Klonowanie molekularne to zestaw technik stosowanych do wprowadzania rekombinowanego DNA ze źródła prokariotycznego lub eukariotycznego do replikującego nośnika, takiego jak plazmidy lub wektory wirusowe. Klonowanie odnosi się do tworzenia licznych kopii interesującego nas fragmentu DNA, takiego jak gen. W tym filmie poznasz różne etapy klonowania molekularnego, dowiesz się, jak skonfigurować procedurę i poznasz różne zastosowania tej techniki.
Przed rozpoczęciem klonowania wymagane są co najmniej dwie ważne cząsteczki DNA. Po pierwsze, i najważniejsze, potrzebny jest fragment DNA, który zamierzamy sklonować, inaczej zwany insertem. Może on pochodzić z prokariota, eukariota, wymarłego organizmu lub może być stworzony sztucznie w laboratorium. Dzięki zastosowaniu klonowania molekularnego możemy dowiedzieć się więcej o funkcji danego genu.
Po drugie, potrzebny jest wektor. Wektor to plazmidowy DNA używany jako narzędzie w biologii molekularnej do tworzenia większej liczby kopii lub produkcji białka z określonego genu. Plazmidy są przykładem wektora i są kolistym, pozachromosomalnym DNA, który jest replikowany przez bakterie.
Plazmid ma zazwyczaj miejsce wielokrotnego klonowania lub MCS, ten obszar zawiera miejsca rozpoznawania dla różnych endonukleaz restrykcyjnych, znanych również jako enzymy restrykcyjne. Różne inserty mogą być włączone do plazmidu za pomocą techniki zwanej ligacją. Wektor plazmidowy zawiera również początek replikacji, co pozwala na jego replikację w bakteriach. Dodatkowo, plazmid posiada gen antybiotyku. Jeśli bakterie zaimplementują plazmid, przetrwają w podłożu zawierającym antybiotyk. Pozwala to na selekcję bakterii, które zostały pomyślnie przekształcone.
Wkładka i wektor są klonowane do organizmu komórkowego gospodarza, najczęściej używanym w klonowaniu molekularnym jest E. coli. E. coli rośnie szybko, jest szeroko dostępna i ma wiele różnych wektorów klonowania produkowanych komercyjnie. Eukarionty, takie jak drożdże, mogą być również używane jako organizmy żywicielskie dla wektorów.
Pierwszym krokiem ogólnej procedury klonowania molekularnego jest uzyskanie pożądanego insertu, który może pochodzić z DNA lub mRNA z dowolnego typu komórki. Następnie wybiera się optymalny wektor i jego organizm gospodarza w oparciu o typ wstawki i to, co ostatecznie zostanie z nią zrobione. Reakcja łańcuchowa polimerazy lub metoda oparta na PCR jest często używana do replikacji insertu.
Następnie za pomocą serii reakcji enzymatycznych, insert i trawienie są łączone i wprowadzane do organizmu gospodarza w celu masowej replikacji. Powielone wektory są oczyszczane z bakterii, a po trawieniu restrykcyjnym analizowane na żelu. Oczyszczone w żelu fragmenty są później wysyłane do sekwencjonowania w celu sprawdzenia, czy wstawka jest pożądanym fragmentem DNA.
Przyjrzyjmy się nieco dokładniej, jak przeprowadza się klonowanie molekularne. Przed rozpoczęciem należy zaplanować strategię klonowania, zanim podejmie się jakiekolwiek próby klonowania na stanowisku badawczym. Na przykład, każdy dany wektor plazmidowy, dostarczy nam skończoną liczbę miejsc restrykcyjnych do wprowadzenia insertu poprzez miejsce wielokrotnego klonowania. Będziesz musiał wybrać miejsca restrykcyjne, które nie znajdują się w twoim insercie, aby go nie rozszczepić. Może się zdarzyć, że będziemy zmuszeni do połączenia fragmentu o tępym końcu z fragmentem, który ma overhang. Jeśli tak, to użycie fragmentu klenow do ligacji z tępym końcem może być jedyną opcją, aby umieścić insert w pożądanym wektorze. Zrozumienie różnych narzędzi klonowania molekularnego do dyspozycji, jak również wymyślenie starannej strategii przed rozpoczęciem klonowania może być ogromnym oszczędzaczem czasu.
Źródło DNA do klonowania molekularnego może być izolowane z prawie każdego rodzaju komórki lub próbki tkanki poprzez proste techniki ekstrakcji. Po wyizolowaniu, do amplifikacji wstawki można użyć PCR.
Po amplifikacji wstawki zarówno ona, jak i wektor są trawione przez enzymy restrykcyjne, znane również jako endonukleazy restrykcyjne.
Po strawieniu, wstawka i wektor mogą być umieszczone na żelu i oczyszczone w procesie zwanym oczyszczaniem żelowym. W odniesieniu do wektora, ten krok pomoże oczyścić zlinearyzowany plazmid z plazmidu niepociętego, który ma tendencję do pojawiania się jako rozmaz o wysokiej masie cząsteczkowej na żelu.
Po oczyszczeniu strawionego żelu, insert jest ligowany lub przyłączany do plazmidu, przez enzym zwany ligazą DNA.
Generalnie rzecz biorąc, zawsze dobrym pomysłem jest ustawienie ligacji tak, aby stosunek insertu do wektora wynosił 3 do 1, co zapewnia, że tylko niewielka ilość wektora ulegnie samo-ligacji. Po ustawieniu ligacji na lodzie, jest ona inkubowana w temperaturze 14-25˚C od 1 godziny do nocy.
Następnie przeprowadzana jest transformacja w celu wprowadzenia wektora plazmidowego do gospodarza, który będzie go replikował.
Po transformacji bakterie są posiewane na płytki agarowe z antybiotykiem i inkubowane przez noc w temperaturze 37°C. Ponieważ plazmid zawiera gen oporności na antybiotyki, udana transformacja spowoduje powstanie kolonii bakteryjnych podczas hodowli na płytkach agarowych w obecności antybiotyków. Pojedyncze kolonie można następnie pobrać z transformowanej płytki, umieścić w płynnych podłożach wzrostowych w ponumerowanych probówkach i umieścić w wytrząsanym inkubatorze w celu ekspansji. Niewielką objętość płynnej hodowli dodaje się do ponumerowanej płytki agarowej, podczas gdy resztę hodowli przenosi się do oczyszczania plazmidów. Schemat numeracji oznaczający tożsamość kolonii bakteryjnych, z których ostatecznie zostaną oczyszczone plazmidy, jest utrzymywany przez cały proces oczyszczania plazmidów.
Próbka oczyszczonego plazmidu jest następnie cięta enzymami restrykcyjnymi. Trawienie jest następnie ładowane i prowadzone na żelu w celu sprawdzenia obecności wstawki, co pozwoli zweryfikować, że kolonia bakteryjna została transformowana plazmidem zawierającym wstawkę, a nie plazmidem samoligaturującym. Bakterie zweryfikowane jako transformowane plazmidem zawierającym insercję są ekspandowane do dalszego oczyszczania plazmidu. Sekwencjonowanie jest stosowane jako końcowy etap weryfikacji w celu potwierdzenia, że gen zainteresowania został sklonowany.
Klonowanie molekularne może być stosowane w niemal nieograniczonej liczbie aplikacji. Na przykład, gdy szablon mRNA jest odwrotnie transkrybowany w celu utworzenia cDNA, lub komplementarnego DNA, przez enzym zwany odwrotną transkryptazą, a następnie PCR jest stosowany do amplifikacji cDNA, klonowanie molekularne może być stosowane do tworzenia biblioteki cDNA – biblioteki wszystkich genów wyrażanych przez dany typ komórki.
Klonowanie molekularne może być również wykorzystane do pobrania serii genów lub grupy genów z jednego szczepu bakteryjnego, zreorganizowania ich do plazmidów, które są przekształcane w innym szczepie, więc cała ścieżka biosyntezy może być odtworzona w celu wyprodukowania złożonej cząsteczki.
Poprzez klonowanie molekularne, biblioteka mutacji może być generowana przez wyrażanie docelowego plazmidu w specjalnym szczepie bakteryjnym, który używa polimerazy podatnej na błędy, gdy jest hodowany w określonych temperaturach. Mutacje mogą być scharakteryzowane przez sekwencjonowanie. Bakterie przekształcone ze zmutowanymi genami mogą być następnie testowane z różnymi lekami lub chemikaliami, aby zobaczyć, które kolonie bakterii rozwinęły się w kierunku oporności na leki.
Dzięki klonowaniu molekularnemu, geny reporterowe mogą być włączone do plazmidów DNA, powszechnym genem reporterowym jest białko zielonej fluorescencji lub GFP, które emituje zieloną fluorescencję po wystawieniu na działanie światła UV. Gen reporterowy może być również wprowadzony do alfawirusa, aby pokazać infekcję u komarów i zdolność przenoszenia się w komórkach.
Właśnie obejrzałeś film JoVEs o klonowaniu molekularnym. Powinieneś teraz zrozumieć, jak działa klonowanie molekularne i jak ta technika może być używana w biologii molekularnej. Jak zawsze, dzięki za oglądanie!