2.19.2.3.3 Warunki elucji
Efektywne roztwory elucyjne powinny idealnie zakłócać interakcje analit-przeciwciało bez negatywnego wpływu na unieruchomione Abs. Środek wypierający jest wysoce skoncentrowaną cząsteczką reagującą krzyżowo, zdolną do wywołania biospecyficznej desorpcji. Cząsteczki wypieracza konkurują ze związanymi cząsteczkami analitu, a duży nadmiar wypieracza zapewnia ilościową desorpcję analitu. Dla optymalnego działania, wypieracz musi spełniać kilka kryteriów: (1) wysoka reaktywność krzyżowa z unieruchomionymi przeciwciałami, (2) czas retencji znacznie różniący się od czasu retencji analitów, ponieważ duży nadmiar powoduje powstanie wybitnego piku, który może łatwo zakłócać wykrywanie analitów, (3) dobra stabilność i wysoka czystość, ponieważ zanieczyszczenia obecne na poziomie zaledwie 0,01-0,1% mogą zaburzać chromatogram oraz (4) niska cena, nietoksyczność, brak w rzeczywistych próbkach i niska wykrywalność w porównaniu z analitami. Ponadto, konieczna jest duża objętość roztworu elucyjnego, co narzuca rekoncentrację na klasycznym nośniku SPE przed analizą. W związku z tym, preferowane są warunki elucji pozwalające na całkowity odzysk analitu docelowego przy małej objętości elucji.
Jony chaotropowe są powszechnie stosowane do elucji dużych cząsteczek, takich jak białka. Jony te zaburzają strukturę wody wokół dużych cząsteczek, tj. przeciwciał i cząsteczek docelowych, co powoduje rozerwanie oddziaływań hydrofobowych w strukturach dużych cząsteczek oraz pomiędzy analitem a przeciwciałem. Najczęściej występującymi jonami chaotropowymi są jony chlorkowe, jodkowe, nadchloranowe i tiocyjanianowe, w stężeniach od 1,5 do 8 mol l-1. Wykazano jednak, że różne roztwory wodne, które mogą być z powodzeniem stosowane do desorpcji białek z IS, nie są w stanie desorbować małych cząsteczek. Desorpcja białka jest prawdopodobnie oparta głównie na zmianach w strukturze związanego białka (częściowa denaturacja), a nie na zmianach w strukturze unieruchomionych przeciwciał. Dlatego elucja małych cząsteczek, które nie są wrażliwe na denaturację, wymaga znacznie bardziej rygorystycznych warunków. Dodatkowo, wraz ze wzrostem temperatury z 4 do 43 °C, stała dysocjacji oddziaływań przeciwciało-analit może wzrosnąć o dwa rzędy wielkości. Metoda ta nie jest wystarczająco skuteczna, aby można ją było zastosować do elucji małych cząsteczek. Elucja z roztworami o niskim pH jest często przeprowadzana w celu desorpcji małych cząsteczek z IS, ale wymagane są trzy jednostki pH od punktu izoelektrycznego przeciwciała. Ten rodzaj elucji (przesunięcie pH bez zmiany siły jonowej) pozwala na uniknięcie uszkodzenia labilnych przeciwciał. Jedną niedogodnością jest to, że duże objętości są nadal wymagane do całkowitej desorpcji, zmniejszając w ten sposób współczynniki wzbogacenia związane z procedurami ekstrakcji.
Wydajną elucję małych cząsteczek z IS można uzyskać przy zmniejszonej objętości mieszaniny wody i modyfikatora organicznego. Jako przykład, rysunek 6 przedstawia profil elucji dwóch herbicydów, izoproturonu i atrazyny, po perkolacji próbki wody nasyconej każdym analitem na odpowiadającym mu IS. Oceniono kilka rozpuszczalników elucji (metanol, etanol i ACN) zmieszanych z wodą.
Ryc. 6. Profile elucji atrazyny, izoproturonu, 2,4,6-trichlorofenolu i pentachlorofenolu z odpowiadających im IS przy użyciu roztworów elucyjnych zawierających wzrastające ilości rozpuszczalnika organicznego w zakwaszonej lub niezakwaszonej wodzie po przesączeniu próbek wody nasyconych każdym analitem. ACN, acetonitryl; MeOH, metanol; EtOH, etanol; AA, kwas octowy; TFA, kwas trifluorooctowy.
Wynikowe profile elucji silnie zależą od rodzaju rozpuszczalnika. Trzy badane rozpuszczalniki umożliwiają pełną elucję obu analitów. Jednakże ACN prezentuje najwyższą siłę elucji: najniższa zawartość tego rozpuszczalnika zapewnia całkowitą elucję obu analitów. Zawartość ACN wynosząca 40% i 60% jest wystarczająca do odzyskania odpowiednio izoproturonu i atrazyny, podczas gdy 60% i 80% metanolu jest wymagane. W tym przypadku, siła elucji rozpuszczalnika wydaje się być związana z jego hydrofobowym charakterem, ACN (parametr rozpuszczalności Hildebranda δ = 24.3 MPa1/2) jest mniej polarny niż etanol (δ = 26.0 MPa1/2) i metanol (δ = 29.7 MPa1/2). Wyniki te wydają się wskazywać, że interakcje pomiędzy herbicydami i odpowiadającymi im przeciwciałami mają głównie charakter hydrofobowy. Obecność rozpuszczalników niepolarnych zmniejsza komponent wiązania hydrofobowego w interakcji przeciwciało-analit. Jednakże, wpływa ona również na stabilność wiązań hydrofobowych, utrzymując strukturę trzeciorzędową przeciwciała, i powoduje uwolnienie antygenu. Te przykłady dotyczące elucji atrazyny lub izoproturonu z odpowiadających im IS pokazują, że skuteczna elucja zostanie uzyskana przez bezpośrednie dodanie dużej ilości metanolu lub ACN, 70-80%, we frakcji elucyjnej. Ta wysoka ilość modyfikatora organicznego pozwoli na maksymalne zmniejszenie objętości frakcji elucyjnej, umożliwiając w ten sposób zatężenie analitu w eluacie. Należy zadbać o to, aby wybór trybu wiązania był zgodny z tymi warunkami elucji. Zastosowanie wiązania niekowalencyjnego uniemożliwia zastosowanie tak dużej ilości modyfikatora bez ryzyka zakłócenia wiązania przeciwciał z sorbentu. Zastosowanie procesu zol-żel do immobilizacji przeciwciał ogranicza również możliwość użycia dużej ilości rozpuszczalnika organicznego. Wykazano, że duża ilość modyfikatora organicznego, takiego jak przeciwciała, powoduje wymywanie przeciwciał z matrycy zol-żel.8
Niekiedy wymagana jest kombinacja rozpuszczalnika organicznego i kwasu organicznego. Na rysunku 6 przedstawiono również profil elucji 2,4,6-trichorofenolu i pentachlorofenolu z anty-pentachlorofenolu IS przy użyciu mieszaniny hydroorganicznej z dodatkiem i bez dodatku kwasu do eluującego roztworu. Trichlorofenol mógł być całkowicie odzyskany przy użyciu wody/ACN (20:80, v/v) lub wody/ACN (30:70, v/v) zakwaszonej przy pH 3 kwasem trifluorooctowym (TFA). Gdy zakwaszenie uzyskano za pomocą 1% (v/v) kwasu octowego (AA), mieszanina zawierająca tylko 30% ACN była skuteczna do elucji. Z kolei elucja pentachlorofenolu, który ma większe powinowactwo do PAbs niż trichlorofenol, była niemożliwa przy użyciu czystego ACN lub ACN zakwaszonego TFA. Desorpcję można było osiągnąć tylko przy użyciu wody/ACN 20:80 (v/v) zawierającej 1% AA (v/v).
W związku z tym, w większości procedur off-line, w tym tych zalecanych przy użyciu jednorazowych komercyjnych IS, desorpcję osiąga się przy wysokim procencie rozpuszczalnika organicznego, czasami przy niskim pH.
Podsumowując, wybór warunków elucji zależy przede wszystkim od powinowactwa między przeciwciałami i analitami. Zależy on również od natury analitu, ze względu na stosunek pomiędzy oddziaływaniami elektronowymi i hydrofobowymi zaangażowanymi w interakcje antygen-przeciwciało. Wreszcie, zależy to od strategii immobilizacji przeciwciał; wiązanie niekowalencyjne zapobiega stosowaniu dużych ilości rozpuszczalników organicznych.
.