Invasion Assay

Materiały:

Płytka do hodowli tkanek Falcon z 24 dołkami

Wkładka do hodowli komórkowych Falcon:8μm pore size, 24 well format

Cat# 3097

Matrigel (Diluted inDMEM/F12)

5% Glutaraldehyde in 1XPBS

0.5% błękit toluidyny w 2% Na2CO3

Przygotowanie komory Boydena:

1. Używając sterylnych kleszczyków wyjąć wkładki ze ścianami komórkowymi z ich opakowań i włożyć je do studzienek płytki z 24 studzienkami.
2. Przemyć wkładki 2 razy 300μl DMEM/F12

(uważać, aby nie ukłuć w membranę)

1. Dodać 20μl rozcieńczonego w stosunku 1:6 Matrigelu (2-3 mg/ml białka) do środka każdego dołka z wkładkami. Delikatnie rozprowadź Matrigel na całej powierzchni membrany.
2. Umieścić pokryte wkładki w inkubatorze, aby umożliwić zestalenie się Matrigelu przez 20-30 minut.

Przygotowanie komórek do badania:

1. Obrób i hoduj komórki zgodnie z warunkami eksperymentalnymi. Pożądane może być zsynchronizowanie komórek do tego samego stanu wzrostu.
2. Trypsynowanie i liczenie komórek
3. Usunąć trypsynę i ponownie zawiesić w świeżej pożywce.
4. Płytka 1X105 komórek w 200 μl zdefiniowanej pożywki do górnej komory.
5. Dodać 300 μl pożywki do dolnej komory.
6. Hodować przez około 20 godzin.

Czas ten jest różny dla różnych linii komórkowych i może wynosić do 48 godzin dla mniej inwazyjnych komórek.

Utrwalanie i barwienie:

1. Po hodowli, odessać pożywkę z dolnej komory
2. Dodać 0,5 ml 5% Glutaraldehydu w 1XPBS, inkubować przez 10 min. @ R.T
3. Odessać roztwór Glutaraldehydu, przemyć każdą studzienkę 3 razy D.W
4. Dodać 0,5 ml 0,5% roztworu barwiącego błękit toluidyny do dolnej komory, inkubować przez 10-20 min @ R.T
5. Odessać roztwór z górnej i dolnej komory, przemyć dolną komorę 3 razy roztworem D.W
6. Dokładnie wytrzeć wewnętrzną powierzchnię górnej komory przy użyciu bawełnianego wacika. (Uważaj, aby nie naciskać zbyt mocno, membrana może wyskoczyć.) Zaatakowane komórki będą w centrum dolnej części membrany.
7. Licz liczbę komórek przy użyciu obiektywu q 20X mikroskopu. Policz co najmniej 3 pola na błonę.