Dyskusja

Niniejsze badanie zidentyfikowało kilka odrębnych cech bocznych ECs i SMCs , które mogą leżeć u podstaw lub przyczyniać się do unikalnych cech collaterals nakreślonych we Wstępie. Znaleźliśmy , że pomimo niskiego i oscylacyjnego ścinającego stresu obecnego w collaterals przy linii podstawowej w nieobecności przeszkody, ich ECs są wyrównane z osią naczynia do tego samego stopnia obecnego w distal-most arterioles i aorta zstępująca- naczynia z ortograde laminarnym przepływem wysokiej prędkości. Komórki śródbłonka zarówno kolaterali, jak i tętniczek mają rzęski pierwotne, przy czym kolaterale mają ich mniej. Komórki mięśni gładkich kolaterali są ciągłe, w przeciwieństwie do komórek DMA. Kolaterale mają wyższy poziom ekspresji genów związanych zarówno ze szlakami pro- i przeciwzapalnymi, jak i pro- i antyproliferacyjnymi, w porównaniu z DMA. Za tendencją do wyższej proliferacji komórek w komórkach muru kolateralnego przemawia obserwacja, że kolaterale zaczynają nabierać krętości wkrótce po ich uformowaniu w zarodku, która zwiększa się do wieku średniego (16 miesięcy, 49 ekwiwalentów lat ludzkich). Powyższe ustalenia dostarczają wglądu w strukturalne i molekularne specjalizacje, które mogą leżeć u podstaw unikalnych cech i funkcji naczyń pobocznych.

Konwergencja przepływu krwi w collaterals na linii podstawowej nakłada niskie i „zakłócone” siły przepływu/naprężenia ścinającego na ich komórki ścienne, tj. albo brak przepływu albo bardzo niski przepływ, który oscyluje to-and-fro (~1-10 razy na minutę) i uśrednia zero . Powoduje to zwiększenie naprężeń w ścianie zgodnie z zależnością Bernoulliego. Gdy występuje w innym miejscu w krążeniu tętniczym, np. w bifurkacjach, wewnętrznym łuku aorty lub poniżej blaszek miażdżycowych, niskie i zaburzone naprężenia ścinające sprzyjają nie wyrównanej, brukowanej morfologii EC, która jest związana ze zwiększonym stresem oksydacyjnym, zapaleniem, markerami starzenia się i niską aktywnością eNOS/NO (tj. dysfunkcją śródbłonka). Zaskakująco jednak stwierdziliśmy, że boczne ECs mają takie samo ułożenie (i wymiary komórek) jak ECs w DMAs i aorcie zstępującej. Nie zbadaliśmy, jak ten przeciwzapalny fenotyp strukturalny jest określony. Jest możliwe, że jedna lub więcej z innych unikalnych cech, które zidentyfikowaliśmy, jest w to zaangażowana (patrz poniżej). Z drugiej strony, dane na rycinie 2 dla przepływu i naprężenia ścinającego zostały uzyskane u zwierząt znieczulonych. Podczas zachowania w stanie czuwania, kolaterale mogą mieć okresy utrzymującego się przepływu w jednym lub drugim kierunku, wywołane zmianami w regionalnej aktywności metabolicznej w obszarze zaopatrywanym przez drzewa tętnicze, które łączą. Nie wiadomo, czy kolaterale przyczyniają się w ten sposób do fizjologicznej metabolicznej regulacji przepływu krwi i dostarczania tlenu, tj. sprzężenia nerwowo-naczyniowego w mózgu i czynnościowej hiperemii w innych miejscach. Jednakże, takie okresy utrzymującego się jednokierunkowego przepływu mogłyby promować obserwowaną przez nas orientację EC. Niezależnie od przyczyny leżącej u podstaw, spekulujemy, że wyrównany fenotyp ECs kolateralnych jest częścią (lub markerem) grupy mechanizmów ochronnych, które sprzyjają utrzymaniu kolaterali i łagodzą ich rarefakcję (Figura 9).

Według naszej wiedzy, jest to pierwszy raport pokazujący, że ECs wyściełające kolaterale i tętniczki mają pierwotne rzęski. Są one znacznie liczniejsze niż opisywane wcześniej dla naczyń przewodzących od zdrowych osób (tj. Nieobecne lub obecne na mniej niż 1% ECs): 18% kolaterali ECs ma PrC w porównaniu z 28% dla DMAs. Pierwotne rzęski na ECs zostały opisane w 1984 roku przez Hausta w aorcie królików i ludzi z miażdżycą. Późniejsze doniesienia opisywały ECs z rzęskami w naczyniach włosowatych szyszynki 20-tygodniowego płodu ludzkiego, w rozwijającym się sercu i płatkach zastawki aortalnej, i tamże], w otoczeniu miażdżycy, ektopowo w tętnicy szyjnej wspólnej myszy ApoE-/-, oraz u zdrowych osób w rozwidleniach tętnic przewodowych i wewnętrznej krzywiźnie łuku aorty; dla kontrastu rzęski są nieobecne lub prawie nieobecne w regionach tętnic, gdzie naprężenie ścinające jest laminarne. Większość innych typów komórek wykazuje ekspresję PrC podczas rozwoju, w określonych warunkach hodowli komórkowej i u dorosłych. W zależności od typu komórki, PrC biorą udział w specyfikacji asymetrii zarodka, rozmieszczeniu centrioli, regulacji proliferacji/cyklu komórkowego, autofagii, mechanotransdukcji wyczuwającej przepływ, chemocepcji oraz kompartmentalizacji i przemieszczaniu białek sygnalizacyjnych pomiędzy cilioplazmą, cytoplazmą i nukleoplazmą (np. dla Gli i PDGFRα). Kiedy są obecne, rzęski są najbardziej obfite w nieproliferujących komórkach, z proksymalnym końcem zakotwiczonym w inwazji plazmalemmy (kieszeń rzęskowa) w ECs i innych, ale nie wszystkich typach komórek. Pierwotne rzęski są połączone z centriolem macierzystym ciała podstawowego, który łączy się z centrum organizującym mikrotubule (MTOC). Demontaż/resorpcja rzęsek podczas fazy S i uwalnianie centrioli są niezbędne do podziału komórki. Ponieważ PrC są połączone z cytoszkieletem poprzez MTOC, wywołane przepływem zginanie rzęsek w ECs może być przenoszone na całą komórkę, w tym na połączenia komórka-komórka i komórka-matryca. Pierwotne rzęski przenoszą naprężenia ścinające płynu w komórkach nabłonka kanalików nerkowych i ECs poprzez ścieżkę, która jest wyjątkowo wrażliwa na naprężenia ścinające i obejmuje poliacystynę-1 i poliacystynę-2, które są kodowane przez Pkd1 i Pkd2 . Poliacystyna-1 ma właściwości mechanowrażliwe, podczas gdy poliacystyna-2 jest kanałem wapniowym TRP. Oba białka są wymagane do wyczuwania stresu ścinającego i w konsekwencji uwalniania tlenku azotu. Defekty w PrC wiążą się z wieloma nieprawidłowościami. Na przykład, mutacje PKD1 i PKD2 są przyczyną autosomalnej dominującej wielotorbielowatej choroby nerek, z ECs nerek i komórkami kanalików pacjentów wykazujących niedobór wapnia i odpowiedzi NO oraz zwiększoną proliferację.

Pierwotne rzęski są nieobecne w ludzkich ECs żył pępowinowych utrzymywanych w warunkach laminarnego stresu ścinającego i proliferacyjnej quiescence w hodowli komórkowej. W ludzkich żyłach pępowinowych mniej niż jeden procent ECs mają rzęski, które wystają do światła, podczas gdy w większej frakcji rzęski są zlokalizowane wewnątrzkomórkowo. Aorta embrionalna i ECs hodowane z niej mają pojedyncze cilium, które wystaje do światła. Śródbłonkowe rzęski są obecne w regionach o wysokim stresie ścinającym podczas rozwoju embrionalnego, wraz z ekspresją wrażliwego na stres ścinający czynnika transkrypcyjnego KLF2, który tranaktywuje eNOS i inne geny przeciwzapalne i antyproliferacyjne. W regionach o niskim lub zaburzonym naprężeniu ścinającym PrC są demontowane/nieobecne, a ekspresja Klf2 i eNOS jest zniesiona i zmniejszona, odpowiednio. Ekspresja Klf2 jest również hamowana w ECs niecylinowanych izolowanych z tętnic embrionalnych, a chemiczne usunięcie PrC z ECs w hodowli ma podobny efekt, tj. zniesienie ekspresji Klf2. Co ciekawe, w ECs dorosłych myszy ApoE-/-, które mają dysfunkcję śródbłonka, ale nie rozwijają blaszek miażdżycowych, rzęski są wyrażane ektopowo w tętnicy szyjnej wspólnej pomimo obecności przepływu laminarnego, w porównaniu z myszami wildtype, które są pozbawione rzęsek. Cilia zostały utracone, gdy wysokie naprężenie ścinające zostało wywołane przez implantację odlewu ograniczającego przepływ wokół naczynia. Odlewanie szyjki wspólnej u myszy wildtype indukowało ciliogenezę tylko w regionach niskiego i zaburzonego stresu ścinającego. Wyniki te sugerują, że ekspresja PrC na ECs in vivo u dorosłych jest ograniczona do regionów o niskim/zaburzonym naprężeniu ścinającym, ale może wystąpić ektopowo w tętnicach o przepływie laminarnym w obecności dysfunkcji śródbłonka spowodowanej hiperlipidemią i prawdopodobnie innymi naczyniowymi czynnikami ryzyka. Na uwagę zasługuje fakt, że w wysoce rzęski, w obszarach o zaburzonym przepływie, takich jak wewnętrzna krzywizna łuku aorty lub poniżej blaszek miażdżycowych, około 25% ECs ma pojedyncze rzęski, podczas gdy reszta jest pozbawiona, odsetek podobny do tego, co zaobserwowaliśmy w tętniczkach i kolateralach.

Nasze ustalenia, że PrC są również obecne na tętniczkach i kolateralach w zdrowych młodych dorosłych myszach podkreślają potrzebę badań badających funkcję rzęsek w tych typach naczyń. Obejmuje to ustalenie, czy nasza obserwacja mniejszej liczby rzęsek na ECs collateral niż arteriole ma znaczenie funkcjonalne. Komórki śródbłonka są sprzężone mechanicznie, elektrycznie i dyfuzyjnie z sąsiadującymi ECs i SMCs , dlatego tylko część ECs może potrzebować ekspresji rzęsek do transdukcji sygnałów mechano-wrażliwych lub innych. Wysokie naprężenia ścinające powodują demontaż rzęsek w hodowanych ECs, podczas gdy oscylacyjne odwrócenie przepływu indukuje ich ekspresję. Spekulujemy, że rzęski na tętniczkach i bocznych ECs mogą odzwierciedlać niższy przepływ/naprężenie ścinające w tętniczkach i bardzo niski i zaburzony przepływ w kolateralach i że mniej PrC na bocznych ECs może służyć do zmniejszenia ich wrażliwości na dominujące środowisko zaburzonego naprężenia ścinającego. Innymi słowy, mniejsza liczba rzęsek na ECs kolateralnych może być częścią repertuaru adaptacji, które równoważą lub przeciwstawiają się – poprzez utrzymaną lub zwiększoną ekspresję KLF2/4, eNOS i innych czynników przeciwzapalnych/antyproliferacyjnych – słabym sygnałom zapalnym, oksydacyjnym, proliferacyjnym i apoptotycznym promowanym przez zaburzone środowisko hemodynamiczne obecne w kolateralach (Rycina 9). Egorova i wsp. zaproponowali coś podobnego, tj. że skoro obecność PrC na ECs wiąże się z ekspresją KLF2, to rzęski śródbłonka mogą sygnalizować hamowanie aktywacji EC w regionach niskiego i zaburzonego przepływu. Ochronna rola rzęsek w tych regionach jest wspierana przez ostatnie doniesienie, że usunięcie rzęsek śródbłonka za pomocą warunkowej delecji Ift88 zwiększyło miażdżycę i ekspresję genów zapalnych oraz zmniejszyło aktywność eNOS u myszy Apoe-/- karmionych dietą wysokotłuszczową, a także, że śródbłonek staje się wrażliwy w regionach podatnych na miażdżycę, aby poddać się osteogennemu różnicowaniu u myszy Tg737 (orpk/orpk) z defektem rzęsek. Jest również możliwe, że jeśli PrC są ochronne, mniejsza ich liczba w kolateralach może przyczynić się do wysokiej podatności tych naczyń na rozrzedzenie spowodowane starzeniem się i innymi naczyniowymi czynnikami ryzyka. Jednakże, mniejsza liczba rzęsek na kolateralach może po prostu odzwierciedlać efekt wtórny lub uboczny, będący konsekwencją, na przykład, wyższego wrodzonego tempa proliferacji ECs kolateralnych, o czym świadczy stopniowy wzrost krętości kolaterali (omówiony poniżej), ponieważ uważa się, że obecność PrC i ich związek z ciałem podstawowym sprzyjają usuwaniu komórek z cyklu komórkowego . Przyszłe badania będą wymagane w celu określenia, czy nasze odkrycie wielu rzęsek na ECs odzwierciedla ECs, które przeszły proliferacyjną starość i związaną z nią nieudaną cytokinezę i poliploidię jądrową.

Ostatnio wykazano, że ECs w rozwijającej się siatkówce myszy polegają na PrC do stabilizacji połączeń naczyń podczas przebudowy splotu naczyniowego w regionach z niskim do pośredniego naprężenia ścinającego . Śródbłonkowe rzęski wyczuwają przepływ w embrionach zebrafish, uczestniczą w rekrutacji komórek muru do tętniczych naczyń, i są wymagane dla normalnej morfogenezy naczyniowej. Liczba i średnica kolaterali zmniejsza się począwszy od wieku średniego. To spowodowane wiekiem rozrzedzenie jest silnie przyspieszane przez genetyczny lub farmakologicznie indukowany niedobór eNOS/NO lub obecność czynników ryzyka naczyniowego. Zwiększone naprężenia ścinające indukują przebudowę na zewnątrz naczyń po ostrej lub powoli rozwijającej się niedrożności tętnic. Myszy Pkd1+/- i pacjenci z autosomalnie dominującą wielotorbielowatą chorobą nerek mają dysfunkcję śródbłonka eNOS/NO. W przyszłych badaniach ważne będzie sprawdzenie, czy PrC uczestniczą w jednej lub więcej z powyższych funkcji, stosując specyficzne dla EC knockdown poliacystyny-1, ponieważ: 1) jej niedobór prowadzi do zmienionej funkcji rzęsek, 2) poliacystyna-1 wraz z poliacystyną-2 uczestniczą w wyczuwaniu przepływu przez PrC, 3) zmutowane formy któregokolwiek z tych białek powodują polipowatą chorobę nerek , 4) istnieją dowody, że VHL, niezależnie od swojej roli w degradacji Hif1α, wraz z GSK3β są wymagane do strukturalnego utrzymania cilium oraz 5) białko Rabep2, które jest wymagane do kolaterogenezy, jest nowym substratem GSK3β, lokalizuje się w kompleksie cilium-basal body, a wyłączenie go prowadzi do defektu ciliogenezy. Inne podejścia do ingerencji w obecność i funkcję rzęsek, np. poprzez wyłączenie innych białek rzęskowych, takich jak Pkd2 i Ift88, również będą musiały zostać zbadane.

W przeciwieństwie do dystalnych tętniczek, które mają skąpe i nieciągłe SMCs w różnych tkankach, w tym siatkówce (nie byliśmy w stanie zidentyfikować badań w mózgu) , SMCs były ciągłe na kolateralach. Spekulujemy, że może to być adaptacyjny wzrost grubości ściany, aby zrównoważyć wzrost obwodowego naprężenia ściany spowodowanego przez określoną przez Bernoulliego konwersję energii kinetycznej przepływu do zwiększonej energii potencjalnej (ciśnienia transmuralnego) jako konsekwencji konwergencji przepływu w kolateralach. Interesujące byłoby zbadanie, czy skład i ilość macierzy zewnątrzkomórkowej, która mogłaby pomóc SMCs w równoważeniu zwiększonego naprężenia ściany w kolateralach, różni się w kolateralach w porównaniu z tętniczkami. Warto zauważyć, że pomimo zwiększonego pokrycia SMC, kolaterale mają raczej mniej niż więcej tonu w porównaniu z podobnej wielkości tętniczkami i brak miogennej reaktywności – dodatkowe unikalne cechy naczyń bocznych .

Zaburzone hemodynamiczne, pro-oksydacyjne środowisko, w którym rezydują komórki muru bocznego doprowadziło nas do zbadania, czy ekspresja genów zaangażowanych w zapalenie, proliferację komórek, starzenie się i angiogenezę różni się dla kolaterali w porównaniu z dystalnymi tętniczkami. Kolaterale wykazywały zwiększony poziom mRNA dla genu inflammasomu prozapalnego i pro-apoptozy, Pycard, genów proproliferacyjnych, Ki67, Pdgfb i Angpt2, genu antyproliferacyjnego, Dll4, oraz genu markera zróżnicowanych EC typu tętniczego, Ephrinb2. Nie stwierdzono natomiast różnic w ekspresji genów hamujących cykl komórkowy, p21, p27 i p53, ani innych genów związanych z proliferacją, zatrzymaniem cyklu komórkowego i starzeniem się (p16Ink4a, Ampk, Sirt1, telomeraza). Nie zaobserwowano również różnic w ekspresji innych genów związanych z proliferacją EC i/lub SMC (Vegfa, Flk1, Clic4, Pdgfa, Flt1) oraz wymaganych (w przypadku trzech pierwszych genów) do formowania kolaterali w trakcie rozwoju lub zaangażowanych w specyfikację różnicowania i quiescence EC i SMC (Tgfb, Angpt1). Zwiększona ekspresja powyższych genów proproliferacyjnych przez kolaterale jest zgodna z naszymi pomiarami krętości, które sugerują, że komórki muru kolateralnego mają wyższy wskaźnik proliferacji w porównaniu z innymi naczyniami tętniczymi: krętość kolaterali była widoczna w pierwszym dniu po urodzeniu, nadal wzrastała do wieku średniego, a następnie zmniejszyła się. To ostatnie nastąpiło w tym samym czasie, w którym kolaterale doświadczają spadku liczby i średnicy z zaawansowanym starzeniem się. Wyniki te wspierają hipotezę, że rarefakcja kolaterali związana z wiekiem jest spowodowana proliferacyjną senescencją i późniejszą apoptozą ECs i SMCs kolateralnych z powodu życiowego zwiększenia tempa proliferacji spowodowanego przez zaburzone środowisko hemodynamiczne i niską zawartość tlenu we krwi, w którym rezydują kolaterale (Figura 9).

Kolaterale wykazywały również zwiększoną aktywność eNOS, która, jak wykazały poprzednie badania, przeciwstawia się rozrzedzaniu kolaterali spowodowanemu starzeniem się i innymi naczyniowymi czynnikami ryzyka. NO pochodzący z eNOS hamuje stres oksydacyjny, zapalenie, proliferację, adhezję leukocytów, agregację płytek krwi i starzenie się komórek oraz promuje relaksację SMC. Ponieważ stres ścinania jest proksymalnym bodźcem dla eNOS-pochodnej NO, zwiększona eNOS/NO w kolateralach z ich niskim i zaburzonym środowiskiem stresu ścinania może zmniejszyć efekt czynników promujących rarefakcję kolaterali (Figura 9). Podobnie, utrzymana ekspresja czynników transkrypcyjnych wrażliwych na stres ścinający, Klf2 i Klf4, w kolateralach pomimo ich niskiego i oscylacyjnego przepływu, który hamuje ekspresję tych czynników w innych miejscach w naczyniach tętniczych z zaburzonym przepływem, może działać jako dodatkowe czynniki „równoważące” lub specjalizacje boczne, wraz ze zwiększoną eNOS, wyrównanymi ECs, mniejszą liczbą rzęsek, solidnym pokryciem SMC i zwiększoną efryną-B2 i Dll4. Ekspresja KLF2 i KLF4, które negatywnie regulują proliferację, zapalenie i angiogenezę, zwiększają eNOS i są gwałtownie obniżane w miejscach o niskim i zaburzonym naprężeniu ścinającym, nie różniła się w kolateralach w porównaniu z DMA. Co ciekawe, PrC promują Klf2, Klf4 i ekspresję eNOS .

Ograniczeniem powyższych badań jest to, że RNA uzyskano z rozciętych naczyń, które składają się z ECs, SMCs i, chociaż mniej, pericytów, fibroblastów i komórek mieloidalnych rezydentów. Potrzebne są badania, które pozwolą na rozdzielenie typów komórek i zbadanie szerszej gamy genów i ich odpowiednich poziomów białek. Jednakże trudności w ręcznym wycinaniu kolaterali i dystalnych tętniczek w wymaganej liczbie, wpływ technik dysocjacji komórek na podstawowe poziomy RNA i białek, brak modeli hodowli komórkowych „bocznych” ECs i SMCs, oraz jak dotąd brak jakiegokolwiek genu markerowego specyficznego dla kolaterali, wykluczają zastosowanie tych metod. Flk1, Angpt1, Angpt2, Ephrinb2, DLL4, eNOS, Clic4, Klf2 i Klf4. Jednak analiza transkrypcji genów nie zawsze odzwierciedla zmiany w poziomie lub funkcji białek; dlatego badanie markerów stresu oksydacyjnego, zapalenia, proliferacji lub starzenia na poziomie białek może lepiej odzwierciedlać różnice w charakterystyce komórkowej.