Badania naukowe

W naszych badaniach przeanalizowaliśmy jedną roślinę uprawną w UE, Pisum sativum (groch siewny). Groch jest podatny na wiele różnych wirusów, w tym wirus mozaiki encji grochu, wirus wczesnego brązowienia grochu oraz szereg wirusów z grupy Potato virus Y (Potyviridae). W tej ostatniej grupie ważnymi patogenami są: wirus żółtej mozaiki fasoli, wirus mozaiki fasoli, wirus mozaiki grochu i wirus mozaiki nasion grochu (PSbMV). W szczególności badaliśmy PSbMV, na który podatne są wszystkie komercyjne odmiany grochu. Podatność tę potęguje fakt, że wirus ten jest nie tylko przenoszony z rośliny na roślinę przez wektor mszycę, ale jest również przenoszony pionowo z pokolenia na pokolenie w nasionach. Ta właściwość doprowadziła do poważnego skażenia kolekcji zarodków grochu i stanowi bardzo skuteczny sposób wczesnego i powszechnego zakażania upraw wkrótce po kiełkowaniu nasion. Jeśli weźmiemy pod uwagę, że skuteczność przenoszenia nasion wynosząca zaledwie 0,1% skutkowałaby 10 000 infekcji po wysianiu nasion w ilości 107/hektar, to znaczenie przenoszenia nasion staje się oczywiste. Obecnie problemowi temu przeciwdziała się poprzez skuteczne badanie próbek nasion po zbiorze poprzez immunodetekcję białka płaszcza wirusa oraz odrzucanie skażonych partii nasion. Jako alternatywę, i ponieważ transmisja nasion w różnych odmianach grochu waha się od 0 do 100%, zbadaliśmy, czy odporność na transmisję nasion może być wyhodowana w ulepszonych liniach grochu. W krzyżówkach testowych i krzyżówkach wstecznych pomiędzy liniami nie wykazującymi przenoszenia lub wykazującymi 60-80% przenoszenia, odporność zachowywała się jak cecha dominująca, chociaż w pokoleniach F2 i BC2 nie segregowała jako cecha mendlowska. Ilościowy charakter fenotypu sugerował, że przenoszenie nasion byłoby trudne do uwzględnienia jako cecha odporności w konwencjonalnym programie hodowlanym.

Naturalna odporność na PSbMV została zidentyfikowana w dostępach grochu z Afryki Północnej i Azji, chociaż, jak dotąd, te recesywne geny nie zostały wprowadzone do linii komercyjnych. Analiza genetyczna wykazała, że geny te są zgrupowane z innymi genami recesywnymi o różnej specyficzności wobec wirusa poty w dwóch miejscach genomu grochu. Geny sbm-1, sbm-3 i sbm-4, nadające odporność na patotypy PSbMV, odpowiednio PI, L-l i P4, znajdują się na chromosomie 6, podczas gdy sbm-2, również nadający odporność na patotyp L-l, znajduje się na chromosomie 2. Chociaż taka organizacja sugeruje lokalną konwersję i translokację genów pomiędzy chromosomami 2 i 6, inne dowody sugerują, że te dwa skupiska genów mogą mieć odrębne pochodzenie i funkcję. Wykorzystując rekombinowane wirusy hybrydowe wytworzone pomiędzy różnymi patotypami, determinant awirulencji wirusa został określony jako białko związane z genomem wirusa (VPg) dla sbm-1 . Analiza strukturalna i funkcjonalna genu sbm-1 jest tematem projektu EC-Biotechnology # BI04-CT97-2356 (www.dias.kvl.dk/eupsbmv) z udziałem grup badawczych i przemysłu z Danii, Finlandii, Hiszpanii i Wielkiej Brytanii.

Charakteryzacja genu sbm-1 zapewni szczególne korzyści intelektualne i praktyczne. Ponieważ około 20% wszystkich genów odporności na wirusy i około 40% genów nadających odporność na potyvirusy jest recesywnych, zrozumienie jak działa sbm-1 i co kontroluje specyficzność sąsiadujących genów sbm- i innych genów odporności na potyvirusy będzie ważne dla szerokiego zakresu chorób. Jednakże projekt sbm- wiąże się również z wyzwaniami technicznymi, między innymi z koniecznością poradzenia sobie z wielkością i redundancją genomu grochu. Genom grochu ma około 5 x 109 par zasad na haploidalny genom, czyli jest około 50 razy większy niż genom Arabidopsis thaliana. Klonowanie genów w grochu w oparciu o mapy nie zostało osiągnięte, a duże biblioteki insertów nie są jeszcze dostępne. Jednakże, w sbm-1 istnieje potencjał do zidentyfikowania nowej klasy genów odporności. Geny odporności sklonowane do tej pory z innych gatunków dzielą się na dwie klasy. Dominujące geny oporności, które działają przeciwko określonym wirusom, grzybom i bakteriom, należą zasadniczo do klasy „NBS-LRR” i pośredniczą w nadwrażliwej odporności na infekcje. Jedyny gen recesywny, który udało się sklonować (mlo), pośredniczy w odporności na mączniaka prawdziwego jęczmienia i jest związany z lokalizacją patogenu w martwych komórkach. Funkcjonalnie, Mlo działa jako negatywny regulator konstytutywnej odporności. W przeciwieństwie do niego, sbm-1 jest specyficzny dla rasy (lub patotypu) i nie jest związany ze śmiercią komórek. Na podstawie tych porównań, kilka funkcjonalnych mechanizmów dla sbm-1 wydaje się być możliwych. Po pierwsze, możemy postrzegać Sbm-1 jako dominujący czynnik podatności, wymagany do wspomagania replikacji wirusa. Pasowałoby to do prawdopodobnego udziału VPg w replikacji wirusowego RNA i obserwacji, że protoplasty z roślin odpornych nie wykazują wykrywalnej replikacji wirusa. Po drugie, podobnie jak Mlo, sbm-1 może działać jako negatywny regulator oporności, chociaż różnice w specyficzności w stosunku do mlo sytuowałyby sbm-1 w odrębnej klasie genów oporności. Po trzecie, sbm-1 może być dominującym, ale zależnym od dawki słabym allelem oporności. Preferujemy pierwszą opcję jako najbardziej bezpośrednią i prostą interpretację.

W naszym komponencie w projekcie EC-Biotechnology zdecydowaliśmy się na wykorzystanie metod genetycznych do identyfikacji produktu genu odporności sbm-1. Po zidentyfikowaniu odpowiednich linii grochu (para linii BC4 niosących homozygotyczne allele odporności i podatności) zastosowano strategię cDNA-AFLP w celu identyfikacji genów ekspresyjnych pochodzących z regionu introgresowanego. Do tej pory zidentyfikowano dziesięć polimorficznych cDNA. Są one obecnie mapowane przy użyciu rekombinowanych rodzin wsobnych w celu potwierdzenia ich pochodzenia genomowego. Naszą alternatywną strategią jest „łowienie” produktów genu sbm-1 przy użyciu drożdżowego systemu hybrydowego z PSbMV VPg jako białkiem przynętowym. Dwa silnie kandydujące cDNA i osiem innych cDNA kodujących białka interakcyjne zostały zidentyfikowane z biblioteki cDNA grochu wykonanej z podatnej linii grochu. Te cDNA są również sekwencjonowane i mapowane.

Jako część poprzedniego projektu EC-AIR (# CT94-1171) z udziałem partnerów akademickich i przemysłowych w Danii, Francji i Wielkiej Brytanii, zbadaliśmy również potencjał rozwoju PDR do PSbMV w transgenicznym grochu. Ponieważ w innych systemach gen replikazy wirusowej był powszechnie używany do zapewnienia PDR poprzez uruchomienie procesu posttranskrypcyjnego wyciszania genów (PTGS), wykorzystaliśmy cystron replikazy PSbMV (NIb) do transgenicznej ekspresji w grochu. Spośród 35 linii grochu, transformowanych przy użyciu Agrobacterium tumefaciens T- DNA niosącego konstrukt promotora 35S -Nib – terminatora 35S oraz gen bar jako marker selekcyjny dla transformowanej tkanki w obecności herbicydu Bialophos, trzy linie okazały się odporne na PSbMV. Dwie z tych linii posiadały bezpośrednie powtórzenie 3′ końca genu Nib (NIbIb), ponieważ istniały dowody, że złożone układy transgenów mają większy potencjał do inicjowania PTGS. Wszystkie te linie wykazywały typ PDR określany jako „regeneracja”, gdzie inokulacja prowokacyjna powoduje początkową infekcję, ale rośliny szybko wracają do zdrowia i nie wykazują więcej objawów lub akumulacji wirusa. Zregenerowane tkanki są następnie odporne na kolejne zakażenia homologicznymi lub blisko spokrewnionymi izolatami wirusa. Aby ocenić znaczenie tego zjawiska w warunkach polowych, gdzie rośliny mogą być narażone na kontakt z populacją spokrewnionych wirusów, oceniono zdolność różnych izolatów PSbMV do wywoływania PTGS i bycia obiektem indukowanego PTGS. Wykazano, że wirusy o około 89% lub więcej identyczności w cystronie NIb mogą indukować odporność, chociaż wymagania specyficzności dla drugiego zakażonego wirusa, który może być postrzegany jako cel, mogą być wyższe. Dla odniesienia, dwa najbardziej rozbieżne sekwencjonowane izolaty PSbMV różnią się o 89% w regionie Nib. To rozróżnienie w wymaganiach specyficzności dla wyzwalania i ukierunkowania w PTGS będzie ważnym czynnikiem przy stosowaniu tej technologii w uprawach komercyjnych. Stosunkowo szeroka odporność na izolaty PSbMV w transgenicznym grochu Nib kontrastuje z ekstremalną specyficznością patotypu obserwowaną dla naturalnych genów odporności sbm, gdzie tylko jedna lub kilka zmian w determinancie awirulencji wirusa wystarczy, aby zmienić izolat PSbMV z awirulentnego na wirulentny.

Pomimo krótkiego okresu początkowego zakażenia, transgeniczne rośliny grochu wykazywały dobry wzrost i osadzanie nasion po inokulacji prowokacyjnej, dając plony w warunkach szklarniowych równoważne tym obserwowanym dla niezakażonych linii transgenicznych lub nietransgenicznych. Uważamy, że z zastrzeżeniem umów licencyjnych obejmujących wykorzystanie genu pręta do selekcji transformowanych roślin, rośliny te mogłyby być użytecznym dodatkiem do panelu genów odporności na patogeny, które mają być wykorzystane w rozwoju nowych ulepszonych linii grochu.

Transgeniczne rośliny grochu reprezentują pierwsze rośliny strączkowe wykazujące PDR przeciwko potyvirusom i jedne z pierwszych eksperymentalnych przykładów w Leguminosae roślin wykazujących PTGS. Dlatego cenne było ustalenie, że zasady rządzące PTGS i odpornością w tym systemie są zgodne z zasadami charakteryzującymi bardziej powszechnie stosowane rośliny doświadczalne (np. Nicotiana spp.). Zgodnie z oczekiwaniami dla PTGS, indukowana odporność na wirusa była związana z degradacją RNA transgenu i RNA PSbMV. Wykazaliśmy również, że PTGS był mediowany w tych roślinach przez systemowy sygnał generowany podczas początkowej fazy infekcji wirusem, i że ten sygnał miał potencjał do pośredniczenia w rozprzestrzenianiu PTGS poprzez indukowanie metylacji w transkrybowanym regionie transgenu NIb .

Podsumowując, uznaliśmy, że przemysł rolniczy skorzystałby z posiadania stabilnej i skutecznej odporności na PSbMV w grochu. Najmniej kontrowersyjną drogą do osiągnięcia tego celu byłoby włączenie naturalnie występujących odporności (na przenoszenie nasion lub na replikację wirusa) przy użyciu konwencjonalnych strategii hodowlanych. Nasze stosunkowo słabe zrozumienie złożoności genetycznej przenoszenia PSbMV przez nasiona oznacza, że jest mało prawdopodobne, aby było to użyteczne w krótkim okresie czasu. Geny sbm- są bardziej obiecujące, chociaż brak ściśle powiązanych markerów genetycznych i recesywny charakter odporności stwarzają pewne trudności. Alternatywnie, wykazaliśmy potencjał tworzenia odporności poprzez zastosowanie technologii transgenicznej, chociaż konieczne będzie zajęcie się kwestiami bezpieczeństwa biologicznego i akceptacji społecznej. Oprócz tych rozważań dotyczących zastosowań, badania generowały i nadal generują materiały i wiedzę, które będą miały wpływ na to, jak pokrewne podejścia mogą być stosowane w innych roślinach uprawnych. W szczególności, ważne będzie zrozumienie mechanizmów działania nowej klasy genów odporności na wirusy.