Introduction

Jako biały, bezbarwny i krystaliczny proszek, sodiumazide (NaN3) jest klasyfikowany jako substancja wysoce toksyczna. Jego działanie toksyczne jest podobne do działania cyjanku i działa szkodliwie na układ nerwowy, sercowo-naczyniowy, oczy i skórę. Ten toksyczny składnik staje się aktywny szybko po spożyciu, a jego główne skutki występują kilka godzin po doustnym przyjęciu, w zależności od spożytej ilości (1,2). Narażenie na NaN3 może w ciągu kilku minut wywołać szereg objawów, w tym nudności, wymioty, ból głowy, niepokój, zawroty głowy, osłabienie, szybki oddech i przyspieszone bicie serca (3). Wysokie ilości tego toksycznego pierwiastka natychmiast wywołują drgawki, utratę przytomności, niskie tętno i ciśnienie krwi oraz niewydolność oddechową, co ostatecznie prowadzi do śmierci (3). Wśród wykazanych mechanizmów działania NaN3, najistotniejszym jest inhibicja kompleksu cytochromowego oksydazy i łańcucha oddechowego (4). Poprzednie badania ujawniły, żeNaN3, inhibitor kompleksu IV (Cox IV), może indukowaćapoptozę w pierwotnych neuronach korowych, która jest zależna od kaspazy-3 i związana z uwalnianiem cytochromu c (5).

W biosyntezie mitochondrialnej, promotor łańcucha oddechowego Cox IV może być aktywowany przez jądrowe czynniki oddechowe (Nrf)-1/2. Równocześnie, Nrf może być regulowany przez regulację aktywności genów kodujących mitochondrialny czynnik transkrypcji A (Tfam) do pośrednio regulować poziomy ekspresji genów respiratorychain. Nrf-1/2, Tfam, koaktywator receptora γ aktywowanego proliferatorami peroksysomów 1-α (Pgc-1α) i inne koaktywatory tworzą kaskadę sygnałową Pgc-1α, która odgrywa centralną rolę w sieci regulacyjnej regulującej transkrypcyjną kontrolę biogenezy mitochondriów i funkcji oddechowych. W tej kaskadzie sygnałowej Pgc-1α najpierw aktywuje Nrf-1/2, zamiast bezpośrednio wiązać się z mitochondrialnym DNA, a Nrf-1/2 indukuje aktywację Tfam w połączeniu z promotorem Tfam i wyzwala transkrypcję i replikację mitochondrialnego DNA, prowadząc do zwiększenia poziomu ekspresji białek mitochondrialnych(6). Jednocześnie, Pgc-1α może być aktywowany przez CaN-, Ca2+/calmodulin-zależną proteinkinazę (CaMK)-, kinazę białkową aktywowaną mitogenem (MAPK)- i kinazę zależną od cyklin (7). W obecnym badaniu, komórki PC12 zostały wykorzystane do stworzenia modelu neuronu dopaminergicznego, a wpływ i mechanizm działania NaN3 na szlaki związane z Pgc-1α w komórkach PC12 zostały zbadane w celu określenia, czy NaN3 wywołuje toksyczność w hodowanych komórkach PC12 i mechanizmy leżące u podstaw tych efektów.

Materiały i metody

Materiały

Komórki PC12 pheochromocytoma szczura zostały zakupione z Banku Komórek Typu Kolekcji Kultury Chińskiej Akademii Nauk (Szanghaj, Chiny). Roztwór podstawowy NaN3 (Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy) został rozpuszczony w sterylnej soli fizjologicznej do uzyskania roztworu podstawowego o stężeniu 1 M, który następnie został rozcieńczony do pożądanych stężeń przed przeprowadzeniem doświadczenia. Jednoetapowy zestaw do oznaczania apoptozy TUNEL (C1090), zestaw do wykrywania apoptozy z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) Aneksyny V (C1063), zestaw do oznaczania zwiększonej ilości adenozyno-5′-trifosforanu (ATP) (S0027), JC-1 Mitochondrial Membrane Potential Assay kit (C2006)i Reactive Oxygen Species Assay kit (S0033) zostały dostarczone przezBeyotime Institute of Biotechnology (Haimen, Chiny).

Hodowla komórek i ocena żywotności

KomórkiPC12 utrzymywano w podłożu Dulbecco’s modifiedEagle’s medium (DMEM; Hyclone; GE Healthcare Life Sciences, Logan,Logan, UT, USA) uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS;Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, MA, USA) i 1% roztworem antybiotyków przeciwgrzybiczych składającym się z 10 000 U penicyliny i 10 000 U streptomycyny. Komórki były inkubowane w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2 i zawsze używane przy 70-80% konfluencji.

Żywotność komórek PC12 została określona przy użyciu zestawu do liczenia komórek (CCK-8; Dojindo Molecular Technologies, Inc.,Shanghai, China). Komórki były wysiewane na płytki 96-dołkowe w zagęszczeniu 1×105/dołek. Po 24 godzinach hodowli, komórki poddawano działaniu NaN3 (0-80 mM) i inkubowano przez 12, 24, 48 i 72 godziny w celu stworzenia modelu uszkodzenia komórek. Następnie do każdej studzienki dodawano 10 µl roztworuCCK-8 (Dojindo Molecular Technologies, Inc.) i inkubowano przez dodatkowe 2 h w warunkach standardowych (37°C i 5% CO2). Absorbancja przy długości fali 450 nm była określana za pomocą ELx808 Absorbance MicroplateReader (BioTek Instruments, Inc., Winoski, VT, USA). Żywotność komórek obliczano na podstawie średniej gęstości optycznej z 6 dołków. Eksperymenty przeprowadzono w trzech powtórzeniach. Odpowiednie stężenia NaN3 do użycia w kolejnych doświadczeniach zostały określone zgodnie z wynikami testów żywotności komórek.

Morfologia jądrowa komórekPC12 barwionych DAPI

KomórkiPC12 były wystawione na działanie 0, 10, 20 i 40 mMNaN3 przez 24 godziny. W celu odróżnienia programowanej śmierci komórek od nieapoptotycznej, jądra komórkowe barwiono 10µg/ml DAPI (C1005; Beyotime Institute of Biotechnology). Krótko mówiąc, komórki przemywano dwukrotnie PBS, a następnie utrwalano 4% paraformaldehydem w temperaturze pokojowej przez 30 min. Po trzech myciach, utrwalone komórki barwiono DAPI (1:5,000) przez 5 minut, a następnie przemywano PBS. Obrazy fluorescencyjne uzyskano za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego Leica DMI (powiększenie, ×400).

Pomiar szybkości apoptozy

Zestaw do wykrywania apoptozy Annexin V-FITC/PI (Beyotime Institute of Biotechnology) został użyty do określeniaapoptozy komórek zgodnie z instrukcjami producenta.Eksperymenty powtarzano w trzech egzemplarzach i wykonywano je w następujący sposób: Wskaźniki apoptotyczne kontrolnych komórek PC12 (0 mMNaN3) i komórek PC12 eksponowanych na 10, 20 i 40 mMNaN3 przez 24 h mierzono za pomocą cytometrii przepływowej (FC500;Beckman Coulter, Inc., Brea, CA, USA). Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu oprogramowania statystycznego SPSS v.13.0 (SPSS, Inc.,Chicago, IL, USA).

Pomiar mitochondrialnego potencjału błonowego (ΔΨm)

ΔΨm jest istotnym parametrem funkcji mitochondriów. Oceniano go za pomocą barwienia sondą fluorescencyjną JC-1. Eksperymenty powtarzano w trzech powtórzeniach, a przeprowadzano je w następujący sposób: Kontrolne komórki PC12 traktowano 0 mMNaN3; a eksperymentalne komórki PC12 eksponowano na 10, 20 i 40 mM NaN3 przez 24 h. Następnie, zgodnie z protokołem producenta (C2006; Mitochondrial Membrane PotentialAssay kit; Beyotime Institute of Biotechnology, Haimen, China), komórki inkubowano z podłożem zawierającym JC-1 (1X) w temperaturze 37°C przez 20 min, komórki przemywano trzykrotnie buforem płuczącym i zbierano świeżą pożywką bez surowicy. Równocześnie kontrolę pozytywną poddawano działaniu inhibitora – cyjano-3-chlorofenylohydrazonu karbonylu (CCCP) (10 µM) w temp. 37°C przez 20 min. Następnie, czerwona/zielona fluorescencja była oznaczana za pomocą FCM(FC500; Beckman Coulter, Inc.). Stosunek intensywności czerwonej fluorescencji do intensywności zielonej fluorescencji reprezentował poziom ΔΨm.

Pomiar produkcji reaktywnych form tlenu(ROS)

ROS w komórkach PC12 oceniano przy użyciu zestawu ReactiveOxygen Species Assay (S0033; Beyotime Institute ofBiotechnology, Haimen, China). Wewnątrzkomórkowe generowanie ROS oceniano za pomocą diacetatu 2′,7′-dichlorofluoresceiny (DCFH-DA), sondy fluorescencyjnej. Wewnątrzkomórkowe ROS utleniają DCFH-DA, dając związek fluorescencyjny 2′,7′-dichlorofluoresceinę (DCF), a intensywność fluorescencji DCF jest uważana za równoległą do ilości utworzonych ROS, zgodnie z instrukcjami zestawu do oznaczania ROS.Eksperymenty powtarzano w trzech powtórzeniach i przeprowadzono w następujący sposób: kontrola pozytywna była traktowana określonym stężeniem Rosup (50 mg/ml); kontrolne komórki PC12 były traktowane 0 mMNaN3; a eksperymentalne komórki PC12 były narażone na 10, 20 i 40 mM NaN3 przez 24 h. Ponadto komórki PC12 były traktowane DCFH-DA (10 mM) rozpuszczonym w DMEM bez surowicy (1:1000) przez 20 min w temperaturze 37 ° C, a następnie przepłukano trzykrotnie DMEM bez surowicy. Kontrola pozytywna była traktowana Rosupem, aby indukować produkcję ROS. Produkcja ROS została określona przez FCM (FC500; Beckman Coulter, Inc.). Średnie natężenie fluorescencji (MFI) reprezentowało poziomy ROS.

Pomiar komórkowej zawartości ATP w komórkach PC12

Doświadczenia powtórzono w trzech egzemplarzach i przeprowadzono w następujący sposób: Kontrolne komórki PC12 traktowano 0 mMNaN3; a eksperymentalne komórki PC12 eksponowano naNaN3 w różnych stężeniach (10, 20 i 40 mM) przez24 h.Następnie zawartość komórkowego ATP oznaczano przy użyciu zestawuFirefly Luciferase ATP Assay (Beyotime Institute ofBiotechnology) zgodnie z protokołem producenta.

Western blot analysis

KomórkiPC12 poddawano działaniu 0, 10, 20 i 40 mMNaN3 przez 24 h, lizowano w buforze do analizy radioimmunoprecypitacji (Beyotime Institute of Biotechnology) zawierającym inhibitor aproteazy i odwirowywano przy 13,362 × g przez 10 min w 4°C w celu zebrania supernatantów. Następnie oznaczano stężenie białek przy użyciu zestawu BCA (Pierce; Thermo FisherScientific, Inc.). Jednakowe ilości białek (90 µg) poddawano 10 i 12% SDS-PAGE, a następnie przenoszono na membrany z polifluorku winylidenu (0,45 µm) przy użyciu Semidry Electro-transfer Unit (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Po zablokowaniu 5% surowiczą albuminą bydlęcą w TBS zawierającym 0.1% Tween-20 (TBST)przez 2 h w temperaturze pokojowej, membrany inkubowano z przeciwciałami przeciw Pgc-1α (Abcam, Cambridge, MA, USA;1:500), Nrf-2 (Abcam; 1:500), Cox IV (Abcam; 1:1,000), Tfam (Abcam;1:1,000), procaspase-3 (Abcam; 1:500), Nrf-1 (Cell SignalingTechnology, Inc., Danvers, MA, USA, 1:500), pan-kalcyneuryna A (CaN;Cell Signaling Technology Inc.; 1:1,000), fosforylowana (p)-CaMKII(Cell Signaling Technology; 1:1,000), p-p38 MAPK (Cell SignalingTechnology, Inc.; 1:1,000), p-extracellular signal-regulated kinase(Erk)1/2 (Cell Signaling Technology, Inc.; 1:1,000), B-celllymphoma-2 (Bcl-2)-associated X protein (Bax; Santa CruzBiotechnology, Inc., Dallas, TX, USA; 1:200), Bcl-2 (Santa CruzBiotechnology, Inc.; 1:200) i cytochrom c (Santa CruzBiotechnology, Inc.; 1:200) w temperaturze 4°C przez noc. Następnie membrany przemywano TBST i inkubowano z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z peroksydazą końską(HRP) (królik; nr kat. A0208; 1:1,000; lub myszy; nr kat. A0216; 1;1,000; oba Beyotime Instituteof Biotechnology) przez 1 h w temperaturze pokojowej. Immunoreaktywne pasma wizualizowano za pomocą systemu wzmocnionej chemiluminescencji (ClinxScience Instruments Co., Ltd., Shanghai, Chiny) i analizowano ilościowo za pomocą Image J wersja l.32 J (National Institutes ofHealth, Bethesda, MD USA), a β-aktynę wybrano jako kontrolę obciążenia.

Analiza statystyczna

Wszystkie analizy statystyczne przeprowadzono za pomocą oprogramowania SPSSstatistical software v.13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). Dane wyrażono jako średnią ± odchylenie standardowe, błąd standardowy średniej. Istotność statystyczną różnic między grupami określono za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji, a następnie testu post-hoc Bonferroniego. P<0,05 uznano za wskazanie różnicy istotnej statystycznie. Każdy eksperyment powtarzano co najmniej trzykrotnie.

Wyniki

NaN3 hamuje wzrost komórek PC12

Wpływ ekspozycji na NaN3 na proliferację komórek PC12 oceniano za pomocą testu CCK-8. Komórki poddawano działaniu różnych stężeń (0-80 mM) NaN3 przez 12-72 h. Tabela I i Rys. 1A-D wskazują, że żywotność komórek była obniżana przez NaN3 w sposób zależny od stężenia. Prawie 100% komórek obumarło po ekspozycji na 80 mM NaN3 przez 72 h, co wskazuje, że NaN3 wyraźnie indukował śmierć komórek, a cytotoksyczność NaN3 była wykrywana w sposób zależny od dawki i czasu. Ekspozycja na NaN3 w stężeniu 20 mM przez 24 h spowodowała znaczną śmierć komórekPC12 (50%). Dlatego do kolejnych eksperymentów wykorzystano komórki hodowane przez 24 h.

Morfologia komórek

W barwieniu DAPI, zmiany morfologiczne komórek PC12 były obserwowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej po ekspozycji na różne stężenia NaN3. Fragmentacja jąder komórkowych narażonych na NaN3 przez 24 h była obserwowana, a kurczenie się jąder komórkowych i kondensacja chromatyny były nieznacznie zwiększane wraz ze stężeniem NaN3 w komórkach PC12 w porównaniu z kontrolą. W komórkach tych komórki apoptotyczne były mniejsze i jaśniejsze w porównaniu z komórkami prawidłowymi. Obserwowano również chromatynową kondensację i jądrową fragmentację, podczas gdy niebieskie jądra żywych komórek były zidentyfikowane w grupie kontrolnej.Dodatkowo, liczba komórek apoptotycznych i intensywność zielonej fluorescencji były zwiększone w komórkach narażonych na NaN3 (Fig. 2).

Określanie tempa apoptozy przez barwienie neksyną V-FITC

Komórki martwe lub późne komórki apoptotyczne, które utraciły integralność błony komórkowej mogą być barwione jodkiem propidium. Ze względu na utratę integralności błony komórkowej, aneksyna V-FITC może dostać się do cytoplazmy i połączyć się z fosfatydyloseryną wewnątrz błony komórkowej, wykazując zieloną fluorescencję w martwych komórkach.Fig. 3 pokazuje, że liczba komórek apoptotycznych wynosiła 5,03, 8,02, 43,77 i 78,67%(P<0,05) w komórkach PC12 po ekspozycji na NaN3 w różnych stężeniach (0, 10, 20 i 40 mM) odpowiednio przez 24 godziny. Wyniki te dodatkowo potwierdziły, że NaN3 indukował apoptozę komórek w sposób zależny od dawki.

Zmiany w potencjale membranowym mitochondriów (ΔΨm)

Mitochondria są ogólnie uważane za kluczowe organelle regulacyjne zaangażowane w żywotność komórek. Dlatego też, ΔΨm został użyty jako wskaźnik funkcji mitochondriów. Komórki PC12 barwiono JC-1, barwnikiem kationowym, który wykazuje zależną od potencjału akumulację w mitochondriach. Czerwona fluorescencja (agregaty J), reprezentująca aktywne mitochondria o stabilnym potencjale błonowym, była obserwowana w niewielkiej liczbie komórek poddanych działaniu wzrastającego stężenia NaN3. Natomiast zielona fluorescencja (J-monomer), reprezentująca apoptotyczne mitochondria z uszkodzonym ΔΨm, była obserwowana w pewnej liczbie komórek. Stosunek czerwonej i zielonej fluorescencji stopniowo zmniejszał się w grupie kontrolnej (ryc. 4).

Indukowane przez NaN3 nagromadzenie mitochondrialnych ROS

Powszechnie wiadomo, że mitochondria są głównym źródłem komórkowych ROS, a ROS odgrywają ważną rolę w aktywacji sygnalizacji apoptotycznej. Dlatego też rola ROS w indukowanej przez NaN3 śmierci komórek PC12 została dodatkowo zbadana. Rys. 5 wskazuje, że intensywność fluorescencji w komórkach kontrolnych i komórkach eksponowanych na NaN3 w różnych stężeniach (0, 10, 20 i 40 mM) przez 24 h wynosiła 3,65, 6,99, 18,63 i 39.35, odpowiednio, wskazując, że ekspozycja NaN3 znacznie zwiększyła produkcję mitochondrialnych ROS w porównaniu z grupą kontrolną (P<0,05). Wyniki te sugerowały, że NaN3-inducedapoptosis improved the production of intracellular ROS.

NaN3 downregulates themitochondrial energy production of cellular ATP

Aby ocenić zawartość ATP w komórkach PC12 narażonych naNaN3, względna jednostka luminescencji (RLU) została ilościowo określona przez luminometr. Fig. 6 wskazuje, że NaN3inhibited mitochondrial ATP production and gradually decreased thecellular ATP level (P<0.05).

Expression levels of Pgc-1α andapoptosis-associated proteins in PC12 cells

The Pgc-1α expression at the protein level wassignificantly decreased following NaN3 exposure comparedwith the control (P<0.05). Ponadto, Nrf-1, Tfam, p-Erk1/2, Nrf-2 i Cox IV są dobrze znane cele downstream dynamiki Pgc-1α w różnych typach komórek (8). W obecnym badaniu zidentyfikowano, że ekspozycja NaN3 znacząco hamowała dynamikę Pgc-1α w sposób zależny od dawki (P<0,01; Fig. 7A).

W dodatku, ekspozycja NaN3 zwiększyła poziom ekspresji Bax i cytochromu c, podczas gdy itd. zmniejszyła poziom ekspresji Bcl-2 i prokaspazy-3(P<0,05). Stosunek Bax/Bcl-2 był również znacznie zwiększony w porównaniu z grupą kontrolną (P<0,05; Fig. 7B).

Poziomy ekspresji białek innych ważnych członków, w tym CaN, CaMKII, p-CaMKII, p38 MAPK i p-p38 MAPK, zostały również ocenione. Wyniki wykazały, że NaN3 zwiększył ekspresję CaN i fosforylację CaMKII i p38 MAPK w porównaniu z grupą kontrolną, podczas gdy poziomy ekspresji całkowitej CaMKII i p38 MAPK nie uległy zmianie. Ponadto stosunki p-CaMKII/CaMKII i p-p38/p38 MAPK w grupie NaN3 były znacząco zwiększone w porównaniu z tymi w grupie kontrolnej (P<0,01; Fig. 7C).

Dyskusja

Aby określić, czy NaN3 hamował proliferację komórek PC12, liczba leczonych komórek w fazielogarytmicznej została porównana z liczbą nieleczonych komórek kontrolnych. Wzrost komórek został zahamowany o ~75% po 24 h ekspozycji na 20 mM NaN3. Dlatego też takie stężenie stosowano w kolejnych eksperymentach. Apoptoza obejmuje zmiany morfologii komórkowej, w tym pękanie błon, kurczenie się komórek, kondensację chromatyny, fragmentację jądra i fragmentację DNA(9). Aby dodatkowo przeanalizować morfologię jądrową apoptozy i tempo apoptozy, komórki poddano działaniu 0, 10, 20 i 40 mM NaN3 przez 24 h. Po leczeniu komórki barwiono DAPI i AnnexinV-FITC/PI, a następnie analizowano rozmieszczenie jąder. Wyniki potwierdziły, że ekspozycja na NaN3 indukowała apoptozę w komórkach PC12 w sposób zależny od stężenia.

Mitochondria są zaangażowane w liczne funkcje metaboliczne, w tym utrzymanie wewnątrzkomórkowego pH i produkcję ROS, które promują i regulują apoptozę komórek (10). Charakterystyczne cechy apoptozy komórek są poprzedzone zmianami mitochondrialnymi, w tym utratą ΔΨm, zmniejszeniem produkcji energii (ATP) i zwiększeniem przepuszczalności błony mitochondrialnej. Wcześniejsze badania sugerowały, że ROS powodują uszkodzenie mitochondrialnego łańcucha oddechowego i indukują utratę ΔΨm, które są czynnikami pośredniczącymi lub wzmacniającymi dysfunkcję neuronów w przebiegu neurodegeneracji, co w konsekwencji prowadzi do rozwoju chorób neurodegeneracyjnych (11,12).NaN3 jest znany z napędzania degeneracji i ekscytotoksyczności przez zwiększenie potencjału przepuszczalności błony mitochondrialnej poprzez peroksydację lipidów (13-15), a NaN3 wywiera swoje podstawowe działanie toksyczne poprzez hamowanie funkcji oksydazy cytochromowej w mitochondrialnym łańcuchu transportu elektronów i zapobieganie produkcji ATP (4). W niniejszej pracy zastosowano FCM do identyfikacji ΔΨm i produkcji ROS w komórkach PC12. Ponadto, badano syntezę ATP w mitochondriach po ekspozycji na różne stężenia NaN3. Zaburzenia błony plazmatycznej, wzrost mitochondrialnej produkcji ROS i spadek zawartości ATP w komórkach sugerowały, że ekspozycja na NaN3 indukowała apoptozę w komórkach PC12.

Mitochondrialna śmierć komórkowa może być aktywowana przez wiele bodźców, w tym program rozwojowy, uszkodzenia DNA, stres retikulum endoplazmatycznego, niedobór czynników wzrostu i składników odżywczych, infekcje wirusowe i stres oksydacyjny (16). Jako członek stale rosnącej rodziny jądrowych koregulatorów, Pgc-1α może aktywować duży zestaw genów i regulować poziom ekspresji genów zaangażowanych w metabolizm energetyczny w odpowiedzi na szlaki sygnalizacyjne, które pośredniczą w termogenezie, glukoneogenezie, przełączaniu typów włókien mięśniowych i biogeneziemitochondriów (17).Te koregulatory istnieją i funkcjonują w dużych multi-proteincomplexes, w których zamiast wiązać się z DNA, regulująNrf-1/2 i Tfam i modulują ich siłę transkrypcji przezpromowanie kolejnych biochemicznych interakcji wymaganych doindukcji lub represji transkrypcji genu (8). Ponadto Nrf-1/2 pośrednio kontroluje ekspresję genów kodowanych przez mitochondrialne DNA, indukując jądrowo kodowane Tfam A, B1 i B2 (odpowiednio Tfam,Tfb1m i Tfb2m), które są regulatorami transkrypcji i replikacji genomu mitochondrialnego (18). Wcześniejsze badania wykazały, że NaN3 jest inhibitorem kompleksu IV mitochondrialnego łańcucha oddechowego, który jest często zaburzony w pierwotnych zaburzeniach mitochondrialnych (19,20).W obecnym badaniu ekspresja kaskady sygnałowej Pgc-1α, w tym białek rodziny Pgc-1α (Pgc-1α, Nrf-1, Nrf-2 i Tfam) oraz Cox IV, została najpierw zbadana w komórkach PC12 w celu sprawdzenia, czy zdarzenia sygnalizacyjne były zaangażowane w indukowaną przez NaN3apoptozę. Wyniki sugerowały, że indukowana przez NaN3apoptoza była związana z poziomem ekspresji białek z rodziny Pgc-1α i Cox IV w mitochondrialnej ścieżce sygnalizacyjnej. Kiedy stężenia NaN3 zostały zwiększone, poziomy ekspresji tych białek zostały znacząco zmniejszone, wskazując, że mogą one być zaangażowane w aktywację i rozwój apoptozy.

Odwrotnie, kompleks IV może wywołać apoptozę w pierwotnych neuronach korowych, która jest zależna od kaspazy3 i związana z uwalnianiem cytochromu c (5). Wiadomo, że mitochondria są kluczowymi regulatorami apoptozy komórek. Białka z rodziny Bcl-2 są ważnymi inicjatorami mitochondrialnego szlaku apoptotycznego. W skład tej rodziny wchodzą białka proapoptotyczne Bax, Bcl-2 homologiczny antagonista/zabójca i Bcl-2-associated agonist of cell death oraz białka antyapoptotyczne Bcl-2 i Bcl-extra large (Bcl-xL). W zdrowych komórkach Bax jest nieaktywnym białkiem cytozolowym, ale podczas apoptozy jest przenoszony do mitochondriów. Wywiera on działanie proapoptotyczne poprzez tworzenie porów w zewnętrznej błonie mitochondrialnej, przez które cytochrom c jest uwalniany do cytoplazmy, co prowadzi do aktywacji kaspazy 3 (21). Antyapoptotyczne białka Bcl-2 i Bcl-xL tłumią funkcję Bax poprzez utrzymywanie integralności błony mitochondrialnej, co zapobiega uwalnianiu cytochromu c do cytoplazmy, prowadząc do aktywacji kaspazy 3 (22). W obecnym badaniu, NaN3 zwiększył poziomy pro-apoptotycznego Bax i cytochromu c i zmniejszył poziomy anty-apoptotycznego Bcl-2 iprocaspase-3, wskazując, że NaN3 zainicjowałmitochondrialną sygnalizację apoptozy w komórkach PC12.

W dodatku, poziomy ekspresji Pgc-1αco-aktywatorów są wysoce indukowalne na poziomie transkrypcji poprzez różnorodne ścieżki sygnalizacyjne. For example, theexpression of Pgc-1α is induced by exercise and cold exposure underthe control of stress signaling via cellular Ca2+ andcyclic adenosine 5′-monophosphate (cAMP) signaling (23). Na transkrypcję Pgc-1α może wpływać CaMK, kalcyneuryna, receptor β-adrenergiczny/cAMP oraz p38MAPK (24-26). Ponadto, p38 MAPK należąca do rodziny MAPK pełni kluczową funkcję w proliferacji, różnicowaniu, transformacji i apoptozie komórek, ponieważ aktywacja apoptozy może indukować Pgc-1α poprzez bezpośrednią fosforylację (27). W niniejszej pracy zbadano poziom ekspresji białek w szlakach sygnalizacji Ca2+ (pan-kalcyneuryna A i p-CaMKII/CaMKII) oraz szlaku p38 MAPK (p-p38MAPK/p38 MAPK i p-Erk1/2) w celu zbadania wpływu NaN3 na wewnątrzkomórkową homeostazę Ca2+ i p38 MAPK. Dane wykazały, że poziom białka pan-kalcyneuryny A, stosunek p-CaMKII/CaMKII i p-p38MAPK/p38 MAPK były zwiększone, a poziom p-Erk1/2 był zmniejszony w grupie poddanej działaniu NaN3, co sugeruje, że NaN3 wyzwalał apoptozę komórek PC12 w sposób zależny od dawki, a taka aktywacja była związana ze szlakami Ca2+ i p38 MAPK. Podsumowując, powyższe wyniki badań potwierdziły, że NaN3 może indukować apoptozę komórek PC12 poprzez aktywację szlaków Ca2+ i p38 MAPK. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, obecne badanie ujawniło po raz pierwszy, że NaN3 indukuje apoptozęmitochondriów w komórkach PC12 poprzez szlaki sygnałowe związane z Pgc-1α, w tym Ca2+/p-CaMKII i p38 MAPK.

Podsumowując, obecne badanie wykazało, żeNaN3 może indukować apoptozę komórek PC12. Aby wyjaśnić mechanizm toksycznego działania NaN3, zbadano poziom ekspresji szeregu białek pro-apoptotycznych (Bax i cytochrom c) i anty-apoptotycznych (Bcl-2, prokaspaza-3, p-p38 MAPK, p-CaMKII i Pgc-1α). Wyniki potwierdziły, że białka pro-apoptotyczne wywierały pro-apoptotyczny wpływ na komórki PC12 poprzez aktywację i fosforylację CaMKII i p38 MAPK, co stymulowało aktywację Pgc-1α i prokaspazy-3 w komórkach PC12. Uzyskane dane stanowią podstawę do dalszych badań nad mechanizmami działania NaN3 na poziomie molekularnym. Przyszłe badania mogą obejmować dodanie środków ochronnych, na przykład inhibitora podziału mitochondrialnego 1, pochodnej chinazolinonu, który jest nowo zidentyfikowanym inhibitorem podziału mitochondrialnego, przed traktowaniem NaN3, w celu zbadania neuroprotekcyjnych efektów środka ochronnego w osłabianiu indukowanej przez NaN3 apoptozy w komórkach PC12, oraz w celu dodatkowego wyjaśnienia mechanizmu leżącego u podstaw.

Podziękowania

Nie dotyczy.

Funding

The present study was financially supported by thegrants from the National Natural Science Foundation of China (grantno. 81571848) and the Priority Academic Program Development ofJiangsu Higher Education Institutions.

Dostępność danych i materiałów

Zestawy danych używane lub analizowane podczas obecnego badania są dostępne od autora na uzasadnione żądanie.

Wkład autorów

YZ i SZ wymyślili i zaprojektowali badanie. YZ, JH,HX, TG i YW zdobyli dane. YZ, JH i HX przeanalizowali i zinterpretowali dane oraz sporządzili manuskrypt. Wszyscy autorzy dokonali krytycznej korekty manuskryptu oraz przeczytali i zatwierdzili jego ostateczną wersję.

Zatwierdzenie etyczne i zgoda na udział w badaniu

Nie dotyczy.

Zgoda pacjenta na publikację

Nie dotyczy.

Interesy konkurencyjne

Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów.

Glosariusz

Skróty

Skróty:

.

. activated protein kinase

NaN3	azydek sodu
Cox IV	kompleks. IV
Tfam	mitochondrialny czynnik transkrypcyjnyA
Nrf-.1/2	jądrowy czynnik oddechowy-1/2
CaN	pan-.kalcyneuryna A
Pgc-1α	koaktywator receptora γ proliferatora proliferatorów peroksysomów 1α
PC12	rat pheochromocytoma
ΔΨm	potencjał błony mitochondrialnej
CCCP	cyjanek karbonylu3-chlorofenylohydrazon
ROS	reaktywne formy tlenu

	Herbold M, Schmitt G, Aderjan R i PedalI: Śmiertelne zatrucie azydkiem sodu w szpitalu: A preventable accident. Arch Kriminol. 196:143-148. 1995.(In German). PubMed/NCBI
	Marquet P, Clément S, Lotfi H, DreyfussMF, Debord J, Dumont D and Lachâtre G: Analytical findings in asuicide involving sodium azide. J Anal Toxicol. 20:134-138. 1996.Zobacz artykuł : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Chang S and Lamm SH: Human health effectsof sodium azide exposure: A literature review and analysis. Int JToxicol. 22:175-186. 2003. Zobacz artykuł : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Leary SC, Hills BC, Lyons CN, Carison CG,Michaud D, Kraft CS, Ko K, Glerum DM i Moyes CD: Chronictreatment with azide in situ leads to an irreversible loss ofcytochrome c oxidase activity via holoenzyme dissociation. J BiolChem. 277:11321-11328. 2002. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Grammatopoulos TN, Morris K, Bachar C,Moore S, Andres R and Weyhenmeyer JA: AngiotensinII attenuateschemical hypoxia-induced caspase-3 activation in primary corticalneuronal cultures. Brain Res Bull. 62:297-303. 2004. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Scarpulla RC: Metabolic control ofmitochondrial biogenesis through the PGC-1 family regulatorynetwork. Biochim Biophys Acta 1813. 1269-1278. 2011.
	Qian G, Guo JB and Li L: The role ofPgc-1α and mitochondrial regulation in cardiovascular disease.Chinese Pharmacol Bull. 29:1-5. 2013.
	Jones AW, Yao Z, Vicencio JM,Karkucinska-Wieckowska A and Szabadkai G: PGC-1 family coactivatorsand cell fate: Roles in cancer, neurodegeneration, cardiovasculardisease and retrograde mitochondria-nucleus signaling.Mitochondrion. 12:86-99. 2012. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Kerr JFR, Winterford CM and Harmon BV:Apoptosis: Its significance in cancer and cancer therapy. Cancer.73:2013-2026. 1994. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Chan DC: Mitochondria: Dynamiczne organellein choroby, starzenia się i rozwoju. Cell. 125:1241-1252. 2006.View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Islam MT: Oxidative stress andmitochondrial dysfunctionlinked neurodegenerative disorders. NeurolRes. 39:73-82. 2017. Wyświetl artykuł : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Chaturvedi RK and Flint BM: Mitochondrialdiseases of the brain. Free Radic Biol Med. 63:1-29. 2013.Zobacz artykuł : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Van Laar VS, Roy N, Liu A, Raiprohat S,Arnold B, Dukes AA, Holbein CD and Berman SB: Glutamateexcitotoxicity in neurons triggers mitochondrial and endoplasmicreticulum accumulation of Parkin and in the presence of N-acetylcysteine, mitophagy. Neurobiol Dis. 74:180-193. 2015. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Liu L, Peritore C, Ginsberg J, Shinh J,Arun S and Donmez G: Protective role of SIRT5 against motor deficitand dopaminergic degeneration in MPTP-induced mice model ofParkinson’s disease. Behav Brain Res. 281:215-221. 2015. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Palomo GM and Manfredi G: Exploring newpathways of neurodegeneration in ALS: The role of mitochondria quality control. Brain Res 1607. 36-46. 2015. View Article : Google Scholar
	Youle RJ and Strasser A: The BCL-2 proteinfamily: Opposing activities that mediate cell death. Nat Rev MolCell Biol. 9:47-59. 2008. ViewArticle : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Vercauteren K, Pasko RA, Gleyzer N, MarinoVM and Scarpulla RC: PGC-1-related coactivator: Immediate earlyexpression and characterization of a CREB/NRF-1 binding domainassociated with cytochrome c promoter occupancy and respiratorygrowth. Mol Cell Biol. 26:7409-7419. 2006. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Scarpulla RC: Transcriptional paradigms inmammalian mitochondrial biogenesis and function. Physiol Rev.88:611-638. 2008. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Betts J, Lightowlers RN and Turnbull DM:Neuropathological aspects of mitochondrial DNA disease. NeurochemRes. 29:505-511. 2004. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Tanji K, Kunimatsu T, Vu TH and Bonilla E:Neuropathological features of mitochondrial disorders. Semin CellDev Biol. 12:429-439. 2001. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Aluvila S, Mandal T, Hustedt E, Fajer P,Choe JY and Oh KJ: Organization of the mitochondrial apoptotic BAKpore: Oligomeryzacja homodimerów BAK. J Biol Chem.289:2537-2551. 2014. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Yang E, Zha J, Jockel J, Boise LH,Thompson CB and Korsmeyer SJ: Bad, a heterodimeric partner forBcl-XL and Bcl-2, displaces Bax and promotes cell death. Cell.80:285-291. 1995. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Hock MB and Kralli A: Transcriptionalcontrol of mitochondrial biogenesis and function. Annu Rev Physiol.71:177-203. 2009. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Handschin C, Rhee J, Lin J, Tarr PT andSpieglman BM: An autoregulatory loop controls peroxisomeproliferator-activated receptor gamma coactivator 1alpha expressionin muscle. Proc Natl Acad Sci USA. 100:7111-7116. 2003. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Schaeffer PJ, Wende AR, Magee CJ, NeilsonJR, Leone TC, Chen F and Kelly DP: Calcineurin andcalcium/calmodulin-dependent protein kinase activate distinctmetabolic gene regulatory programs in cardiac muscle. J Biol Chem.279:593-603. 2004. View Article : Google Scholar
	Rohas LM, St-Pierre J, Uldry M, Jäger S,Handschin S and Spiegelman BM: A fundamental system of cellularenergy homeostasis regulated by PGC-1 alpha. Proc Natl Acad SciUSA. 104:7933-7938. 2007. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI
	Puigserver P, Rhee J, Lin J, Wu Z, YoonJC, Zhang CY, Krauss S, Mootha VK, Lowell BB and Spiegelman BM:Cytokine stimulation of energy expenditure through p38 MAP kinaseactivation of PPARgamma coactivator-1. Mol Cell. 8:971-982. 2001.View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI

.