Cell culture, virus amplification and purification for SHAPE-MaP and SPLASH experiments

Madin-Darby Bovine Kidney (MDBK) and Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells were grown in Minimum Essential Medium (Merck), supplemented with 2 mM l-glutamine and 10% FCS. Zapasy wirusa WSN (H1N1) wytworzono przez zakażenie komórek MDBK wirusem grypy przy mnogości zakażenia (MOI) 0,01. Zapasy wirusa Udorn (H3N2) i PR8 (H1N1) (PR8) wytwarzano przez zakażanie komórek MDCK przy MOI równym 0,001 w obecności 0,8 μg ml-1 n-tosyl-l-fenyloalaniny chlorometylo ketonu (TPCK) poddanej działaniu trypsyny (Merck). Wirusy zbierano 2 d po zakażeniu. Wirusy oczyszczano przez ultrawirowanie: najpierw pożywkę z zakażonych hodowli komórkowych oczyszczano przez wirowanie przy 4000 obr/min przez 10 min w temp. 4 °C, a następnie przez wirowanie przy 10000 obr/min przez 15 min w temp. 4 °C. Wirus został następnie oczyszczony przez wirowanie na poduszce z 30% sacharozy przy 25 000 obrotów na minutę przez 90 minut w temperaturze 4 °C w wirniku SW 32 (Beckman Coulter). Oczyszczony osad wirusa został ponownie zawieszony w buforze do resuspensji (0,01 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,1 M NaCl, 0,0001 M EDTA). Zwracamy uwagę, że ani struktury trzeciorzędowe wirionów, ani RNA nie są zaburzane przez ultrawirowanie30,31,32.

SHAPE-MaP

SHAPE-MaP przeprowadzono zgodnie z opublikowanymi protokułami17; bezwodnik 1-metylo-7-nitroizatoic (1M7) zsyntetyzowano z bezwodnika 4-nitroizatoic jak opisano wcześniej33. Dla eksperymentów z transkrybowanym in vitro RNA, każdy segment wirusowego RNA był syntetyzowany z liniowego szablonu DNA przy użyciu HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit (New England Biolabs). Produkty były sprawdzane pod względem wielkości i czystości na 3,5% żelu poliakrylamidowym (PAGE)-żelu mocznikowym. Próbki nagiego wirusowego RNA przygotowywano przez oczyszczanie cząstek WSN na poduszce sacharozowej, jak opisano wcześniej. Oczyszczone wirusy traktowano 250 μg ml-1 proteinazy K (Roche) w buforze proteinazowym K (10 mM Tris-HCl, pH 7,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% SDS) przez 40 min w temp. 37°C. Przed modyfikacją próbki RNA transkrybowanego in vitro i nagiego wirusowego RNA składano w temperaturze 37 °C przez 30 min w buforze składającym (100 mM HEPES-NaOH, pH 8,0, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2). Do złożonego RNA dodawano 1M7 (rozpuszczony w bezwodnym dimetylosulfotlenku (DMSO; Merck)) w końcowym stężeniu 10 mM, a próbki inkubowano przez 75 s w 37 °C. Modyfikacje in virio przeprowadzono przez dodanie 1M7 bezpośrednio do oczyszczonego wirusa. Zdolność odczynników SHAPE-MaP do penetracji cząstek wirusowych badano początkowo, jak opisano wcześniej34, wykonując 32P-oznakowane przedłużenia primera na RNA wyekstrahowanym z wirusa poddanego działaniu odczynnika SHAPE-MaP przy użyciu primera ukierunkowanego na segment NA (5′-AATTGGTTCCAAAGGAGACG-3′). Równolegle do próbek poddanych działaniu 1M7, próbki kontrolne poddano działaniu DMSO. Bezwodnik n-metyloizatoinowy (NMIA; Thermo Fisher Scientific) odczynnika SHAPE-MaP był również testowany w virio. Eksperymenty z NMIA przeprowadzono tak, jak opisano dla 1M7, z wyjątkiem oczyszczonych wirusów traktowano NMIA przez 45 min.

Przygotowanie biblioteki sekwencjonowania przeprowadzono zgodnie z opisem wcześniej17 zgodnie z przepływem pracy randomer. W skrócie, po traktowaniu 1M7 lub kontroli, RNA oczyszczono za pomocą zestawu RNA Clean & Concentrator-5 Kit (Zymo Research). RNA poddano odwrotnej transkrypcji przy użyciu Random Primer Mix (New England Biolabs) z SuperScript II (Invitrogen) w buforze MaP (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 75 mM KCl, 6 mM MnCl2, 10 mM ditiothreitol i 0,5 mM trifosforan deoksynukleozydów). Do przygotowania bibliotek DNA użyto zestawu Nextera XT DNA Library Prep Kit (Illumina). Końcowe produkty amplifikacji PCR były selekcjonowane pod względem wielkości przy użyciu Agencourt AMPure XP Beads (Beckman Coulter) i oceniane pod względem jakości przy użyciu zestawu Agilent DNA 1000 (Agilent Technologies) w systemie Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies). Dla WSN, nagiego wirusowego RNA i RNA transkrybowanego in vitro, biblioteki były sekwencjonowane (2 × 150 par zasad (bp)) na systemie HiSeq 4000 (Illumina); dla wirusów PR8 i Udorn, biblioteki były sekwencjonowane (1 × 150 bp) na systemie NextSeq 500 (Illumina).

SPLASH

SPLASH Próbki przygotowano jak opublikowano wcześniej24,35, z pewnymi modyfikacjami, dla dwóch replik każdego z wirusów WSN, PR8 i Udorn oraz pojedynczej repliki dla każdego z wirusów reasortantów H3N2. Oczyszczony wirus był inkubowany z 200 μM EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin (Thermo Fisher Scientific) i 0,01% digitoniną (Merck) przez 5 min w temperaturze 37 °C. Wirus rozprowadzano na szalce 6-dołkowej, przykrywano płytką szklaną, umieszczano na lodzie i napromieniowywano przez 45 min przy użyciu ręcznej lampy UVP Ultra Violet Product Handheld UV Lamp (Thermo Fisher Scientific). Usieciowany wirus traktowano proteinazą K, a wirusowe RNA ekstrahowano przy użyciu TRIzolu (Invitrogen). Podzielna część wyekstrahowanego wirusowego RNA została użyta do wykrycia wbudowania biotyny przy użyciu Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module Kit (Thermo Fisher Scientific) na Hybond-N Nylon Membrane (GE Healthcare Life Sciences). Reszta wyekstrahowanego wirusowego RNA była fragmentowana przy użyciu NEBNext Magnesium RNA Fragmentation Module (New England Biolabs) i selekcjonowana pod względem wielkości fragmentów krótszych niż 200 nt przy użyciu RNA Clean & Concentrator-5 Kit. Próbki wzbogacono o biotynylowane wirusowe RNA przy użyciu kulek Dynabeads MyOne Streptavidin C1 (Thermo Fisher Scientific); ligację zbliżeniową na kuleczkach i odwrócenie wiązania psoralenowo-krzyżowego przeprowadzono zgodnie z wcześniejszymi publikacjami24,35. Biblioteki sekwencjonujące przygotowano przy użyciu komercyjnego zestawu SMARTer smRNA-Seq Kit (Clontech Laboratories). Ostatecznej selekcji wielkości dokonano poprzez przeprowadzenie bibliotek sekwencjonujących amplifikowanych metodą PCR na 6% żelu PAGE (Thermo Fisher Scientific) w Tris/ kwas borowy/EDTA (TBE), wybierając DNA o wielkości 200-300 bp. Biblioteki sekwencjonowano 1 × 150 bp na NextSeq 500 System.

Processing of SHAPE-MaP sequencing reads

Sequencing reads were trimmed to remove adaptors using Skewer v0.2.2 (ref. 36). Profile reaktywności SHAPE-MaP zostały wygenerowane przy użyciu opublikowanego potoku ShapeMapper237, który wyrównuje odczyty do genomu referencyjnego i oblicza wskaźniki mutacji w każdej pozycji nukleotydu. Wskaźniki mutacji są następnie przekształcane na wartości reaktywności SHAPE-MaP zdefiniowane jako:

gdzie mutr1M7 to szybkość mutacji nukleotydów w próbce poddanej działaniu 1M7, a mutrDMSO to szybkość mutacji w próbce poddanej działaniu DMSO. Wszystkie reaktywności SHAPE-MaP zostały znormalizowane do przybliżonej skali 0-2 poprzez podzielenie wartości reaktywności SHAPE-MaP przez średnią reaktywność 10% najbardziej reaktywnych nukleotydów po wykluczeniu wartości odstających (zdefiniowanych jako nukleotydy z wartościami reaktywności, które są >1,5 zakresu międzykwartylowego). Wysokie reaktywności SHAPE-MaP wskazują na bardziej elastyczne (to jest jednoniciowe) regiony RNA, a niskie reaktywności SHAPE-MaP wskazują na bardziej strukturalnie ograniczone (to jest sparowane zasadami) regiony RNA.

Przetwarzanie odczytów sekwencjonowania SPLASH

Re odczyty sekwencjonowania zostały przycięte w celu usunięcia adapterów przy użyciu Skewer v0.2.2 (ref. 36). STAR v.2.5.3 (ref. 38) został użyty do wyrównania odczytów do odpowiedniego genomu referencyjnego wirusa (Supplementary Table 2). Do dalszego przetwarzania wykorzystano tylko te odczyty chimeryczne, w których do segmentów referencyjnych dopasowano co najmniej 20 nt (parametr STAR: -chimSegmentMin 20). Odczyty chimeryczne poddano deduplikacji przy użyciu łańcuchów CIGAR i pozycji alignmentu. Łańcuchy CIGAR w każdym wyrównaniu odczytów były przetwarzane w celu znalezienia współrzędnych początku i końca odczytu. Współrzędne odczytów chimerycznych wykorzystano do sporządzenia macierzy interakcji sekwencji w programie R. W celu określenia okna interakcji wybrano dyskretne loci w macierzy i indywidualnie dopasowano je krzywą gaussowską opartą na intensywności nakładania się odczytów; okna interakcji złożonych loci nakładających się na siebie zostały rozdzielone na pojedyncze okna. Szerokość okna interakcji została wykorzystana do określenia współrzędnych początkowych i końcowych każdej interakcji; liczba odczytów, które znajdowały się w tym regionie (lub częściowo w nim) została wykorzystana jako miara częstotliwości interakcji. W celu wygenerowania rysunków, 20 najlepszych interakcji w każdym wirusie zostało zwizualizowanych przy użyciu pakietu circlize v.0.4.5 (ref. 39) w R v.3.5.1. Pełny zestaw loci interakcyjnych jest przedstawiony w Tabeli Dodatkowej 2. Do walidacji qPCR loci interakcyjnych, próbki sieciowane psoralenem zostały przygotowane i wzbogacone jak opisano wcześniej, ale ze skróconym czasem fragmentacji (3 versus 4 min), aby wygenerować dłuższe fragmenty RNA. RNA było poliadenylowane przy użyciu Polimerazy Poly(A) (Takara Bio), a komplementarne DNA było generowane przy użyciu smRNA dT Primer (Takara Bio) i PrimeScript Reverse Transcriptase (Takara Bio) zgodnie z instrukcjami producenta. 50-cykl qPCR przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta na aparacie StepOnePlus (Applied Biosystems) przy użyciu Brilliant II SYBR Green QPCR Master Mix with ROX (Agilent Technologies) i par primerów do badania interakcji między segmentami. Sekwencje starterów podano w Tabeli 3 Suplementu. Po 50 cyklach amplifikacji qPCR, produkty były rozdzielane przez 8% PAGE (29:1 akrylamid/bis-akrylamid, 1× bufor TBE) i wizualizowane za pomocą transiluminacji niebieskim światłem.

Przewidywanie struktury RNA

Algorytm IntaRNA v.2.3.1 (ref. 40) został użyty do przewidywania możliwości wystąpienia interakcji RNA-RNA w regionach zidentyfikowanych podczas analizy SPLASH, przy użyciu opcji Exact mode (-mode E) i no seed constraint (-noSeed). Reaktywności SHAPE-MaP zostały włączone do modelowania oddziaływań RNA-RNA (-tShape i -qShape). Permutowane zestawy danych zostały wygenerowane poprzez losowe przemieszanie specyficznych partnerów interakcji zidentyfikowanych przez SPLASH i ocenę energii ΔG interakcji przy użyciu programu IntaRNA. Istotność różnicy pomiędzy rozkładami prawdopodobieństwa energii ΔG związanych z oddziaływaniami międzycząsteczkowymi RNA zidentyfikowanymi przez SPLASH a permutowanymi zestawami danych obliczono za pomocą testu sumy rang Wilcoxona w oprogramowaniu R. Przewidywania struktury IntaRNA zostały następnie wykorzystane do przycięcia regionów interakcji do nukleotydów zaangażowanych w parowanie zasad. W przypadku, gdy dane SHAPE-MaP nie były dostępne (reasortanty PR8 z wirusami H3N2), wstępne składanie każdej nici RNA („dostępność”) zostało wyłączone w IntaRNA (-qAcc = N -tAcc = N). W celu walidacji względem znanych struktur, dane dotyczące struktury drugorzędowej RNA zostały pobrane z bazy danych RNA3Dhub41, w oparciu o struktury kriogenicznej mikroskopii elektronowej rybosomu 80S42 (PDB: 6EK0) i kompleksu spliceosomalnego U4/U6.U5 potrójnej małej jądrowej rybonukleoproteiny spliceosomalnej43 (EMDB: EMD-2966). Sekwencje referencyjnego RNA zostały skorygowane w celu dopasowania do sekwencji bydlęcych (MDBK) dla rybosomalnego RNA i małych jądrowych RNA U4/U6, jak opisano wcześniej44. Do przewidywania wewnątrzcząsteczkowej struktury RNA użyto pakietu ViennaRNA v.2.0 (ref. 45). Polecenie RNAfold zostało użyte do przewidywania drugorzędowych struktur RNA i funkcji podziału dla każdego segmentu. Reaktywności SHAPE-MaP zostały uwzględnione jako ograniczenia pseudoenergetyczne. Analiza korelacji 50 nt z przesuwanym oknem medianowym pomiędzy profilami reaktywności SHAPE-MaP ex virio i in virio została użyta do określenia stopnia korelacji SHAPE-MaP pomiędzy RNA transkrybowanym przez T7 i związanym z vRNP. Stwierdziliśmy, że nie istnieje korelacja >150 nt; dlatego też ustawiliśmy maksymalne ograniczenie odległości parowania dla przewidywań struktury i funkcji podziału na 150 nt. Dla przewidywań struktury wewnątrzcząsteczkowej, ustawiliśmy nukleotydy w regionie promotora jako jednoniciowe.

Hodowla komórek do inżynierii odwrotnej wirusów grypy

Komórki MDCK i komórki ludzkiej nerki embrionalnej (HEK 293T) pochodziły z istniejącej kolekcji w Departamencie Mikrobiologii i Immunologii, Uniwersytetu w Melbourne. Komórki MDCK hodowano w podłożu Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Sigma-Aldrich), a komórki HEK 293T hodowano w DMEM (Thermo Fisher Scientific). Obie pożywki uzupełniono 10% inaktywowanym termicznie FCS, 2 mM l-glutaminy, 2 mM pirogronianu sodu, 24 μg ml-1 gentamycyny, 50 μg ml-1 streptomycyny i 50 IU ml-1 penicyliny. Kokultury komórek MDCK i komórek HEK 293T do transfekcji zostały utworzone w Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific) z 50 μg ml-1 streptomycyny i 50 IU ml-1 penicyliny.

Konstrukcja odwrotnie zmodyfikowanych wirusów grypy

Poszczególne segmenty genów z wirusów PR8, Udorn, Mem71 (H3N2), PC73 (H3N2) i Wyo03 (H3N2) poddano odwrotnej transkrypcji i sklonowano do plazmidów pHW200046. Wirusy uzyskane metodą genetyki odwrotnej zawierały gen PR8, Udorn, Mem71, PC73 lub Wyo03 PB1 z genem NA typu dzikiego lub zmodyfikowanym w tle genetycznym obejmującym sześć segmentów z wirusa PR8 (PB2, PA, HA, NP, M i NS). Zmodyfikowany gen NA (Wyo03UdSub) pochodził z Wyo03 i zawierał 4 substytucje w kierunku sekwencji Udorn-NA: nukleotydy G943A; C938U; U933C; i G923A. Trzy z tych czterech zmian nukleotydowych były nieme, a czwarta (A534G) powodowała konserwatywną zmianę lizyny na argininę (K172R). Komplementarne fragmenty zawierające te zmiany zostały wygenerowane przez PCR i połączone przez kolejną rundę PCR przy użyciu starterów specyficznych dla segmentów zawierających miejsca restrykcyjne BsmBI47; produkt został sklonowany do wektora ekspresyjnego pHW2000 w celu ratowania wirusa. Sekwencje primerów podano w Tabeli 3 w Suplemencie. Ocalone wirusy amplifikowano w 10-d embrionowanych jajach kurzych. Zakaźny płyn omoczniowy miareczkowano na zawartość wirusa przez tworzenie płytek w komórkach MDCK48 i przechowywano w temperaturze -80 °C.

Określanie kinetyki replikacji wirusowej odwrotnie skonstruowanych wirusów

Charakterystykę replikacji odwrotnie skonstruowanych wirusów określono przez zakażenie komórek MDCK przy MOI równym 0,01. Po 1 h absorpcji (w t = 0 h) inokulum usuwano, a komórki przemywano i inkubowano w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w RPMI 1640 uzupełnionym 2 mM l-glutaminą, 2 mM pirogronianem sodu, 24 μg ml-1 gentamycyną, 50 μg ml-1 streptomycyną, 50 IU ml-1 penicyliną i 1 μg ml-1 trypsyny traktowanej TPCK (Worthington Biochemical Corporation). Supernatanty z hodowli komórkowych zbierano w różnych punktach czasowych po zakażeniu i przechowywano w temperaturze -80 °C do analizy. Miano wirusów określano poprzez tworzenie płytek na zlewnych monowarstwach komórek MDCK.

Konkurencyjna inżynieria wsteczna dziewięcioplazmidowych wirusów grypy

Konkurencyjna inżynieria wsteczna wirusów grypy została przeprowadzona przy użyciu zmodyfikowanej wersji ośmioplazmidowego systemu genetyki wstecznej26 , jak opisano wcześniej25. W skrócie, plazmidy kodujące segmenty PB2, PB1, PA, hemaglutyninę (HA), nukleoproteinę (NP), białko macierzy (M) i białko niestrukturalne (NS) wirusowego RNA PR8 były kotransfekowane z plazmidami kodującymi wirusową RNA neuraminidazy (NA) i konkurencyjne wirusowe RNA PB1 Udorn, Mem71, PC73 lub typu dzikiego albo zmodyfikowanego Wyo03. Każdy plazmid (1 µg) został zmieszany z odczynnikiem do transfekcji FuGENE 6 (Promega) w Opti-MEM i dodany do kokultury komórek HEK 293T i MDCK. Sześć godzin po transfekcji pożywkę zastąpiono Opti-MEM z dodatkiem 50 μg ml-1 streptomycyny i 50 IU ml-1 penicyliny. Dwadzieścia cztery godziny później dodano trypsynę traktowaną TPCK (1 μg ml-1), a supernatant zebrano po kolejnych 42 h i przechowywano w temperaturze -80 °C. W celu określenia częstotliwości wbudowywania konkurujących genów PB1, wirusy potomne w supernatancie transfekcyjnym poddawano testowi plastyfikacji w komórkach MDCK. Losowo wybrane płytki (około 36 na eksperyment) zostały pobrane przez próbkowanie przez agarozę i ponownie zawieszone w 0,05% Triton-X100. Źródło konkurujących odcinków genów identyfikowano za pomocą ilościowej RT-PCR specyficznej dla genu, stosując SensiFast probe no-ROX one-step RT-PCR Kit (Bioline). Każdą reakcję o objętości 20 μl przeprowadzono z użyciem 5 μl zawiesiny pobranego wirusa, 10 μl mieszaniny 2× SensiFast SYBR No-ROX One-Step, 0,2 μl odwrotnej transkryptazy, 0,4 μl inhibitora RNazy Ribosafe, 0,8 μl każdego 10 μM specyficznego dla genu primera forward i reverse oraz 0,08 μl każdej 25 μM specyficznej dla genu sondy. Sekwencje primerów i sond podano w tabeli 3 w suplemencie. Reakcja RT-PCR była inkubowana przez 10 min w temperaturze 45 °C, przed przystąpieniem do amplifikacji qPCR, zgodnie z instrukcjami producenta. Zgłoszone wartości są połączonymi danymi z 3-8 niezależnych eksperymentów transfekcji dla każdej konkurencji.

Podsumowanie sprawozdawczości

Dalsze informacje na temat projektu badań są dostępne w Nature Research Reporting Summary powiązanym z tym artykułem.

.