Abstract
Background. Amyloidoza jest pozakomórkowym wytrącaniem się eozynofilowego, hialinowego materiału własnego pochodzenia o szczególnych cechach barwienia i fibrylarnej ultrastrukturze. Amyloidoza plamista jest ograniczona do skóry, a w jej patogenezie zaproponowano kilka czynników. Wykrycie DNA wirusa Epsteina-Barr (EBV) w tej zmianie sugeruje, że wirus ten może odgrywać rolę w patogenezie tej choroby. Cel pracy. W 30 próbkach skóry z rozpoznaniem amyloidozy plamistej i 31 próbkach zdrowej skóry w marginesie usuniętych znamion melanocytowych metodą PCR wykryto DNA EBV. Wyniki. U pacjentów pozytywnych dla genu beta-globiny w PCR, gen BLLF1 wirusa EBV był pozytywny u 23 pacjentów (8 pacjentów w grupie przypadkowej i 15 pacjentów w grupie kontrolnej). Nie stwierdzono istotnej różnicy w obecności DNA EBV pomiędzy grupą chorych z amyloidozą plamki (3,8%) a grupą kontrolną (23,8%) (). Wnioski. Wyniki tego badania wykazały, że EBV nie bierze udziału w patogenezie amyloidozy plamki.
1. Wprowadzenie
Amyloidoza to pozakomórkowe odkładanie się grupy włóknistych białek. Istnieje wiele podejść do klasyfikacji amyloidozy, ale najprostszą metodą jest podział na typy ogólnoustrojowe i narządowo swoiste (zlokalizowane). W obu typach amyloidozy zaangażowaną tkanką jest skóra. Skórna zlokalizowana amyloidoza występuje w dwóch typach: (i) keratynową, która może być pierwotna lub wtórna, oraz (ii) guzkową. Typ wtórny jest wtórny do innych zmian skórnych, takich jak nowotwory skóry, choroby zapalne skóry i fototerapia. Wyróżnia się dwa typy amyloidozy keratotycznej: plamistą i liszajowatą, przy czym ta druga występuje częściej. W amyloidozie keratotycznej złogi keratyny pochodzące z keratynocytu podstawnego są głównie CK5 dodatnie. Typ keratotyczny jest najczęściej obserwowany w Azji Południowo-Wschodniej, Ameryce Południowej i Chinach. Występuje zarówno w postaci rodzinnej (10%), jak i sporadycznej, przy czym ta ostatnia jest częstsza u kobiet. Najczęstszymi miejscami występowania zmian są górna część pleców (okolica międzyłopatkowa) i kończyny (podudzia i ramiona), chociaż opisywano je również na twarzy, tułowiu i udach. Zmiany w amyloidozie plamkowej zwykle występują w postaci hiperpigmentowanych plam o nieokreślonych brzegach, składających się z szarobrązowych plam, często o siateczkowatym lub falistym wyglądzie (ryc. 1). Częstym objawem poprzedzającym wystąpienie amyloidozy jest świąd .
Patogeneza tego zaburzenia nie jest w pełni wyjaśniona, z wyjątkiem faktu, że odkładająca się keratyna pochodzi z keratynocytów. Zaproponowano dwa mechanizmy patogenetyczne, w tym teorię apoptotyczną (fibrylarną) i teorię sekrecyjną. Zgodnie z teorią apoptotyczną, po degeneracji uszkodzonych keratynocytów w warstwie podstawnej następuje przekształcenie tych ciał koloidalnych przez histiocyty i fibroblasty skóry właściwej w amyloid w skórze właściwej brodawkowatej (ryc. 2). Zgodnie z teorią sekrecyjną, złogi amyloidu pochodzące ze zwyrodniałych keratynocytów podstawnych rozprzestrzeniają się do skóry właściwej brodawkowatej przez uszkodzoną lamina densa . W patogenezie amyloidozy plamki żółtej bierze udział kilka czynników etiologicznych: czynniki rasowe, predyspozycje genetyczne, czynniki środowiskowe, płeć (żeńska), hormony żeńskie, ekspozycja na światło słoneczne, tarcie (długotrwałe ścieranie), atopia, autoimmunizacja (na podstawie asocjacji z toczniem rumieniowatym układowym, zapaleniem skórno-mięśniowym, twardziną układową, sarkoidozą i nefropatią IgA) oraz zakażenie wirusem EBV. EBV, którego obecność odnotowano w naskórku w amyloidozie plamistej, prawdopodobnie działa jako czynnik przyczyniający się do degeneracji keratynocytów .
Rola EBV w etiopatogenezie pierwotnej skórnej amyloidozy została oceniona tylko w dwóch wcześniejszych badaniach, w tym w pojedynczym opisie przypadku i serii przypadków 27 pacjentów z Chin. Biorąc pod uwagę brak badań dotyczących związku między EBV a amyloidozą plamki żółtej, postanowiliśmy przeprowadzić badania w tym zakresie w Iranie. Być może środki przeciwwirusowe mogą być stosowane w przyszłości w leczeniu tej choroby w przypadku skojarzenia z EBV.
2. Materiały i metody
W tym badaniu kliniczno-kontrolnym, 38 próbek amyloidozy plamki żółtej i 38 próbek zdrowej skóry wokół wyciętych znamion melanocytowych od dobranych pod względem wieku i płci pacjentów bez amyloidozy plamki żółtej zostało włączonych do badania klinicznego na podstawie nielosowego obiektywnie ukierunkowanego próbkowania. Kryteria włączenia obejmowały bloki parafinowe z wystarczającą ilością tkanki w archiwach Wydziału Patologii Szpitala Imam Reza w Mashhad, u których rozpoznano amyloidozę plamki żółtej na podstawie raportu patologicznego i obrazu klinicznego. Kryteria wykluczenia obejmowały bloki z niedoskonałymi danymi w rejestrach i niewystarczającymi próbkami do PCR.
W grupie przypadków, odkładanie amyloidu zostało potwierdzone przez mikroskopię optyczną i barwienie czerwienią Kongo. W następnym kroku z każdego z bloków w grupie przypadków i grupie kontrolnej przygotowano sześć 5 μm wycinków w sterylnych warunkach przy użyciu sterylnego ostrza i umieszczono je w sterylnych probówkach Eppendorfa.
2.1. Deparafinizacja
Do deparafinacji parafinowanych tkanek użyto ksylolu/etanolu. Jeden mL ksylolu dodawano do mikrotubek zawierających fragmenty tkanek i inkubowano w temperaturze pokojowej przez pół godziny przy ciągłym wstrząsaniu. W kolejnym etapie mikrotubki wirowano w 13 000 obr/min przez 10 minut, a supernatant odrzucano. Te dwa etapy powtarzano jeden raz. Do osadu dodawano pięćset μL 100% etanolu i po kilkukrotnym odwróceniu mikrotubek wirowano przez 10 m w 13 000 obr/min, a następnie usuwano supernatant. Czynność tę powtarzano ponownie. Wreszcie, powstały osad umieszczano w temperaturze pokojowej w celu całkowitego odparowania etanolu, ale nie osadu.
2.2. Ekstrakcja DNA
Ekstrakcja DNA została przeprowadzona przy użyciu zestawu BIO BASIC INC (Kanada) o numerze partii 8401-140116. Do ekstrakcji użyto buforu lizującego T. W kolejnym etapie do każdej mikrotubki dodano 100 μL buforu ekstrakcyjnego i 10 μL proteinazy K, a następnie wymieszano. Do mieszaniny dodawano próbki tkanek i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie próbki inkubowano w 95°C przez 3 minuty w celu inaktywacji proteinazy K. Do probówek dodano 100 μL Universal Buffer NST i odwrócono 10 razy. Otrzymaną mieszaninę wykorzystywano do PCR.
2.3. PCR
W niniejszym badaniu do wykrycia obecności genomu EBV w amyloidozie plamki żółtej zastosowano metodę PCR. Po ekstrakcji DNA z bloczków parafinowych, jakość DNA wyekstrahowanego z tkanek zatopionych w parafinie określono przy użyciu starterów genu beta-globiny. Zastosowane w niniejszej pracy startery GH20 i PC04 amplifikowały fragment o długości 260 bp. Sekwencja tych starterów była następująca: GH20: 5′ GAA GAG CCA AGG ACA GGT AC 3′. PC04: 5′ CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC 3′.Próbki wytwarzające fragment 260 bp przy użyciu pożądanych primerów uznano za sprzyjające amplifikacji genu BLLF1 wirusa EBV.
Obecność sekwencji EBV w wyekstrahowanych próbkach DNA badano przy użyciu zestawu Cinna Gen o numerze partii 935701 (Sina Clon, Iran). Zestaw ten został zaprojektowany do określania jakości EBV DNA w zakażonych próbkach przy użyciu PCR. Zoptymalizowany 1x PCR jako mieszanina rekombinowanej polimerazy Taq DNA, buforu PCR, MgCl2, dNTPs i primerów był odczynnikiem używanym do mieszania. Wysoce specyficzny i powtarzalny region genu BLLF1 kodujący gp 350/220 jest amplifikowany przez startery. Są one w stanie wykryć co najmniej 30 kopii EBV. Obecność fragmentów 239 bp lub 256 bp wskazuje na pozytywny wynik testu.
Analizę danych przeprowadzono przy użyciu oprogramowania SPSS 11.5. Do opisu danych wykorzystano wykresy i tabele statystyczne, a do porównania EBV w próbkach osób zdrowych i chorych – testy Chi-kwadrat i niezależne. We wszystkich testach przyjęto poziom istotności 0,05.
3. Wyniki
Pięćdziesiąt procent pacjentów stanowili mężczyźni (19/38), a 50% kobiety (19/38). Trzech pacjentów było w grupie wiekowej poniżej 20 lat (7,9%), 5 pacjentów 20-30 lat (13,2%), 10 pacjentów 30-40 lat (26,3%), 13 pacjentów 40-50 lat (34,2%), 4 pacjentów 50-60 lat (10,5%) i 3 pacjentów powyżej 60 lat (7,9%). Minimalny i maksymalny wiek wynosił odpowiednio 19 i 76 lat. Stwierdzono 27 przypadków zakażenia w obrębie tułowia (71,1%) i 11 przypadków w obrębie kończyn (28,9%). Grupa badana i kontrolna były dopasowane pod względem wieku () i płci ().
PCR przeprowadzono dla genu beta-globiny w 76 próbkach (38 przypadków i 38 kontroli), który był pozytywny w 61 próbkach (30 próbek w grupie przypadków i 31 w grupie kontrolnej) i był negatywny w 15 próbkach (8 próbek w przypadku i 7 w grupie kontrolnej) (Figura 3).
W 61 próbkach pozytywnych dla genu beta-globiny w PCR, gen BLLF1 z EBV był pozytywny w 23 przypadkach (8 przypadków w grupie badanej i 15 przypadków w grupie kontrolnej) i był negatywny w 38 przypadkach (22 przypadki w grupie badanej i 16 przypadków w grupie kontrolnej) (Rysunek 4).
PCR genu BLLF1 wirusa EBV był 26,7% pozytywny w grupie badanej i 48,4% pozytywny w grupie kontrolnej. Wyniki testu chi kwadrat nie wykazały korelacji pomiędzy EBV a amyloidozą plamki () (tab. 1).
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
4. Dyskusja
Amyloidoza jest znana jako pozakomórkowe odkładanie się eozynofilowego materiału hialinowego własnego pochodzenia o specyficznych cechach barwienia i ultrastrukturalnych. Schorzenie to może występować na tle chorób ogólnoustrojowych lub być ograniczone do skóry. Amyloidoza plamista jest ograniczona do skóry. EBV może stymulować wydzielanie materiału amyloidowego przez keratynocyty lub być bodźcem do degeneracji keratynocytów i przekształcania zdegenerowanych filamentów keratynocytów w amyloid. Ostatnie badania wskazują na rolę komórek nabłonkowych w ciągłym namnażaniu się wirusa EBV. Receptory na powierzchni komórek EBV znalezione w mniej zróżnicowanym nabłonku płaskim sugerują bezpośrednie zakażenie keratynocytów naskórka. Do zakażenia może dojść w warstwach zarodkowych, jednak replikacja wirusa jest możliwa tylko poprzez dojrzewanie i różnicowanie się komórek. Ekspresja cytokeratyny w ludzkich keratynocytach ulega zmianie in vitro po zakażeniu EBV, co prowadzi do ich przekształcenia w fibroblasty. Fibroblasty mogą fagocytować agregaty keratyny i przekształcać je w amyloid .
Drago i wsp. wykazali tę korelację we Włoszech w 1996 roku. Ich pacjentem była 30-letnia kobieta z dziesięcioletnią historią swędzących brązowych grudek i plam na klatce piersiowej i plecach z objawami zespołu przewlekłego zmęczenia. Wykazali oni obecność genomu EBV w zmianach naskórkowych przy użyciu techniki hybrydyzacji in situ. Genom EBV był widoczny głównie w komórkach naskórka podstawnego, jak również w komórkach warstwy wyższej, zwłaszcza w cytoplazmie. U pacjentki stwierdzono również dodatnie wyniki badań serologicznych w kierunku EBV. Terapia przeciwwirusowa acyklowirem i interferonem alfa przyniosła poprawę w zakresie zmian skórnych i objawów ogólnych u pacjentki. Kolejne badanie zostało przeprowadzone przez Chang i wsp. na tkance skórnej 27 pacjentów z rozpoznaniem liszaja i amyloidozy plamistej na Tajwanie w 1997 roku. Metodą hybrydyzacji in situ wykazano obecność EBV DNA w zmianach u 11 pacjentów (40,7%), podczas gdy w grupie kontrolnej (obejmującej trzech pacjentów z wtórną skórną amyloidozą, dwóch pacjentów z pierwotną układową amyloidozą i czterech pacjentów z przewlekłym liszajcem prostym) nie stwierdzono obecności EBV DNA .
Według tego badania nie stwierdzono korelacji pomiędzy EBV a amyloidozą plamistą (). EBV DNA był obecny w 8 pacjentach z amyloidozą plamki żółtej i 15 kontrolach w naszym badaniu. Różnica w częstości wykrywania EBV DNA pomiędzy pacjentami z amyloidozą plamki żółtej a grupą kontrolną w tym badaniu i w wymienionych badaniach może być spowodowana następującymi przyczynami:(1)Brak związku pomiędzy amyloidozą plamki żółtej a infekcją EBV: istnieje kilka badań przedstawiających niewystarczające dowody na definitywną korelację pomiędzy EBV a amyloidozą plamki żółtej, więc na podstawie wyników naszego badania można było wysunąć taki wniosek.(2)Metodologia (PCR versus hybrydyzacja in situ): użyliśmy czułej metody wykrywania EBV DNA z pozytywną i negatywną kontrolą. W oparciu o poprzednie badania, PCR jest tak samo czuły jak hybrydyzacja in situ. Jednakże, ponieważ nie używaliśmy hybrydyzacji in situ, nie mogliśmy zlokalizować dokładnej komórki zakażonej EBV w naszych kontrolach, które mogą być krążącymi komórkami B skóry zamiast keratynocytów. Ponieważ używaliśmy pozytywnych i negatywnych kontroli w naszym zestawie PCR dla EBV, pozytywne przypadki w naszej grupie kontrolnej nie mogły być fałszywie pozytywne.(3)Kontrole: kontrolami w naszym badaniu była zdrowa skóra wokół znamion melanocytowych, ale kontrolami w badaniu Chang były inne zaburzenia skórne.(4)Typ skórnej amyloidozy: w naszym badaniu wszyscy pacjenci mieli amyloidozę plamistą, ale w obu poprzednich badaniach większość pacjentów miała amyloidozę liszajowatą.
5. Wnioski
Według wyników tego badania, nie było korelacji pomiędzy EBV a amyloidozą plamki. Zalecamy użycie świeżej tkanki lub szybko zamrożonego bioptatu, jak również jednoczesne badanie serologiczne pacjentów na obecność przeciwciał anty-EBV w celu uzyskania dokładniejszych wyników badań porównawczych DNA EBV w amyloidozie plamki. PCR in situ może być również stosowany do lokalizacji komórek EBV DNA pozytywnych w próbkach. Inne geny mogą być użyte do wykrycia EBV w tkance, ponieważ niektóre próbki EBV są zmutowane dla genu BLLF1 użytego w tym badaniu .
Zalecamy również przeprowadzenie badań porównawczych nad wykrywaniem EBV zarówno w zaangażowanej, jak i niezaangażowanej skórze pacjentów z amyloidozą plamki żółtej.
Konflikt interesów
Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.
Podziękowania
Autorzy wyrażają głęboką wdzięczność dla zastępcy ds. badań MUMS za wsparcie finansowe i zatwierdzenie propozycji badawczej (nr 911283) związanej z pracą dyplomową Narges Nazeri. Wsparcie finansowe przez zastępcę ds. badań naukowych Uniwersytetu Medycznego w Mashhad jest potwierdzone.
.