Pomimo produkcji znaczących poziomów fosforanu w naszych testach, nie byliśmy jednak w stanie wykryć ani zużycia O2 (za pomocą czułych pomiarów elektrody O2), ani produkcji H2O2 (za pomocą czułego testu peroksydazy chrzanowej). Ponadto, utlenianie Pt było obserwowane z podobną szybkością w warunkach ściśle beztlenowych w testach, które zawierały tylko BAP, Pt i wodę. Dane te silnie sugerują, że protony pochodzące z wody są brakującym akceptorem elektronów w reakcji utleniania Pt i że innym produktem reakcji jest prawdopodobnie molekularne H2, zgodnie z równaniem 2. Na poparcie tej hipotezy, wykryliśmy zależną od Pt produkcję H2 zarówno in vitro jak i in vivo. Testy in vitro przeprowadzono w warunkach tlenowych w szczelnie zamkniętych fiolkach przy użyciu wysoko oczyszczonego BAP. Po inkubacji, przestrzeń powietrzna była analizowana na obecność H2, a część wodna była oznaczana na obecność fosforanów. Jak pokazano na Fig. 2B , stechiometryczne ilości fosforanu i H2 były wytwarzane z Pt w obecności BAP, podczas gdy ani fosforan ani H2 nie były wytwarzane w reakcjach kontrolnych zawierających albo BAP albo sam Pt.

Pomiar H2 in vivo jest skomplikowany przez fakt, że E. coli ma wiele hydrogenaz, które mogą zarówno produkować, jak i zużywać H2. Aby obejść ten problem, skonstruowaliśmy mutanta ΔhypABCDE, który nie może produkować żadnych aktywnych hydrogenaz z powodu niezdolności do dojrzewania białek prekursorowych (32). Mutant hyp, hodowany tlenowo w szczelnych probówkach, również produkował w przybliżeniu stechiometryczne ilości H2 w hodowlach hodowanych z ograniczającymi wzrost poziomami Pt, podczas gdy nie wykryto H2 w hodowlach hodowanych z ograniczającymi poziomami fosforanu lub estru fosforanowego fosfoseryny (Fig. 2B ).

Utlenianie Pt nie jest wspólną cechą wszystkich fosfataz alkalicznych. Wydajne utlenianie Pt wydaje się być unikalną cechą fosfatazy alkalicznej E. coli. Ani Bacillus subtilis, o którym wiadomo, że wytwarza wiele wysoce aktywnych fosfataz (33), ani P. stutzeri, o którym wiadomo, że wytwarza fosfatazę różną od BAP (w szczepach, którym brakuje systemu dehydrogenazy Pt) (A. K. White, S. Neuhaus, M. M. Wilson, i W. W. M., dane niepublikowane), nie mogą wykorzystywać Pt jako jedynego źródła P (Rys. 3A ), chociaż oba organizmy rosną na podłożach z fosfoseryną jako jedynym źródłem P (dane nie pokazane). Tak więc fosfatazy produkowane przez te organizmy nie są zdolne do utleniania Pt z szybkością wystarczającą do podtrzymania wzrostu. Badaliśmy również komercyjne preparaty fosfatazy jelitowej cieląt (CIP) i fosfatazy alkalicznej krewetek (SAP) pod kątem ich zdolności do wytwarzania fosforanu z Pt (Rys. 3B ). Chociaż niewielkie ilości fosforanu były wytwarzane przez fosfatazy eukariotyczne po inkubacji przez noc, tylko E. coli BAP była w stanie katalizować reakcję ze znaczną szybkością. Odkrycie to jest szczególnie zaskakujące, ponieważ enzymy eukariotyczne są w rzeczywistości znacznie lepszymi fosfatazami, o aktywności specyficznej do 40 razy wyższej niż BAP (27). Wszystkie te enzymy wykazują znaczną homologię (25-35% identyczności) z BAP E. coli; co więcej, większość reszt w miejscu aktywnym, w tym Ser-102 (która tworzy kowalencyjny pośredni fosfo-enzym podczas reakcji fosfatazy), jest konserwowana (27).

Wydaje się prawdopodobne, że utlenianie Pt jest katalizowane przez BAP w mechanizmie podobnym do tego używanego do hydrolizy estrów fosforanowych (Rys. 4A ). Odpowiednio, Pt może być hydrolizowany przez BAP z anionem wodorkowym jako formalną grupą opuszczającą. Na poparcie tej idei, mutant phoA z resztą Ser-102 w miejscu aktywnym zmienioną na alaninę nie jest w stanie wykorzystać Pt jako jedynego źródła P, wskazując, że ten aminokwas jest wymagany do hydrolizy estrów fosforanowych (27) i do utleniania Pt (Rys. 4B ). Chociaż bezpośrednie przeniesienie wodorku z substratu do wodnego protonu jest biochemicznie bezprecedensowe, reakcja ta jest termodynamicznie uzasadniona, biorąc pod uwagę silny potencjał redukujący pary fosforan-Pt (E o′ = -0,650 V). Tak więc, reakcja wytwarzania H jest dość korzystna: ΔG o′ = -46.3 kJ/mol (obliczone z potencjałów redoks w ref. 34). Jeśli model hydrolityczny utleniania Pt okaże się poprawny, będzie to bardzo nietypowa reakcja enzymatyczna. Badania wykazały, że BAP jest również zdolny do hydrolizy fosfodiestrów (35), fosfoamidów (36), estrów siarczanowych (37) i tiofosforanów (38). Jednakże reakcje te zachodzą z szybkością znacznie wolniejszą niż reakcja hydrolizy Pt, pomimo tego, że angażują znacznie lepsze grupy opuszczające. Ponadto, nie są to reakcje redoks. Analogiczna reakcja polegająca na hydrolizie kwasów alkilofosfonowych nie jest katalizowana przez BAP, co wykazano zarówno biochemicznie (39), jak i poprzez niezdolność szczepów Δphn do wykorzystywania tych związków jako jedynych źródeł P (13).

Dehydrogenaza Pt (PtxD) był jedynym in vitro-characterized enzymu wykazano do katalizowania utleniania Pt (11). Chociaż szczegóły reakcji BAP nie zostały jeszcze wyjaśnione, mechanizmy chemiczne obu enzymów są wyraźnie odmienne. Podczas gdy PtxD wymaga NAD jako akceptora elektronów dla reakcji redoks, reakcja katalizowana przez BAP nie wymaga egzogennych akceptorów elektronów, ale wykorzystuje dużą termodynamiczną siłę napędową reakcji do wytworzenia wysoce zredukowanego produktu (H2) z wody w zasadniczo nieodwracalnej reakcji (obliczone K eq = 1,1 × 108). Wszystkie inne znane reakcje wytwarzania H2 przebiegają znacznie bliżej równowagi chemicznej i są zazwyczaj odwracalne. Co więcej, wszystkie inne znane hydrogenazy zawierają w swoich miejscach aktywnych albo Fe, albo Ni, albo oba te pierwiastki (40). Obserwacja ta obejmuje tak zwaną „bezmetalową” dehydrogenazę metylenotetrahydrometanopterynową tworzącą H2 z metanogennych archaidów, o której obecnie wiadomo, że również zawiera Fe (41). W przeciwieństwie do tego, BAP nie zawiera metali aktywnych redoks, chociaż zarówno Zn jak i Mg są wymagane do aktywności hydrolitycznej (27). Traktowanie BAP chelatorami hamuje utlenianie Pt, sugerując, że metale odgrywają rolę w reakcji Pt (dane nie pokazane).

Wreszcie, dane in vivo przedstawione tutaj sugerują, że reakcja utleniania Pt jest biologicznie istotna. Obserwacja, że wiele bakterii posiada enzymy dedykowane do utleniania Pt dowodzi, że cecha ta jest pod silną presją selekcyjną w populacjach drobnoustrojów (4, 5, 9, 42). Mając ten fakt na uwadze, interesujący jest fakt, że chociaż enzymy eukariotyczne są znacznie lepszymi fosfatazami, to nie są one zdolne do utleniania Pt. Obserwacja ta nasuwa przypuszczenie, że E. coli BAP mogła ewoluować nie po to, by być najbardziej wydajną fosfatazą, ale raczej po to, by być fosfatazą posiadającą zdolność hydrolizy Pt. Ten pomysł jest zgodny z ciekawą obserwacją, że E. coli BAP ulega bardzo wysokiej ekspresji (do 6% całkowitego białka komórki) w warunkach głodu fosforanowego (28). Tradycyjnym wyjaśnieniem tego zjawiska jest to, że jakiś nieznany substrat BAP musi być słabo hydrolizowany i dlatego wymaga ogromnych ilości enzymu, aby utrzymać konkurencyjne tempo wzrostu. Jednakże, ponieważ istnieje niewielka różnica w zmierzonych szybkościach hydrolizy dla szerokiej gamy substratów estrów fosforanowych (39, 43), wydaje się mało prawdopodobne, że ten słaby substrat może być estrem fosforanowym. W przeciwieństwie do tego, szybkość hydrolizy Pt jest znacznie niższa niż szybkość hydrolizy estrów fosforanowych, co sugeruje, że Pt może być substratem, który odpowiada za ekstremalny poziom ekspresji phoA obserwowany w E. coli z niedoborem fosforanów.

Jasne jest, że wiele szczegółów reakcji BAP z Pt pozostaje do wyjaśnienia. Dalsze badania tej unikalnej reakcji może przyczynić się nie tylko do naszego zrozumienia P redoks chemii i fosforyl-transferu reakcji, ale także do naszej wiedzy na temat przenoszenia wodorków, reakcji wytwarzania H2 i roli zredukowanych związków P w przyrodzie.

.