 1942). Jacobsen wkrótce zidentyfikował dodatkowe formy chymotrypsyny, oznaczając je jako delta i pi (Jacobsen 1947). W 1948 r. Schwert dodatkowo scharakteryzował masy cząsteczkowe chymotrypsyny i chymotrypsynogenu.

W 1954 r. pierwsze dowody na trzystopniowy mechanizm działania chymotrypsyny hydrolizującej substraty amidowe i estrowe zostały przedstawione przez Hartleya i Kilby’ego, którzy wysunęli hipotezę o obecności acylowego intermediatu enzymatycznego, co później okazało się prawdą (Henderson 1970). W 1955 roku Laskowski uzyskał drugi krystaliczny chymotrypsynogen, nadając mu nazwę chymotrypsynogen B. W 1964 roku Hartley ustalił sekwencję aminokwasową chymotrypsyny A, która następnie została uściślona przez Melouna i wsp. w 1966 roku. W 1968 r. Smillie i wsp. określili sekwencję aminokwasową chymotrypsyny B, która wykazała 80% identyczność sekwencji z chymotrypsyną A. W latach 70. i 80. prowadzono badania mające na celu lepsze zrozumienie mechanizmu działania oraz identyfikację różnic w sekwencji aminokwasowej trypsyny i chymotrypsyny (Steitz i wsp. 1969, Cohen i wsp. 1981, Asbóth i Polgár 1983 oraz Gráf i wsp. 1988).

W latach dziewięćdziesiątych oczyszczono chymotrypsynę z innych źródeł, w tym z dorsza atlantyckiego (Ásgeirsson i Bjarnason 1991) oraz wielbłąda (Al-Ajlan i Bailey 1997). Rozpoczęto również prace nad badaniem inhibitorów (Baek et al. 1990), a Frigerio et al. objaśnili strukturę krystaliczną chymotrypsyny bydlęcej do rozdzielczości 2,0 Å (Frigerio et al. 1992).

Późniejsze badania dotyczyły fałdowania i denaturacji chymotrypsyny w zakresie stężeń (Ghaouar et al. 2010), interakcji chymotrypsyny z substratami nanocząsteczkowymi (You et al. 2006, i Jordan et al. 2009), oraz zwiększanie stabilności chymotrypsyny poprzez koniugację z cząsteczkami PEG (Castellanos et al. 2005, i Rodríguez-Martínez et al. 2009).

Swoistość:

Chymotrypsyna jest aktywowana poprzez rozszczepienie wiązania pomiędzy argininą i izoleucyną (R15 i I16) przez trypsynę, powodując modyfikacje strukturalne i tworzenie miejsca wiązania substratu (Sears 2010). Chymotrypsyna różni się od trypsyny tym, że trypsyna rozszczepia peptydy przy resztach argininowych i lizynowych, podczas gdy chymotrypsyna preferuje duże reszty hydrofobowe (Hedstrom i wsp. 1992). Chymotrypsyna preferencyjnie katalizuje hydrolizę wiązań peptydowych z udziałem izomerów L tyrozyny, fenyloalaniny i tryptofanu. Łatwo działa również na amidy i estry podatnych aminokwasów. Specyficzność chymotrypsyny dla dużych hydrofobowych reszt może być wyjaśniona przez hydrofobową S1 kieszeń wiążącą utworzoną przez reszty 189 do 195, 214 do 220 i 225 do 228 (Cohen et al. 1981).

Pomimo że struktura miejsca S1 trypsyny i chymotrypsyny wykazuje tylko jedną różnicę (w pozycji 189), mutageneza ukierunkowana na miejsce wiązania trypsyny i chymotrypsyny nie doprowadziła do zamiany specyficzności, co sugeruje, że mechanizm, za pomocą którego trypsyna i chymotrypsyna osiągają katalizę specyficzną dla substratu, nie jest w pełni zrozumiały (Steitz i in. 1969, i Gráf et al. 1988).

Charakterystyka molekularna:

Chymotrypsyna A i B dzielą 80% identyczności sekwencji (Hartley 1964, Meloun et al. 1966, Smillie et al. 1968, i Gráf et al. 2004). Aminokwasy triady katalitycznej (H57, D102 i S195) s± wysoce konserwowane w sekwencjach peptydaz z rodziny S1 (Gráf i wsp. 2004). Seryna w pozycji 214 jest również silnie konserwowana w rodzinie i została zaproponowana jako czwarty członek triady katalitycznej (Ohara i wsp. 1989, oraz McGrath i wsp. 1992).

Kompozycja:

Trzy reszty aminokwasowe triady katalitycznej (H57, D102 i S195) są niezbędne do rozszczepienia wiązania peptydowego i są stabilizowane przez wiązania wodorowe (Sears 2010, oraz Gráf i wsp. 2004). G193 i S195 tworzą dziurę oksyanionową i oddziałują z grupą karbonylową scisłego wiązania peptydowego, orientując ją tak, aby utworzyła tetraedryczny intermediat (Rühlmann i in. 1973, Huber i Bode 1978 oraz Gráf i in. 2004).

Protein Accession Number: P00766

Klasyfikacja CATH (v. 3.3.0):

• Klasa: Mainly Beta
• Architektura: Beta Barrel
• Topologia: Trypsin-like Serine Protease

Molecular Weight:

• 25.6 kDa (Wilcox 1970)

Optimal pH: 7.8-8.0 (Rick 1974)

Isoelectric Point:

• 8.52 (Chymotrypsynogen, Teoretyczny)
• 8.33 (Chymotrypsyna, Teoretyczny)

Współczynnik ekstynkcji:

• 51,840 cm-1 M-1 (Teoretyczny)
• E1%,280 = 20.19 (Chymotrypsynogen, Teoretyczny)
• E1%,280 = 20.57 (Chymotrypsin, Theoretical)

Rezydencje miejsca aktywnego:

• Histydyna (H57)
• Asparaginian (D102)
• Seryna (S195)

Aktywatory:

• Bromek cetylotributyloamoniowy (Spreti i in. 2008)
• Bromek dodecylotrimetyloamoniowy (Abuin i in. 2005)
• Bromek heksadecylotrimetyloamoniowy (Celej et al. 2004)
• Bromek tetrabutyloamoniowy (Spreti et al. 2001)

Inhibitory:

• Hydroksymetylopirole (Abell i Nabbs 2001)
• Kwasy boronowe (Smoum i wsp. 2003)
• Pochodne kumaryny (Pochet i wsp. 2000)
• Aldehydy peptydowe (Lesner i wsp. 2009)
• Peptydy ze źródeł naturalnych (Telang i wsp. 2009, Roussel i wsp. 2001, oraz Chopin i wsp. 2000)
• Peptydy zawierające nienaturalny aminokwas (Legowska i wsp. 2009, oraz Wysocka i wsp. 2008)

Zastosowania:

• Analiza sekwencji
• Synteza peptydów
• Mapowanie peptydów
• Peptide fingerprinting

.