Introduction

Część światła słonecznego docierającego do ziemi obejmuje widmo ultrafioletowe składające się z trzech sekcji UVC (200-290nm), UVB (290-320nm) i UVA (320-400nm). UVC jest całkowicie pochłaniany przez atmosferę ziemską. Ilość UVA docierająca do ziemi jest ponad 20 razy większa niż UVB.1 UVA odgrywa główną rolę w przedwczesnym starzeniu się i fotokarcynogenezie. UVA zwiększa uwalnianie czynników zapalnych, w tym IL10 z komórek keratynocytów. Dodatkowo zwiększa ekspresję białek zapalnych, takich jak TNFα, IL1α, IL6 i IL8.2,3 UVA odgrywa znaczącą rolę w tworzeniu mutacji w mitochondrialnym DNA w ludzkiej skórze przy pomocy ROS (reaktywnych form tlenu). Powoduje również przedwczesne starzenie się skóry poprzez tworzenie mutacji w komórkach fibroblastów w ludzkiej skórze.4 Rola zwiększonej ekspresji białka p53 w wywoływaniu apoptozy indukowanej UVA jest niezaprzeczalna.5 8-hydroksy-2′-deoksyguanina (8-oxoG) jest cennym wskaźnikiem do śledzenia uszkodzeń oksydacyjnych DNA wywołanych przez UVA i może prowadzić do transwersji G → T.6

W związku z tym, ochrona przed UVA wraz z UVB jest bardzo ważna.

Współczynnik ochronny UVA (UVA-PF) jest używany do oceny skuteczności produktów ochrony przeciwsłonecznej przed promieniami UVA.

Materiały i metody

W tym badaniu dokonano przeglądu i porównania światowych standardów w dziedzinie oznaczania UVA-PF. Cztery normy, mianowicie ISO 24443 (dostarczona przez Unię Europejską, w maju 2013), CEN2006 (dostarczona przez Unię Europejską, RPA, Japonię w Brukseli, w lipcu 12, 2006), FDA 2007 (dostarczona przez Stany Zjednoczone, w sierpniu 27, 2007) i FDA 2011 (dostarczona przez Stany Zjednoczone, w czerwcu 17, 2011) ustanowiły różne protokoły w dziedzinie współczynnika ochrony UVA. Niektóre z nich są prowadzone przy użyciu metod in vivo, podczas gdy inne przy użyciu metod in vitro.7-11

Wyniki

Z uwagi na rolę UVA w powstawaniu uszkodzeń skóry, ważne jest stosowanie filtrów przeciwsłonecznych, które chronią skórę zarówno przed UVA, jak i UVB. Metody in vitro pomiaru UVA-PF nie są wiarygodne i powtarzalne ze względu na różnice w warunkach badania, takie jak zróżnicowanie podłoży, zmienna ilość aplikowanego produktu i dawka promieniowania UV.12 Spośród norm FDA 2007 i CEN wprowadzających metodę PPD in vivo, obie mają zalety i wady, tak więc zastosowanie lepszej metody w każdym przypadku może przynieść lepsze wyniki.

Dyskusja

Ocena testu określania UVA-PF in vivo

Po pierwsze, przejdziemy przez metody określania UVA-PF in vivo przeprowadzone przy użyciu Natychmiastowego Ściemnienia Pigmentu (IPD), Trwałego Ściemnienia Pigmentu (PPD) i Czynnika Ochrony A (PFA). Jednak w normach CEN i FDA 2007 metoda PPD jest akceptowana tylko w metodzie oznaczania in vivo UVA-PF (tabela 1).

Tabela 1 In vivo UVA-PF Determination Protocol Comparison

W metodzie PPD, podobnie jak w metodzie pomiaru SPF (Sun Protection Factor), osoby spełniające kryteria badania są wybierane z określoną liczbą do uczestnictwa. W teście SPF punktem końcowym jest reakcja rumieniowa, w przeciwieństwie do testu PPD, w którym punktem końcowym jest utrzymujące się przyciemnienie pigmentu w badanych miejscach. Miejsca testowe i podmiejsca testowe są zaprojektowane w określonych wymiarach na ślepo na ciałach uczestników. Badane i referencyjne produkty ochrony przeciwsłonecznej są ważone w określonej ilości i nakładane na skórę uczestnika. Następnie, przy zastosowaniu określonej metody, produkt rozprowadza się na skórze, po czym czeka się, aż produkt wyschnie. Osoby, w ustalony wcześniej sposób, wystawiane są na działanie promieniowania UVA w pozycji siedzącej lub leżącej na brzuchu. Po pewnym czasie od ostatniej ekspozycji na promieniowanie UV, poziom trwałego zaczernienia pigmentu jest oceniany jako punkt końcowy testu, a UVA-PF jest obliczany za pomocą zestawu wzorów (które zostaną omówione w sekcji „Statystyki i obliczenia”).

Kryteria selekcji uczestników

Pomimo kryteriów wymienionych w Tabeli 1 (FDA 2007 i wspólne kryteria CEN), normy CEN przewidują dalsze środki ostrożności przy przystępowaniu do testu.

Kryteria dla zdrowego mężczyzny i kobiety, które należy wziąć pod uwagę obejmują:

• Typ skóry II, III i IV13
• Nieuczestniczenie w żadnych testach słonecznych w ciągu ostatnich dwóch miesięcy (brak pozostałych śladów na plecach).
• Brak ekspozycji na słońce na obszarze pleców przez co najmniej 2 miesiące przed badaniem.
• Brak blizn lub aktywnych zmian skórnych na obszarach poddanych testom słonecznym.
• Obszar testowy musi być jednolitego koloru, bez znamion, plam lub przebarwień słonecznych, bez nadmiernego owłosienia.

CEN ustalił również serię kryteriów wykluczenia z badania;

• Przedmioty niespełniające poprzednich kryteriów włączenia.
• Kobiety w ciąży lub karmiące,
• Przeszłe przypadki alergii, reakcji fotoalergicznych, fototoksycznych lub innych nieprawidłowych reakcji na światło słoneczne lub wrażliwość na produkty kosmetyczne, przybory toaletowe, filtry przeciwsłoneczne, lateks i/lub leki stosowane miejscowo.
• Przedmioty z problemami dermatologicznymi na badanym obszarze.
• Przedmioty, które używały produktów samoopalających na plecach w poprzednim miesiącu.

W konsekwencji CEN wydaje się bardziej odpowiedni dla osób wybierających kryterium ze względu na większą spójność.

Liczba uczestników

FDA 2007 i CEN wykorzystują odpowiednio 20 do 25 osób i 10 do 20 osób. Podobnie jak w przypadku innych badań klinicznych, im większa liczba uczestników, tym większa dokładność testu. Z drugiej strony, duża wielkość próby prowadzi do pewnych problemów, takich jak obsługa protokołu, zapewnienie wystarczającej liczby próbek i rezygnacja ochotnika.

Referencyjne preparaty do ochrony przeciwsłonecznej

Zaleca się stosowanie próbki wzorcowej w celu weryfikacji wyników każdej próbki testowej.

Test jest ważny, jeżeli średni współczynnik UVA-PF uzyskany dla referencyjnego produktu ochrony przeciwsłonecznej mieści się w określonym zakresie. Zgodnie z tabelą 1 oba referencyjne filtry przeciwsłoneczne są dobrym wyborem, ponieważ ich wyniki UVA-PF są zbliżone do siebie, a ich składniki aktywne są zatwierdzone.

Rozmiar miejsc i podmiejsc testowych

W wyborze rozmiaru miejsc i podmiejsc testowych ważna jest możliwość zastosowania symulatora słonecznego z wieloma źródłami. Oznacza to, że wybór mniejszych rozmiarów miejsc i podmiejsc może spowodować, że wiele podmiejsc będzie wystawionych na działanie UV w tym samym czasie. Dlatego też standardowe cechy CEN (dla miejsca o wielkości 30 cm2 i dla okręgów o średnicy 8 mm) są bardziej odpowiednie w tej dziedzinie.

W odniesieniu do odległości pomiędzy dwoma miejscami podrzędnymi, FDA 2007 sugeruje odstęp 1 cm. CEN nie określa żadnych odstępów między podpunktami, co sprawia, że cecha FDA 2007 jest istotna dla odległości między podpunktami.

Ilość dawki obciążającej

Ilość obciążająca produktu badanego i produktu referencyjnego jest określana w prawie takiej samej ilości. CEN sugeruje zakres 2mg/cm2±2,5%, a FDA 2007 proponuje 2mg/cm2, które powinny być równomiernie obciążone i rozprowadzone za pomocą łopatki palca. Produkt powinien być umieszczony w małych kroplach na całym obszarze testowym i rozprowadzany specjalnymi ruchami.

Czas rozprowadzania powinien wynosić od 20 do 50 s. Obszary ładowania produktu powinny być wybierane losowo.

Okres oczekiwania między aplikacją filtra przeciwsłonecznego a ekspozycją na promieniowanie UV

Czas oczekiwania sugerowany między załadunkiem produktu a ekspozycją na promieniowanie UV wynosi co najmniej 15 min i 15 do 30 min odpowiednio przez FDA 2007 i CEN.

Urządzenie promieniujące i okresowa kontrola jego lampy

W tabeli 1 przedstawiono wykaz specyfikacji urządzenia promieniującego dla każdej z dwóch norm. Jeśli chodzi o okresową kontrolę urządzenia, FDA 2007 i norma CEN sugerują, aby kontrolę przeprowadzać odpowiednio co 6 i 12 miesięcy.

Według FDA 2011, dane kalibracyjne symulatorów słonecznych i ich lamp UV są stabilne w okresach dłuższych niż 1 rok; dlatego okresową ocenę urządzenia lepiej rozważyć raz w roku.

Tendencja ekspozycji

Jak pokazano dla tendencji ekspozycji w tabeli 1, koncepcja obu metod jest taka sama.

Czas i warunki oceny MPD

MPD to najmniejsza ilość promieniowania UVA wytwarzająca widoczną pigmentację materialną z widocznymi granicami. Kiedy ciemność pigmentu jest ustalona, MPD jest oceniana wizualnie. Dla oceny MPD, CEN i FDA 2007 sugerują odpowiednio 2 do 4 i 3 do 24 godzin po ostatniej ekspozycji. Ocena wzrokowa powinna być przeprowadzona na ślepo przez doświadczonego obserwatora w odpowiednich i jednolitych warunkach oświetlenia. FDA zauważa, że wydaje się, iż ściemnienie pigmentu jest najbardziej stabilne około 3 lub więcej godzin po napromieniowaniu i dlatego proponuje, aby obserwacja ta miała miejsce od 3 do 24 godzin po napromieniowaniu. Ten przedział czasowy zapewnia większą elastyczność metody badawczej bez utraty dokładności. Dlatego kryteria FDA 2007 wydają się być lepsze.

Ocena testu określania UVA-PF in vitro

Wszystkie metody in vitro opierają się na ocenie UV przechodzącego przez cienką warstwę filtra przeciwsłonecznego rozpostartego na chropowatej płytce, tak aby poziom UV był obliczany przed i po ekspozycji na kontrolowaną dawkę ze źródła promieniowania. Jednakże na etapie obliczania poziomu ochrony UVA każda norma określa inny poziom odniesienia (tabela 2).

Tabela 2 In vitro UVA-PF Determination Protocol Comparison

Standard FDA 2007 wykorzystuje zmodyfikowaną frakcję Diffeya, w której obszar pod krzywą absorpcji UVA1 (340nm do 400nm) jest podzielony na całkowity region absorpcji UVA i UVB (290nm do 400nm).14,15 Niemniej jednak FDA 2011 zniosła zmodyfikowaną frakcję Diffeya z następujących powodów:

1. Frakcja ta poświęca znaczną uwagę regionowi UVA1, podczas gdy obszar ten nie odgrywa głównej roli w wywoływaniu szkodliwych efektów skórnych.
2. Jeżeli jeden lub więcej składników produktu wytwarza wysoką absorpcję w regionie UVA2 o krótkiej długości fali i niską lub żadną adsorpcję w regionie UVA1, powstaje duży stosunek, podczas gdy ten produkt nie wytwarza szerokiego zakresu absorpcji.
3. Ten proponowany stosunek nie wykazuje wiarygodnego stopnia ochrony przed UVA i nie ma zastosowania nigdzie indziej na świecie.
4. Jednym ze sposobów zwiększenia tej frakcji jest ograniczenie związków o wysokiej absorpcji w regionach UVA2 i UVB, ale spowoduje to obniżenie poziomu ochrony w tych obszarach widma (innymi słowy, w przypadku zwiększenia frakcji Diffey, SPF powinien się zmniejszyć).

Norma ISO 24443 oblicza współczynnik ochronny UVA zgodnie z wynikami testu PPD. Dwie normy CEN i FDA 2011 uznają metodę krytycznej długości fali za właściwą.

A (λ) to średnia absorpcja przy każdej długości fali, a d (λ) to przedział długości fali pomiędzy poszczególnymi obliczeniami.

Krytyczna długość fali to długość fali, przy której obszar poniżej krzywej absorpcji obejmuje 90% całkowitego obszaru pod krzywą absorpcji UV.

Płyty testowe

Płyty, jako miejsce załadunku, odgrywają kluczową rolę w teście. Spośród płyt kwarcowych, w tym PMMA (polimetakrylan metylu), kolagen uwodniony, naskórek i taśma transpore, płyty PMMA są wybierane ze względu na ich nowość. Następujące powody są czynnikami decydującymi o preferencji w stosunku do innych typów płyt:

1. Jest tańsza niż kwarc.
2. Jest gotowa do użycia i nie wymaga czyszczenia ani ponownego szorstkowania.
3. Jest używany przez ponad dekadę.

Co do wielkości płyt, gdy płyty o wymiarach 16 cm2 dają zadowalające wyniki, nie jest konieczne stosowanie płyt o większych wymiarach (10,2 cm). Jeśli chodzi o stopień chropowatości tych płytek, standard FDA 2011 proponuje strony o chropowatości od 2 do 7 µg, a ISO 24443 proponuje 6-mikronową chropowatość. Wybór stałej chropowatości 6 µm, która jest identyczna we wszystkich tych testach, wydaje się rozsądny.

Referencyjny preparat ochrony przeciwsłonecznej

Zgodnie z tabelą 2, tylko norma ISO 24443 posiada referencyjny produkt ochrony przeciwsłonecznej. Referencyjny filtr przeciwsłoneczny S2 ma współczynnik UVA-PF wynoszący 12,7.

Źródło promieniowania

Przed pomiarem przejścia promieniowania przez płytki pokryte produktem przeprowadza się fazę napromieniowaną dla tych produktów w celu rozważenia stabilności optycznej. FDA 2011 uważa, że promieniowanie symulatora słonecznego (urządzenie proponowane przez FDA 2007) jest filtrowane w taki sposób, że jego energia przy długościach fal poniżej 300 nm jest mniejsza niż czułość spektrofotometru nawet wtedy, gdy na płytkę nie jest nałożony filtr przeciwsłoneczny (tj. współczynnik przejścia wynosi 100%).

W związku z tym FDA 2011 proponuje źródło promieniowania wytwarzające ciągły rozkład spektralny promieniowania UV od 290 do 400 nanometrów. Norma CEN proponuje symulator słoneczny wyposażony w filtry.

Odstępy między operacjami pomiarowymi

Aby zmierzyć przejście promieniowania UV przy każdej długości fali, odstępy między promieniowaniem muszą być przerywane. Odstępy te są ustawione w przedziałach 1nm i 5nm zgodnie z Tabelą 2. Zostało to wspomniane w FDA 2011: W przedłożeniach stwierdzono, że określenie mniejszego interwału dałoby dokładniejsze wyniki i zauważono, że obecne spektrometry są zdolne do wykonywania pomiarów w odstępach 1 nm.

Zakres dynamiczny spektrometru

Zakres dynamiczny jest jednym ze wskaźników do kalibracji spektrofotometru UV. Zakres dynamiczny spektrometru musi być wystarczający do dokładnego pomiaru przejścia filtrów przeciwsłonecznych o wysokiej absorpcji przy wszystkich długościach fali UV (290nm do 400nm).

Ilość załadunku produktu

Ilość i proces załadunku produktu na szorstką część płytki jest określony w każdej normie. Aby zapewnić dokładność w ilości załadunku produktu, możemy zastosować metodę pomiaru wagi pipety przed i po załadunku lub przy pomocy współczynnika gęstości. Produkt jest ładowany w kroplach o jednakowej objętości. FDA 2007, CEN i ISO 24443 używają wartości odpowiednio 2 i 2 mg/cm2 oraz 1,3 mg/cm2. FDA uważa, że przejście UV z grubej warstwy 2mg/cm2 jest mniejsze i prowadzi do niespójnych reakcji. Dlatego też FDA ustaliła wielkość obciążenia na 0,75 mg/cm2 , aby zapewnić, że poziom przechodzenia promieniowania UV mieści się w zakresie dynamicznym detektorów UV.

Sposób rozprowadzania produktu

Łatwe rozprowadzanie produktu ochrony przeciwsłonecznej na płytce znacząco wpływa na dokładność badania. Jak pokazuje tabela 2, proces rozprowadzania może być jednofazowy lub dwufazowy z użyciem lub nieużyciem łopatki na palec. FDA 2011 uważa, że rozprowadzanie dwufazowe jest skuteczniejszym sposobem na uzyskanie stałej i grubej warstwy. Przyczynia się to do lepszej dystrybucji dla szerokiego zakresu postaci leku niż technika 10-sekundowej dystrybucji miękkiej, a także jest zbliżone do rzeczywistego użycia przez konsumentów. Dlatego opinia FDA 2011 i ISO 24443 w sposób rozprowadzający produkt wydaje się najlepszą opcją.

Pre-Irradiation Dose

Tę operację wykonuje się w celu sprawdzenia zmniejszenia stabilności optycznej. Filtr przeciwsłoneczny jest ładowany na płytkę, a następnie wystawiany na działanie źródła promieniowania. Według FDA 2011, ponieważ w jednym czasie i miejscu na powierzchni ziemi promieniowanie słoneczne jest jednakowe dla produktów o wysokim lub niskim SPF i UVA-PF, wówczas dawka przed napromieniowaniem w postaci frakcji SPF lub UVA-PF nie jest logiczna. Tak więc FDA 2011 sugeruje, że dawka przed napromieniowaniem jest wartością stałą. FDA otrzymała informacje, z których wynikało, że produkty zawierające Avobenzone, ulegały całkowitemu zniszczeniu w obliczu ekspozycji na dawkę równoważną 2-3 MED (Minimal Erythemal Dose).

Jest to najgorszy scenariusz degradacji optycznej, ponieważ Avobenzone jest najbardziej niestabilnym wobec światła filtrem przeciwsłonecznym w monografiach filtrów przeciwsłonecznych. 1MED w skórze typu 2 jest równoważny 250 J/m2. Tak więc, w FDA 2011, dawka przed napromieniowaniem jest ustalona na 4MED, co jest równoważne 800J/m2.

Liczba pomiarów przejścia promieniowania

Po ekspozycji produktów na dawkę przed napromieniowaniem, płytki pokryte produktem są umieszczane w spektrofotometrze w celu pomiaru przejścia. Zgodnie z opinią FDA 2011 (5-krotny pomiar z 3 stron), gdy zadowalający wynik uzyskuje się przy mniejszej ilości obliczeń, wtedy nie potrzeba więcej czasu i kosztów.

Statystyki i obliczenia

Zgodnie z CEN, krytyczną długość fali uzyskuje się z następującego wzoru:

gdzie λC jest krytyczną długością fali, a MPF jest współczynnikiem ochrony monochromatycznej, który jest odwrotnością transmitancji przy danej długości fali.

Zgodnie z ISO 24443, początkowo, indywidualny współczynnik ochrony przed promieniowaniem UVA (UVA-PFI) dla każdej podstawy (co najmniej 4 podstawy) oblicza się według następującego wzoru:

gdzie P(λ) jest widmem działania PPD.

I(λ) oznacza widmowe natężenie promieniowania otrzymane ze źródła UVA.

Ae(λ) oznacza średnią absorbancję monochromatyczną warstwy badanego produktu po ekspozycji na promieniowanie UV.

d(λ) oznacza krok długości fali (1 nm).

C oznacza współczynnik dostosowania. Początkowe wartości krzywej absorbancji mnoży się przez wartość skalarną „C” do momentu, gdy wartości SPF obliczone in vitro będą równe SPF zmierzonemu in vivo. Dokonuje się tego w iteracyjnym procesie obliczeniowym. Początkowe wartości absorbancji pomnożone przez wartość „C” stają się skorygowaną krzywą absorbancji filtra przeciwsłonecznego, która jest używana do określenia początkowej wartości UVA-PF0 i dawki ekspozycji. Wartość „C” zazwyczaj mieści się w przedziale od 0,8 do 1,6, co umożliwia prawidłową interpretację. Jeżeli znajduje się poza tym zakresem, należy przygotować nowe próbki w celu potwierdzenia oryginalnych obserwacji.

W ten sposób, zgodnie z poniższym wzorem, oblicza się średnią wartość UVA-PF:

Jeżeli ten warunek Pewny przedział (CI) n jest spełniony, test jest ważny; w przeciwnym razie, liczba baz powinna być zwiększona tak długo, jak długo warunek jest spełniony.

Jeśli wspomniany warunek nie jest spełniony po użyciu 10 baz, test jest uznany za nieważny.

Zgodnie z normami FDA 2011 i FDA 2007 poziom przepuszczalności promieniowania UV oblicza się na podstawie następującego wzoru:

Pomiary widmowego natężenia promieniowania przepuszczanego dla każdej długości fali przez kontrolne płytki PMMA pokryte 15 µl gliceryny.

Pomiary widmowego natężenia promieniowania przepuszczanego dla każdej długości fali λ przez płytkę PMMA pokrytą produktem ochrony przeciwsłonecznej. Średnią absorpcję dla każdej długości fali ( oblicza się z ujemnego logarytmu średniego przechodzącego UV w następujący sposób:

Zgodnie z FDA 2011 krytyczną długość fali oblicza się z tego wzoru;

Zgodnie z FDA 2007 współczynnik frakcji Diffeya oblicza się w następujący sposób:

Powierzchnia UVA I na jednostkę λ jest podawana jako:

Powierzchnia UV na jednostkę λ jest podawana jako:

Wniosek

Z uwagi na rolę UVA w powstawaniu uszkodzeń skóry, stosowanie produktów ochrony przeciwsłonecznej, które chronią skórę przed UVA i UVB, wydaje się niezbędne. Do oceny UVA-PF preferowana jest metoda in vivo, ze względu na jej precyzję i powtarzalność, a także symulację rzeczywistych warunków użytkowania przez ludzi. Wśród norm FDA 2007 i CEN wprowadzających metodę PPD in vivo, obie mają wady i zalety, tak więc zastosowanie lepszej metody w każdym przypadku może dać lepsze wyniki.

.