Myši

Všechny postupy na zvířatech a veškerá práce na myších byly schváleny Výborem pro péči o zvířata a jejich použití Čínské zemědělské univerzity (číslo povolení: SKLAB-2016-01-04). Myši CD1 a 129 byly získány od společnosti Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co, Ltd. Myši Actin-GFP byly získány z laboratoře Shaorong Gao na univerzitě Tongji. Všechny myši byly chovány v podmínkách bez specifických patogenů (SPF) s 12hodinovým cyklem tma / 12hodinovým cyklem světlo mezi 6:00 a 18:00 v místnosti s kontrolovanou teplotou (22 ± 2 °C) s volným přístupem k vodě a potravě.

Linie kmenových buněk a buněčné kultury

G4 a G4-ACTB-DsRed-MST ESC byly získány z laboratoře Dr. Andráse Nagye, Kristiny Vintersten a Mariny Gertsenstein v Mount Sinai Hospital & Výzkumného ústavu Samuela Lunemfelda. Dvojitá transgenní linie ESC Blimp1-mVenus a Stella-ECFP (BVSC), exprimující membránově cílenou Venuši (mVenus) pod kontrolou regulačních prvků Prdm1 (Blimp1) a zvýšenou CFP (ECFP) pod kontrolou Dppa3 (Stella/Pgc7), byla získána od Dr. Mitinori Saitou45,46 .

Pro vytvoření myší buněčné linie XEN Lefty1-mCherry byl promotor Lefty1 a fluorescenční protein použit k integraci do buněk XEN pomocí transpozonového systému Sleeping Beauty, který se skládá ze dvou komponent: transpozonového vektoru modifikovaného z pT2/LTR7-GFP (addgene#62541) a transpozičního vektoru (pCMV(CAT)T7-SB100, addgene #34879). PT2/LTR7-GFP byl doplněn zámkem „puro“, který mohl exprimovat puromycin N-acetyltransferázu, a oblast CDS GFP byla nahrazena mCherry. Fragment DNA, který byl amplifikován z pT2/LTR7-GFP pomocí primeru PT2-F (GTTTGGACAAACCACAACTAGAATG) & R (TCTAAAGCCATGACATCATTTTCTG), spojen s „puro“ zámkem a oblastí CDS mCherry za účelem získání vektoru s názvem PT2-Puro-mCherry pomocí NEBuilder®HiFi DNA Assembly Master Mix (NEW ENGLAND BioLabs). Promotorová sekvence genu Lefty1 byla amplifikována z DNA myších ES buněk pomocí Lefty1-F (GTCCGGTGGGGAATCACATT) & R (AAAGGGTCTTGAGTCTGCGG). Poté byla promotorová sekvence genu Lefty1 přidána k PT2-Puro-mCherry pomocí NEBuilder®HiFi DNA Assembly Master Mix (NEW ENGLAND BioLabs), ve kterém byl PT2-Puro-mCherry linearizován pomocí EcoRI a překryvná sekvence obsahující EcoRI sekvenci byla přidána k promotorové sekvenci genu Lefty1. Vektor byl pojmenován PT2-Puro-mCherry-Lefty1. Poté byly PT2-Puro-mCherry-Lefty1 a pCMV(CAT)T7-SB100 transfekovány do myších buněk XEN a pro následné analýzy stíněny 2 μg na ml puromycinu.

Pro generování buněčných linií s knockoutem Lamc1 (laminin, gama 1) byly pro konstrukci duálního vektoru sgRNA použity dvě sekvence sgRNA cílené (GGAGTACTGCGTGCAGACTGGGG a GCTTTGCCACCAGGTGGGTGTCGG) na exon1 Lamc1. Fragmenty obsahující dvě sekvence sgRNA amplifikované z PUC-U6-sgRNA-Kana (z laboratoře Huang Xingxu) pomocí primerů (Lamc1sg1-F: atgcgtctcacaccggagtactgcgtgcagactggttttagagctagaaatagcaag a Lamc1sg2-R: atgcgtctcgaaacaccacctggtggcaaagcgtgtcgtcctttccacaag). Produkt PCR byl štěpen pomocí BsmbI a ligován s linearizovaným PX330-GFP. Vektory byly transfekovány do ESC a XENC pomocí přípravku Lipofectamine 3000 (L3000001, Thermo Fisher Scientific). Poté byly GFP-pozitivní buňky tříděny pomocí průtokové cytometrie a ředěny pro monoklonální růst. Ze získaných monoklonálních buněk byla extrahována DNA a podrobena amplifikaci PCR a sekvenování. Knockout-pozitivní buňky byly vybrány pro následné experimenty.

Pro generování Nodal knockout buněčných linií byly pro konstrukci sgRNA vektoru použity gRNA sekvence cílené na (GCCCTCGTCACCGTCCCCTCTGG) Nodalův exon1. Primery pro Nodal sgRNA (Nodal-sgF: caccgccctcgtcaccgtcccctc a Nodal-sgR: aaacgaggggacggtgacgagggc) byly annealovány a annealovaný produkt byl ligován k linearizovanému PX330-GFP pomocí BbsI. Vektory byly transfekovány do ESC pomocí Lipofectamine 3000 a GFP-pozitivní buňky byly tříděny pomocí průtokové cytometrie a ředěny pro monoklonální růst. Ze získaných monoklonálních buněk byla extrahována DNA a podrobena amplifikaci PCR a sekvenování. Knockout-pozitivní buňky byly vybrány pro následné experimenty.

Pro vytvoření knockoutové linie ESC p53 byla sekvence sgRNA pro mutaci p53 klonována do vektoru PX330-GFP (addgene, #48138) pomocí systému CRISPR-Cas959. Vektor byl transfekován do ESC G4 pomocí přípravku Lipofectamine 3000 (L3000001, Thermo Fisher Scientific). Tři dny po transfekci byly GFP-pozitivní buňky roztříděny a rozmístěny na 6jamkové destičky. Kolonie byly vybrány a knockoutované oblasti byly amplifikovány pomocí PCR s použitím primerů (F: CATCCAGGCGGGAAATAGAC; R: CCTGACTGTGTGTAAACTAGC) a sekvenovány. Srovnáním se sekvencí divokého typu byly identifikovány homozygotní knockoutované buněčné kolonie, které byly vybrány pro další studium.

ESC byly kultivovány v Dulbeccově modifikovaném médiu Eagle (DMEM) (11960069, Thermo Fisher Scientific) s 15% (v/v) FBS (Gibco, ES cell qualified), 2 mM GlutaMAX (35050061, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM β-merkaptoethanol (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM MEM neesenciální aminokyseliny (11140050, Thermo Fisher Scientific), 1 mM pyruvát sodný (11360070, Thermo Fisher Scientific), 1% penicilin-streptomycin (15140122, Thermo Fisher Scientific), 1000 IU LIF (130-099-895, Miltenyi Biotec), 1 µM PD0325901 (4423, Tocris) a 3 µM CHIR99021 (4192, Tocris). ESC byly kultivovány při 37 °C a 5 % CO2 na želatinizovaných a krmítkem pokrytých jamkových destičkách pro tkáňové kultury a pasážovány po dosažení 80 % konfluence.

TSC byly odvozeny z blastocyst E3.5 vyplavených z dělohy 5týdenní samice myši CD115,60. Při kultivaci byly použity bakterie z tkáňových kultur. Blastocysty byly kultivovány na mitoticky inaktivovaných myších buňkách MEF (napájecí buňky) s kultivačním médiem pro TSC: pokročilé RPMI 1640 (11875-093, Thermo Fisher Scientific) doplněné 20 % (v/v) FBS (Gibco, ES cell qualified), 2 mM GlutaMAX (35050061, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM β-merkaptoethanol (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 1 mM pyruvát sodný (11360070, Thermo Fisher Scientific), 1 % (v/v) penicilin-streptomycin (15140122, Thermo Fisher Scientific), 25 ng na ml rekombinantního lidského FGF4 (235-F4-025, R&D) a 1 µg na ml heparinu (07980, Stem Cell). Dokud se výrůstky nevytvořily 4. den, byly následně disagregovány inkubací v 0,1% trypsinu-EDTA po dobu 5 min v inkubátoru. Přidáním čerstvého média kondicionovaného 70% myšími embryonálními fibroblasty obsahujícího FGF4 a heparin se reakce zastaví a vrátí se do inkubátoru. Vyměňte médium každý druhý den, dokud nebude možné pozorovat kolonie TS buněk, a pro udržení buněk vyměňte médium za kultivační médium TSC. Buněčné linie TSC exprimující EGFP (TSC-EGFP) byly odvozeny z divokého typu TSC, které byly transfekovány vektorem PB-UBC-EGFP pomocí JetPrime (114-15, Polyplus transfection). TSC byly kultivovány při 37 °C a 5 % CO2 na želatinizovaných a krmivem pokrytých jamkových destičkách pro tkáňové kultury a pasážovány po dosažení 80 % konfluence. Kultivační médium se měnilo denně.

XENC byly odvozeny z blastocyst E3.5 vyplavených z dělohy 5týdenní samice myši 129 za použití modifikovaných podmínek XENC61. Myší blastocysty byly kultivovány na napájecích buňkách, dokud 4. den nevytvořily výrůstek, který byl následně disagregován inkubací v 0,1% trypsinu-EDTA po dobu 5 min v inkubátoru. Přidejte čerstvé médium pro myší ES buňky bez PD0325901 a CHIR99021, aby se reakce zastavila, a vyměňujte médium každý druhý den, dokud nebude možné pozorovat kolonie buněk XEN. Kolonie buněk XEN byly udržovány standardním médiem XEN: pokročilé RPMI 1640 (11875-093, Thermo Fisher Scientific) doplněné o 15 % (v/v) FBS (Gibco) a 0,1 mM β-merkaptoethanol (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 1 % penicilin-streptomycin (15140122, Thermo Fisher Scientific). Buněčná linie XENC-EGFP byla odvozena přímo z myší blastocysty Actin-EGFP. Pro kultivaci bez podavače byly XENC udržovány na destičce s jamkami pro tkáňové kultury potažené želatinou. Buňky XENC byly kultivovány při 37 °C a 5 % CO2. Po dosažení 90% konfluence byly pasážovány. Kultivační médium bylo denně vyměňováno.

Generace samouspořádaných embryí

ESC, které dosáhly 80 % konfluence, byly jednou promyty PBS (14190-094, Gibco) a inkubovány 5 minut při 37 °C v TrypLE (12605010, Thermo Fisher Scientific). TSC a XENC byly disociovány na jednotlivé buňky inkubací s 0,1% trypsinem-EDTA (25300054, Thermo Fisher Scientific) při 37 °C. Buňky byly peletovány centrifugací při 1000 otáčkách za minutu po dobu 5 minut. Peleta byla znovu suspendována v rekonstruovaném embryonálním médiu pipetováním na jednotlivé buňky. Buňky byly automaticky spočítány pomocí automatického počítadla buněk.

Pro ETX-embryoidy smíchejte ESC, TSC a XNEC v počtu 1 × 105, 1 × 105, resp. 2 × 105 buněk (pro ETS-embryoidy smíchejte ESC a TSC v počtu 1 × 105, resp. 1 × 105 buněk; pro EXE-embryoidy smíchejte ESC a XENC v počtu 1 × 105, resp. 1 × 105 buněk) s 2 ml rekonstruovaného embryonálního média na 35 mm neošetřenou misku buněčné kultury. Přemístěte misku na horizontální rotátory při teplotě 37 °C, 5 % CO2 a 100% vlhkosti. Rychlost otáčení je 60 otáček za minutu. Rekonstruované embryonální médium obsahuje 39 % pokročilé RPMI 1640 (11875-093, Thermo Fisher Scientific) a 39 % DMEM (11960069, Thermo Fisher Scientific) doplněné 17,5 % FBS (Gibco, ES cell qualified), 2 mM GlutaMAX (35050061, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM β-merkaptoethanol (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 0,1 mM MEM neesenciální aminokyseliny (11140050, Thermo Fisher Scientific), 1 mM pyruvát sodný (11360070, Thermo Fisher Scientific), 1 % penicilin-streptomycin (15140122, Thermo Fisher Scientific). Každý den měněno médium za 2 ml čerstvého rekonstruovaného embryonálního média.

EXE-embryoidy se tvořily konzistentně a efektivně, funkční experimenty lze provádět bez selekce pravidelných nebo nepravidelných struktur. Pro funkční experimenty ETX-embryoidů a ETS-embryoidů jsme vybrali pravidelné struktury na základě jejich morfologie a vhodných proporcí a polohy ESC a TSC kompartmentů podle indikace TSC-EGFP pod stereofluorescenčním mikroskopem.

Získání embryí divokého typu a kultivace in vitro

Blastocysty byly získány z E4,5 superovulovaných březích myších samic proplachem dělohy pomocí M2 (MR-015-D, Millipore). Kultivace embryí v médiu IVC po odstranění muralního trofektodermu in vitro na 8jamkových μ-Slides (80826, Ibidi)62. Pro obnovu embryí E5,5, E5,75 a E6,5 se disekce deciduy z dělohy popisuje podle uváděného protokolu63. Pro EPI-explantáty z myší CD1 byly vypreparovány v den E5.0 podle předchozí zprávy28 a kultivovány s ETX-embryoidním médiem in vitro.

Imnofluorescenční barvení

Myší embrya a rekonstruovaná embrya byla fixována 4% paraformaldehydem (DingGuo, AR-0211) při 4 °C po dobu 20 min a třikrát promyta promývacím pufrem (PBS obsahující 0,1 % Tween-20). Poté byla embrya permeabilizována 0,5% Tritonem X-100 (H5142, Promega) po dobu 30 min při pokojové teplotě a inkubována s primárními protilátkami v blokovacím pufru (3% BSA, 0,3% Triton X-100) přes noc při 4 °C. Po promytí k odstranění nenavázaných primárních protilátek byly buňky inkubovány se sekundární protilátkou v blokovacím pufru přes noc při 4 °C. Buněčná jádra byla obarvena pomocí DAPI, následovalo dvojí promytí promývacím pufrem a poté byla namontována ve Fluoroshield Mounting Medium s DAPI (104140, abcam). Snímky byly pořízeny pomocí konfokálního mikroskopu Nikon A1.

Snímky se zpracováním a analýzou

Snímky myších embryí a rekonstruovaných embryí byly pořízeny pomocí konfokálního mikroskopu Nikon A1 s 20× nebo 40× objektivem. Všechny analýzy byly provedeny pomocí softwaru pro analýzu obrazu s otevřeným zdrojovým kódem “Fiji“. Objem tkání a počty buněk rekonstruovaných embryí a embryí divokého typu byly odhadnuty a měření intenzity imunofluorescence pro analýzu distribuce PCX bylo rovněž provedeno pomocí softwaru Fiji9.

Vysokokapacitní qPCR jednotlivých buněk a zpracování dat

Pro izolaci jednotlivých buněk byly určité buňky v různých vývojových stádiích (0, 24 a 84 h) odebrány ze dvou typů ETX-embryí, které byly rekonstruovány pomocí reportérových buněčných linií Lefty1-mCherry XENC (LC-ETX-embryoidy) a BVSC ESC (BVSC-ETX-embryoidy). Pro izolaci jednotlivých buněk jsme vybrali pouze LC-ETX-embryoidy s tkáněmi podobnými DVE/AVE identifikovanými asymetrickou expresí mCherry proteinů a BVSC-ETX-embryoidy s asymetrickou expresí mVenus proteinů v ESC kompartmentu poblíž hranice mezi ESC- a TSC kompartmentem. Pro LC-ETX-embryoidy byly odebrány 0, 24 a 84 h LC negativní buňky odvozené od ESC (LC- XEN) a 84 h pozitivní ESC (BVSC+ ES) z opačné strany LC- XEN. Pro BVSC-ETX-embryoidy byly odebrány 0, 24 a 84 h BV negativní buňky odvozené od ESC (BVSC- ES) a 84 h pozitivní ESC (BVSC+ ES) z opačné strany BVSC- ES. Kromě toho byly na základě EGFP reportéru shromážděny jednotlivé buňky z TSC kompartmentů v ETX-embryoidech sestavených s BVSC-ESC v 0, 24 a 84 h.

Pro separaci jednotlivých buněk byly všechny ETX-embryoidy inkubovány v 0,1% trypsin-EDTA (Invitrogen, Carlsbad, USA) po dobu 5 min při 37 °C a poté přeneseny do média M2 (MR-015-D, Millipore). Po několikanásobném jemném opakovaném pipetování ústy byly jednotlivé buňky izolovány jemně taženou skleněnou špičkou. V průměru bylo pro každý typ odebráno 30-40 buněk. Každá buňka byla třikrát promyta v Dulbeccově fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (Invitrogen, Carlsbad, USA) obsahujícím 0,1 % BSA (Sigma-Aldrich, MO, USA) a umístěna do hlavní směsi pro reverzní transkripci a polymerázovou řetězovou reakci (RT-PCR) pro lyzi, sekvenčně specifickou reverzní transkripci a preamplifikaci, jak bylo popsáno v předchozí zprávě64.

Pro návrh a validaci primerů byly vybrány geny, které regulují diferenciaci buněčné linie (především od stadia E3,5 do E6,5) a účastní se dominantní signální dráhy (např, Wnt, Nodální signální dráha), byly vybrány podle embryogeneze myši. Sekvence mRNA pro každý zainteresovaný gen byly získány z NCBI a pro geny s různými transkripty byly použity pouze společné oblasti. Pomocí softwaru Primer3 byly navrženy qRT-primery specifické pro daný gen v délce 100-250 bp. Všechny primery byly testovány s použitím cDNA myších embryí (směs E5,5 a E6,5) na účinnost amplifikace a specifičnost (uvedeny v doplňkových údajích 1).

Sekvenčně specifická preamplifikace v jedné buňce podobná předchozí zprávě65. Celkem 96 sad primerů bylo sloučeno na konečnou koncentraci 0,1 μM pro každý primer. Jednotlivé buňky izolované z embryí byly přeneseny do sterilních mikrozkumavek s 5 μl hlavní směsi RT-PCR obsahující 2,5 μl reakční směsi CellsDirect (Invitrogen, Carlsbad, USA), 0,5 μl poolu primerů, 0,1 μl enzymu RT/Taq (Invitrogen, Carlsbad, USA) a 1,9 μl vody bez nukleáz (Invitrogen, Carlsbad, USA) v každé zkumavce. Zkumavky byly okamžitě zmraženy na suchém ledu. Po krátkém odstředění při 4 °C byly zkumavky okamžitě vloženy do PCR stroje. Buněčná lýza a sekvenčně specifická reverzní transkripce byly provedeny při 50 °C po dobu 1 h. Poté bylo dosaženo inaktivace reverzní transkriptázy a aktivace Taq polymerázy zahřátím na 95 °C po dobu 3 min. Následně ve stejné zkumavce prošla cDNA 20 cykly sekvenčně specifické amplifikace denaturací při 95 °C po dobu 15 s a žíháním a elongaci při 60 °C po dobu 15 min. Aby se zabránilo odpařování, byly výsledné produkty uchovávány při -80 °C.

Pro vysoce výkonnou mikrofluidní jednobuněčnou kvantitativní PCR byly všechny preamplifikované produkty cDNA validovány systémem PCR v reálném čase (ABI 7500) s použitím endogenního kontrolního genu Actinb, přičemž pro následný experiment byly vybrány pouze hodnoty prahového překročení (Ct) v rozmezí 9-12. Amplifikované jednobuněčné vzorky byly analyzovány pomocí SsoFast EvaGreen Supermixu s nízkým obsahem ROX (Bio-Rad, Kalifornie, USA) a jednotlivých qPCR primerů v dynamických maticích 96 × 96 na systému Biomark (Fluidigm, San Francisco, USA). Výpočet hodnot Ct byl proveden pomocí softwaru BioMark Real-Time PCR Analysis (Fluidigm, San Francisco, USA).

Pro zpracování a vizualizaci jednobuněčných dat byly všechny surové hodnoty Ct získané ze systému BioMark převedeny na relativní hladiny exprese Log2 odečtením hodnot od předpokládané hodnoty pozadí Ct 26.

. Vzorky s nízkou nebo chybějící expresí endogenních kontrolních genů (Actinb a Gapdh) byly z následné analýzy vyloučeny. Na expresní data byla použita metoda PLS-DA k rozlišení skupin buněk v různých ETX-embryoidech pomocí balíčku R mixOmics66. Hierarchické shlukování bylo provedeno pomocí euklidovských vzdáleností a dendrogramy byly zobrazeny podél řádkových heatmap pomocí balíčku fluidigmSC. Krabicové grafy a houslové grafy byly vytvořeny pomocí softwaru origin 8.6 a R.

Výroba BVSC ESC-Chimeric embryí

Vyrobili jsme BVSC ESC-Chimeric embrya metodou injekce 8buněčných embryí pomocí piezoelektrické mikromanipulace67. Abychom zajistili, že hostitelská embrya byla injikována před zhutněním, odebrali jsme embrya ve dvoubuněčném stadiu a kultivovali je in vitro. Pro získání embryí ve dvoubuněčném stadiu byly pětitýdenní myší samice superovulovány intraperitoneální injekcí pěti mezinárodních jednotek (IU) PMSG, následovanou 5 IU HCG o 46-48 h později, a spářeny s myšími samci. Dvoubuněčná embrya byla odebrána výplachem vejcovodu s M2 v E1.5. Embrya byla promyta v M2 (MR-015-D, Millipore) a poté přenesena do 10 μl kapek KSOM (MR-020P-5F, Millipore) pokrytých minerálním olejem na misce tkáňové kultury. Embrya byla udržována v inkubátoru při teplotě 37 °C s 5 % CO2.

Přibližně 15 ES buněk bylo injikováno do embryí ve stádiu 8 buněk pomocí piezoelektrické mikromanipulace67,68 . Jako pseudopregnantní myši byly použity osmitýdenní CD1 samice spárované s vasektomizovanými samci. Injektované blastocysty byly přeneseny do dělohy pseudopregnantních samic 2,5 dne po koitu (dpc). Embrya ve stadiu moruly s injikovanými ESC byla přenesena do vejcovodu příjemkyň 0,5 dpc. Na jednu příjemkyni jsme přenesli 14-16 embryí. V E6,5 jsme odebrali chimérická embrya z deciduí, jak je popsáno výše.

Transfer embryí a hodnocení implantace

Osmitýdenní samice CD1 spárované s vasektomovanými samci byly použity jako pseudopregnantní myši. Pro rekonstruovaná embrya byly 36 h rekonstruované sféry (ETX-, ETS- a EXE-embryoidy) přeneseny do děložních rohů pseudopregnantních recipientních samic CD1 ve 2,5 dpc nebo 3,5 dpc. Na jednu příjemkyni bylo přeneseno šestnáct až dvacet embryí. Implantační místa v den 6,5 byla identifikována a spočítána intravenózní injekcí 100 μl 1% roztoku Chicago Sky Blue. Délka a poloměr každé deciduy byly změřeny pomocí softwaru pro analýzu obrazu a objem byl z těchto měření vypočten jako V = πr2l.

HE barvení a imunobarvení implantačních míst

Pro zkoumání vývojového potenciálu samouspořádaných embryí jsme odebrali deciduy z různých stadií, včetně 48, 72 a 84 hodin po transplantaci. Tyto vzorky rekonstruovaných (ETX, EXE a ETS) embryí byly fixovány 4% paraformaldehydem přes noc při 4 °C, dehydratovány gradientními alkoholy, přeneseny do xylenu a vloženy do parafínu. Jako kontrolu jsme použili embrya E5,5, E6,0 a E6,5 divokého typu. Vzorky byly nařezány na tloušťku 5 μm, obarveny hematoxylinem a eosinem a pozorovány pod mikroskopem. Deparafinované rehydratované vzorky byly podrobeny tepelnému získávání epitopů v citrátovém pufru při teplotě přibližně 95 °C pomocí mikrovlnné trouby po dobu 10 minut, poté byly ochlazeny na pokojovou teplotu a dvakrát opláchnuty v PBS po dobu 3 minut. Permeabilizace byla provedena 0,5% Tritonem X-100 v PBS po dobu 20 min při pokojové teplotě. Po permeabilizaci byly vzorky třikrát promyty v PBS (vždy 3 min). Poté byly vzorky blokovány po dobu 30 min 5% hovězím sérovým albuminem (BSA) v PBS a inkubovány s primárními protilátkami proti Rabbit anti-CK (ab9377, Abcam), Rabbit anti-COX2 (ab15191, Abcam), Rabbit anti-Laminin (L9393, Sigma), Goat anti-Gata4 (sc-1237, Santa Cruz) nebo Mouse anti-PL1(sc-376436, Santa Cruz) při 4 °C přes noc. Následující den byly řezy třikrát promyty v PBS po dobu 5 min a inkubovány se sekundární protilátkou po dobu 30 min při 37 °C. Sekundární protilátky byly označeny fluoroforem Alexa 488 nebo 594 (Invitrogen). Následně byly řezy šestkrát opláchnuty v PBS vždy po dobu 5 min a namontovány pomocí montážního média Fluoroshield s DAPI (ab104140, Abcam). Sklíčka byla uchovávána při -20 °C až do pozorování. Snímky byly pořízeny fluorescenčním mikroskopem Leica.

Hybridizace in situ

Hybridizace in situ s digoxygeninem (DIG) byla provedena na kryosekcích52. Pro hybridizaci byly použity myší specifické cRNA sondy pro Dtprp. Řezy hybridizované se smysluplnými sondami sloužily jako negativní kontroly. Zmrazené řezy (8-10 μm) byly nalepeny na sklíčka potažená poly-l-lysinem (Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd, Jiang Su, Čína) a uloženy při -80 °C až do použití. Řezy byly umístěny na 2 min na ohřívač sklíček (37 °C) a poté rehydratovány v PBS, postfixovány ve 4% PFA po dobu 15 min při 4 °C, ošetřeny proteinázou K (15 μg na ml po dobu 5 min při pokojové teplotě), 0,25% acetylovány po dobu 10 min a hybridizovány s DIG značenými sondami přes noc při 65 °C. Po hybridizaci při 65 °C byly provedeny dvě promývání, po nichž následovala dvě promývání v 1 × MABT a 30minutové ošetření RNázou (20 μg na ml) při 37 °C. Řezy byly 1 h blokovány a přes noc inkubovány v bloku s protilátkou anti-DIG (1:2500, Sigma-Aldrich). Po promytí se barva vyvíjela pomocí NBT/BCIP, dokud nebyl viditelný hnědý precipitát. Sklíčka byla protibarvena rychlou jadernou červení, dehydratována a očištěna v xylenu a upevněna v cytoseálním montážním médiu. Fotografie byly pořízeny okamžitě, než došlo k vyblednutí precipitátu INT/BCIP.

Genotypová identifikace přenesených samouspořádaných embryí

Genomová DNA byla extrahována z DsRed-ESC, EGFP-TSC a ETX-embryoidů izolovaných z tkání deciduy pomocí soupravy TIANamp Micro DNA Kit (DP316, Tiangen) podle pokynů výrobce. Diagnostická sada primerů EGFP (5ʹ-AGGACGTCATCAAGGAGTTC-3ʹ, 5ʹ-CAGCCCATAGTCTTCTTCTG-3ʹ) a DsRed (5ʹ-GTGCTTCAGCCGCTACCC-3ʹ, 5ʹ-AGTTCACCTTGATGCCGTTCT-3ʹ) byly použity k identifikaci oblasti buněk a vzorků pomocí PCR. Tepelný profil byl 95 °C po dobu 5 min, 35 cyklů 95 °C po dobu 30 s, 60 °C po dobu 30 s a 72 °C po dobu 20 nebo 40 s a závěrečný cyklus při 72 °C po dobu 5 min.

Statistika

Statistické analýzy byly zpracovány v softwaru GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA) pro Windows (včetně údajů o expresi Log2 u jedné buňky). Před provedením každého parametrického statistického testu byla data zkontrolována na normální rozdělení a rovnost rozptylů pomocí F-testu. V případě potřeby byly provedeny dvouvýběrové Studentovy t-testy s Welchovou korekcí, pokud rozptyly mezi skupinami nebyly stejné. Chybové sloupce představují standardní chybu s.e.m. nebo s.d., jak je uvedeno. Legendy obrázků uvádějí počet nezávislých experimentů provedených v každé analýze. Každý experiment byl kvůli reprodukovatelnosti opakován.

Objem tkáně (obr. 1i a 7c a doplňkový obr. 4h), procentuální podíl a výpočet počtu (obr. 2h, 2i, 3k, 4c, 4f, 5e, 5f, 7b, 7m a 7n; doplňkové obr. 2d, 3c, 4g, 8d, 11f, 12a a 12g) byl stanoven pomocí programu Excel. Analýza významnosti byla provedena pomocí t-testu v programu GraphPad Prism. Sloupcové grafy byly vykresleny pomocí programů Excel a GraphPad Prism a grafy rozptylu byly vykresleny pomocí programu GraphPad Prism.

Souhrn zpráv

Další informace o experimentálním designu jsou k dispozici ve zprávě Nature Research Reporting Summary, která je propojena s tímto článkem.

.