Abstract
Ta praca pokazuje, że szczegółowy opis ultrastruktury komórek wydzielniczych południowoamerykańskiego suma Rhamdia quelen wysepek trzustkowych jest przedstawiony. Oferowane są dowody na poparcie twierdzenia, że α-granulki składają się z centralnej i zewnętrznej części o różnych gęstościach elektronowych i rozpuszczalności, że komórki δ są najprawdopodobniej morfologicznie zmienionymi, ale żywymi komórkami α, i że β-granulki prawdopodobnie posiadają powtarzającą się podstrukturę i dlatego mogą reprezentować wewnątrzkomórkową krystaliczną formę przechowywania insuliny.
1. Wprowadzenie
Wysepki Langerhansa zostały odkryte u królika przez Langerhansa w 1869 roku. Jednakże, zostały one opisane przez Stanniusa i Blockmanna u teleostów około 20 lat wcześniej i dlatego są również, choć rzadziej, określane jako ciałka Stanniusa lub Blockmanna. Wysepki Langerhansa są pochodzenia endodermalnego i w większości teleosts znajdują się jako małe ciała rozproszone w zewnątrzwydzielniczej części trzustki .
Ryba nie ma dyskretnej trzustki. Egzokrynna tkanka trzustkowa może być znaleziona rozproszona wzdłuż przewodu jelitowego. Struktura acinarna trzustki zewnątrzwydzielniczej jest bardzo podobna do tej u ssaków i składa się z komórek o bardzo ciemnej, bazofilnej cytoplazmie. U aktywnie żerujących ryb zawierają one dużą liczbę jasnych, eozynofilowych, ziarnistości wydzielniczych. Można wyróżnić endokrynne wysepki trzustkowe Langerhansa, a tkanka obejmuje komórki α (produkujące glukagonopodobny peptyd), komórki β (produkujące insulinę) i komórki d (produkujące somatostatynę). U ssaków i ludzi większość wcześniejszych opisów mikroskopii elektronowej dorosłych ludzkich wysepek trzustkowych była krótka, a niewielkie części publikacji poświęcono głównie opisom guzów komórek β lub artykułom przeglądowym omawiającym morfologię porównawczą wysepek kilku gatunków .
Rybia trzustka nie często okazuje się być gotowym źródłem tkanki do badań mikroskopii elektronowej. Główna trzustka ryb jest zarówno anatomicznie, jak i rozwojowo podobna do trzustki ssaków, podczas gdy poważne różnice są widoczne u innych gatunków ryb. U dorosłych ryb zebrafish trzustka główna zawiera kilka głównych wysepek otoczonych tkanką egzokrynną. Ogon pojedynczych wysepek osadzonych w tkance zewnątrzwydzielniczej i tłuszczu rozciąga się doogonowo wzdłuż jelita. W przeciwieństwie do tego, komórki β tilapii (innej wrażliwej na glukozę ryby z rodziny teleostów) znajdują się w wysepkach Langerhansa zlokalizowanych wzdłuż krezki, które nie są otoczone tkanką zewnątrzwydzielniczą. Rhamdia quelen należy do teleostów i jest ważnym gatunkiem dla akwakultury w klimacie subtropikalnym. R. quelen występują od południowego Meksyku do środkowej Argentyny, a hodowla tego gatunku rozprzestrzenia się w kierunku południowej Brazylii .
W obecnym badaniu analizujemy ultrastrukturę wysepek Langerhansa i szczegółowo opisujemy różne typy komórek wydzielniczych u południowoamerykańskiego suma R. quelen.
2. Materiały i Metody
Cztery hodowlane R. quelem dwie samice i dwa samce ( g; cm) z Centro Nacional de Desarrollo Acuícola (CENADAC) w północno-wschodnim regionie Argentyny i zarybione w 200 L zbiornikach, gdzie były aklimatyzowane przez dwa tygodnie przed nekropsją. Ryby hodowano w filtrowanej wodzie słodkiej utrzymywanej w temperaturze 25°C z wymianą wody wynoszącą 100% dziennie. Fotoperiod został dostosowany do 12 h ciemności i 12 h światła. Ryby karmiono ręcznie cztery razy dziennie komercyjną dietą (Ganave). Ryby poddano eutanazji przy użyciu benzokainy (500 ppm) i przeprowadzono nekropsję, a próbki tłuszczu, który rozciąga się ogonowo wzdłuż jelita, utrwalono w 10% zbuforowanej formalinie, osadzono w parafinie i zabarwiono hematoksyliną i eozyną (H&E).
Małe fragmenty tkanki pocięto na bloki 1 mm i natychmiast utrwalono w buforowanym fosforanem glutaraldehydzie (pH 6.9 w 4 ° C), przemyto w roztworze Milloniga i utrwalono w 1% tetroksydzie osmowym; bloki tkanek zostały następnie odwodnione w stopniowanej serii etanolu-acetonu, zanurzone w tlenku propylenu i osadzone w Durcupan ACNI (Fluka Chemie A.G., Szwajcaria). Cienkie przekroje wycinano ultramikrotomem LKB i podwójnie barwiono octanem uranylu i cytrynianem ołowiu przed badaniem w mikroskopie elektronowym Jeol JEM-8T (Jeol, Tokio, Japonia).
3. Wyniki
3.1. Mikroskopia świetlna
R. quelen ma trzustkę rozproszoną w tkance tłuszczowej otaczającej przewód żółciowy wspólny; leży ona w przybliżeniu w trójkątnym regionie nakreślonym z góry przez żołądek, z przodu przez wątrobę, a z dołu przez śledzionę i pęcherzyk żółciowy. Każda wysepka Langerhansa składa się z relatywnie czystej tkanki wysepkowej otoczonej przez egzokrynną trzustkę (ryc. 1). Nie zaobserwowano różnic między mężczyznami i kobietami.
3.2. Mikroskopia elektronowa
Komórki β, które zwykle zajmują wnętrze wysepek, były powszechnie, ale nie zawsze, oddzielone od zewnątrzwydzielniczej trzustki przez obwodowo położone komórki α (rysunek 2). Wygląd ultrastrukturalny komórek β był identyczny w próbkach uzyskanych od czterech ryb. Charakterystyczne β-granulki znajdowały się w gładko-membranowych woreczkach i były zróżnicowane pod względem wielkości i kształtu. Widoczne były kryształy prostokątne, kwadratowe, heksagonalne i nieregularnie wielokątne. Rzadziej występowały formy okrągłe (ryc. 2-5). Każda granulka składała się z jednej lub kilku form krystalicznych lub niestrukturalnych o różnej wielkości i kształcie. Nie wydaje się, aby wybór utrwalacza miał wpływ na wewnętrzną strukturę granulek β. W granicach błony otaczającej, obszar peryferyjny w stosunku do kryształów wydawał się pusty lub zawierał drobny kłaczkowaty osad, niezależnie od użytego utrwalacza. Przy większych powiększeniach, w kryształach prawidłowo zorientowanych względem płaszczyzny przekroju, widoczna była niekiedy powtarzająca się podstruktura (ryc. 6 i 7). Liczne mitochondria były rozproszone w całej komórce i występowały jako okrągłe lub puszyste struktury nitkowate. Były one większe i liczniejsze niż w komórce β, ale zwykle mniejsze niż w komórkach pęcherzykowych trzustki. Liczne krysty mitochondrialne były, w przeważającej części, zorientowane poprzecznie, a ziarnistości mitochondrialne były obecne, ale nie wyróżniające się. Cisternae ziarnistego retikulum endoplazmatycznego były zazwyczaj krótkie lub pęcherzykowate (rysunki 2-4). Ziarniste retikulum endoplazmatyczne i wolne rybosomy nie były tak widoczną cechą komórek β, jak w komórkach akrynowych lub β. Te komórki β, w których zwykle występuje niewiele ziarnistości wydzielniczych, były bardziej bogato wyposażone w rybosomy i ziarniste retikulum endoplazmatyczne, które wówczas częściej miało konfigurację cysternalną (rysunek 5).
Kompleks Golgiego był bardziej widoczny po utrwaleniu aldehydem, a struktury składowe były bardziej rozszerzone (rysunek 2). Po zastosowaniu tych utrwalaczy, gęsty bezpostaciowy materiał był czasami widoczny wewnątrz pęcherzyków Golgiego i może reprezentować niedojrzałe ziarnistości lub prekursory ziarnistości β-sekrecyjnych. Jądra komórek β były zwykle kuliste i stosunkowo gładkie w obrysie. Błona komórkowa przylegających komórek wysepki znajdowała się w bliskim kontakcie z desmosomami, chociaż nieczęsto były one połączone. Na styku trzech lub więcej komórek, błony ograniczające były często zawiłe, z krętymi połączeniami między komórkami (rysunki 2 i 9). Wielopęcherzykowe inkluzje cytoplazmatyczne przypominające ceroid były widoczne w większości komórek β (rysunki 2, 7, 9 i 8). Na wygląd oraz częstotliwość tych wtrąceń nie miało znaczącego wpływu pierwotne wykorzystanie kwasu osmowego lub aldehydu jako utrwalacza, oraz nie było widocznego związku między obecnością tych ziarnistości oraz morfologicznymi dowodami aktywności fizjologicznej komórek. Ultrastruktura komórek α była taka sama we wszystkich czterech próbkach tkanek. Rozmiar i kształt tych komórek oraz ich jądra nie różniły się znacząco od tych z normalnych komórek β (rysunki 2 i 7). Chociaż czasami można było znaleźć komórkę α o nieregularnym kształcie lub z wgłębionym jądrem, nie występowało to z wystarczającą częstotliwością, aby służyć jako użyteczne kryterium różnicujące. Granulki cytoplazmatyczne komórek α zachowały się po pierwotnym utrwaleniu osmem jako gęste, kuliste ciała o zmiennej wielkości i były zawarte w luźno przylegających, gładkich, błoniastych woreczkach (Ryc. 7 i 9). Były one większe niż granulki β, ale znacznie mniejsze niż granulki zymogenu komórek acinarnych (rysunek 2). Smukłe, wydłużone mitochondria były umiarkowanie liczne i mniejsze niż te z komórek β i posiadały cristae, które były zazwyczaj zorientowane poprzecznie. Ziarniste retikulum endoplazmatyczne było często w konfiguracji cysternalnej i bardziej obfite niż w komórkach β (rysunek 9). Kompleks Golgiego, jeśli był widoczny, miał umiarkowane proporcje. Gęste bezpostaciowe materiały w pęcherzykach Golgiego i cystainach, przypuszczalnie prekursorach ziarnistości wydzielniczych, występowały częściej w komórkach α niż β (rysunek 10). Ciała kawernowe, chociaż często widoczne, były mniej liczne niż w komórkach β (Figura 2 i 3). Woreczki, w których znajdują się α-granulki wydawały się zatem całkowicie wypełnione i stwierdzono, że granulki składają się z zaokrąglonego wewnętrznego gęstego rdzenia i zewnętrznego mniej gęstego elektronowo płaszcza, który był nieobecny po utrwaleniu osmem (rysunki 3 i 9) i dlatego, być może, bardziej rozpuszczalny. Żadna spójna podstruktura nie była widoczna ani w wewnętrznych, ani w peryferyjnych częściach α-granulek. W żadnym momencie nie zaobserwowano komórek, które mogłyby być interpretowane jako formy przejściowe pomiędzy komórkami α i β. Granulki α, włączając zarówno zewnętrzne jak i wewnętrzne bardziej gęste części, były porównywalne w całkowitej wielkości do „granulek δ”. Ponadto, obecne są komórki pośrednie, które zawierały granulki obu typów sugerując, że komórki δ były w rzeczywistości zmodyfikowanymi komórkami α (Figura 10). Komórki δ były wizualizowane, chociaż prawie zawsze znajdowały się wśród komórek α, i zostały zidentyfikowane i odróżnione ultrastrukturalnie od komórek α na podstawie niższej gęstości elektronowej i większego całkowitego rozmiaru ich ziarnistości wydzielniczych. Ponadto obecne są komórki pośrednie, które zawierały ziarnistości obu typów, co sugeruje, że komórki δ były w rzeczywistości zmodyfikowanymi komórkami α (rysunek 11).
Pomimo że istniała odwrotna zależność pomiędzy liczbą ziarnistości wydzielniczych a widocznością kompleksu Golgiego i ziarnistego retikulum endoplazmatycznego, nie zaobserwowano wzorca uwalniania α- lub β-granulek. Cienka błona podstawna i różne ilości tkanki łącznej zwykle oddzielały wysepki trzustkowe od przyległych komórek akrynowych (rysunek 2). W niektórych przypadkach jednak pomiędzy komórkami wysepek a komórkami pęcherzyków nie było błony podstawnej, które były wówczas oddzielone jedynie wąską przestrzenią śródmiąższową. Fenestrowane komórki śródbłonka kapilar były zawsze oddzielone od nich co najmniej błoną podstawną kapilary (ryc. 9). Niekiedy obecne były również inne elementy wspierające, w tym kolagen i składniki tkanki elastycznej. Nie zaobserwowano różnic między samcami i samicami.
4. Dyskusja
Komórki β ryb łatwo odróżnić od komórek α na podstawie morfologii ziarnistości wydzielniczych. Częsta obecność kanciastych podjednostek i widoczna powtarzająca się podstruktura sugerują krystaliczną naturę granulek β. Próby ustalenia i zmierzenia wymiarów sieci krystalicznej nie zakończyły się jeszcze sukcesem. Gdy wizualizowano granulki wydzielnicze w pobliżu kompleksu Golgiego, krystaliczne podjednostki nie były zwykle obserwowane. Kusz±ce jest więc spekulowanie, że niekrystaliczne granulki lub amorficzny materiał w obrębie kompleksu Golgiego reprezentuje inn± chemiczn± lub fizyczn± formę insuliny lub kompleksu białek insulinowych niż krystaliczne podjednostki granulki. Nie wiadomo, czy te różne formy morfologiczne w obrębie β-granulek mają różną rozpuszczalność i być może różne wzorce uwalniania w odpowiedzi na fizjologiczne zapotrzebowanie. Granulek wydzielniczych nie zaobserwowano w cysternkach lub pęcherzykach ziarnistych retikulum endoplazmatycznego. Przypuszcza się, że podobnie jak w przypadku innych komórek wydzielających białka, kompleks Golgiego pełni funkcję koncentrowania lub „pakowania” produktu syntetyzowanego w ziarnistym retikulum endoplazmatycznym. Logicznie wynikałoby z tego, że gładko-membranowe woreczki, w których zawarte są ziarnistości wydzielnicze, pochodzą raczej z błon Golgiego niż z ziarnistego retikulum endoplazmatycznego.
Komórki α z ich dużymi, zaokrąglonymi, gęstymi ziarnistościami wydzielniczymi są dość podobne do komórek α innych gatunków. Chociaż ziarnistości komórek α różnią się znacznie w wymiarze, większość komórek okazała się posiadać asortyment różnej wielkości ziarnistości, wykluczając w ten sposób podklasyfikację tego typu komórek, jak to zostało zasugerowane dla innych gatunków. W tym czasie, żadne dane fizjologiczne nie zostały opublikowane na poparcie istnienia „komórki δ” w wysepce trzustkowej ryb. Różni protagoniści poparli istnienie komórek δ danymi opartymi na badaniach mikroskopowych z kapryśnym srebrem, kwasem fosfotungstowym-hematoksyliną i innymi plamami granulometrycznymi lub badaniami mikroskopii elektronowej słabo zachowanych tkanek. Mikrografy przedstawione tutaj wspierają opinię rozważaną przez Blooma w 1931 roku, a następnie przez Gomori w 1941 roku, że komórki δ mogą reprezentować zmodyfikowane komórki α.
Przejście od typowej α-granulki, z wewnętrznymi gęstymi i zewnętrznymi mniej gęstymi porcjami, do δ-granulki w przybliżeniu tej samej wielkości, z jednolitą, ale zmniejszoną gęstością, często towarzyszy stopniowa utrata morfologicznej integralności lub intensywności barwienia mitochondriów, kompleksu Golgiego i błoniastych składników ziarnistego retikulum endoplazmatycznego. Nienaruszone i wyglądające na żywotne jądra, jak również utrzymywanie się niewielkiej liczby wolnych rybosomów i ciałek ceroidalnych, sugerują, że tak zwane komórki δ są żywotne nawet na przypuszczalnym końcowym etapie tego przejścia, to jest, gdy ziarnistości wydzielnicze same w sobie nie są już widoczne i wszystkie organelle cytoplazmatyczne inne niż ziarnistości ceroidalne i rybosomy są nieobecne. Brak fizjologicznych danych przypisujących funkcję do komórek δ i przy braku bardziej przekonujących dowodów morfologicznych dla oddzielnego typu komórek, ma się nadzieję, że prezentacja tutaj prawdopodobnego przejścia z komórek α do komórek δ zostanie przyjęta jako najbardziej prawdopodobne wyjaśnienie trzeciej komórki ziarnistej Blooma u ludzi. Znaczenie tych zdolnych do życia, ale zmienionych komórek α nie jest znane. Chociaż α- i β-komórki, pojedynczo lub w małych skupiskach, mogą być widoczne w obrębie acini i przewodów, w żadnym momencie w żadnej z czterech badanych próbek trzustki nie było żadnych form pośrednich między acinar i wysepek lub przewodów i komórek wysepek zobaczyć, jak sugerowano przez Nakamura i Yokote (4).
Konflikt interesów
Autorzy oświadczają, że nie istnieje żaden konflikt interesów dotyczący publikacji tej pracy.
Podziękowania
L. A. Romano otrzymał stypendium na badania produktywności od Brazylijskiej Rady Badań Naukowych, CNPq (Proces nr PQ 301002/2012-6).
.