Mice

Kaikki eläinkäsittelyt ja hiirillä tehdyt työt hyväksyttiin Kiinan maatalousyliopiston eläinten hoito- ja käyttökomiteassa (lupanumero: SKLAB-2016-01-04). CD1- ja 129-hiiret saatiin Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.:ltä. Actin-GFP-hiiret saatiin Shaorong Gaon laboratoriosta Tongji-yliopistossa. Kaikkia hiiriä pidettiin spesifisistä patogeeneistä vapaissa (SPF) olosuhteissa 12 tunnin pimeä / 12 tunnin valojaksolla klo 06:00-18:00 lämpötilakontrolloidussa huoneessa (22 ± 2 °C), jossa oli vapaa pääsy veteen ja ruokaan.

Kantasolulinjat ja soluviljely

G4- ja G4-ACTB-DsRed-MST ESC:t saatiin tohtori Andras Nagyn, Kristina Vinterstenin ja Marina Gertsensteinin laboratoriosta Mount Sinai -sairaalassa & Samuel Lunemfeld -tutkimuslaitoksesta. Blimp1-mVenus- ja Stella-ECFP- (BVSC) kaksoistransgeeninen ESC-linja, joka ilmentää kalvokohdennettua Venusta (mVenus) Prdm1:n (Blimp1) säätelyelementtien valvonnassa ja tehostettua CFP:tä (ECFP) Dppa3:n (Stella/Pgc7) valvonnassa, saatiin tohtori Mitinori Saitoulta45,46.

Lefty1-mCherry-hiiren XEN-solulinjan tuottamiseksi Lefty1-promoottoria ja fluoresoivaa proteiinia käytettiin XEN-soluihin integroimiseen Sleeping Beauty -transposonijärjestelmällä, joka koostuu kahdesta komponentista: pT2/LTR7-GFP:stä muunnetusta transposonivektorista (addgene#62541) ja transposaasivektorista (pCMV(CAT)T7-SB100, addgene #34879). PT2/LTR7-GFP:hen lisättiin ”puro”-linna, joka voi ilmentää puromysiini-N-asetyylitransferaasia, ja GFP:n CDS-alue korvattiin mCherryllä. DNA-fragmentti, joka monistettiin pT2/LTR7-GFP:stä alukkeella PT2-F (GTTTGGACAAACCACAACTAACTAGAATG) & R (TCTAAAGCCATGACATCATCATTTTCTG), yhdistettiin ”puro”-linnaan ja mCherryn CDS-alueeseen, jotta saatiin vektori nimeltä PT2-Puro-mCherry käyttäen NEBuilder®HiFi DNA Assemblaatiomestarimassaseosta (NEBuilder® HiFi DNA Assembly Master Mix (NEW ENGLAND BioLabs). Lefty1-geenin promoottorisekvenssi monistettiin hiiren ES-solujen DNA:sta käyttäen Lefty1-F (GTCCGGTGGGGAATCACATT) & R (AAAGGGTCTTGAGTCTGCGG). Sitten Lefty1-geenin promoottorisekvenssi lisättiin PT2-Puro-mCherryyn NEBuilder®HiFi DNA Assembly Master Mixillä (NEW ENGLAND BioLabs), jossa PT2-Puro-mCherry linearisoitiin EcoRI:llä ja EcoRI-sekvenssin sisältävä päällekkäinen sekvenssi lisättiin Lefty1-geenin promoottorisekvenssiin. Vektorin nimi oli PT2-Puro-mCherry-Lefty1. Sitten PT2-Puro-mCherry-Lefty1 ja pCMV(CAT)T7-SB100 transfektoitiin hiiren XEN-soluihin ja seulottiin 2 μg/ml puromysiinillä myöhempiä analyysejä varten.

Lamc1:n (laminiini, gamma 1) knockout-solulinjojen tuottamiseksi käytettiin kahta sgRNA-sekvenssiä, jotka kohdistuvat (GGAGTACTGCGTGCAGCAGACTGGGG ja GCTTTGCCACCAGGTGGTGGTGTCGG) Lamc1:n eksoniin1, kahden sgRNA-vektorin rakentamiseen. Fragmentit, jotka sisälsivät kaksi sgRNA-sekvenssiä, monistettiin PUC-U6-sgRNA-Kanasta (Huang Xingxun laboratoriosta) käyttäen alukkeita (Lamc1sg1-F: atgcgtctcacaccggagtactgcgtgcagctgcagactggttttagttagctagaaatagcaag ja Lamc1sg2-R: atgcgtctcgaaacacacaccacctggtgggcaaagccggtggtgttgtttctcgtcctctttttccacaag). PCR-tuote digestoitiin BsmbI:llä ja ligoitiin linearisoidun PX330-GFP:n kanssa. Vektorit on transfektoitu ESC:iin ja XENC:iin käyttäen Lipofectamine 3000 (L3000001, Thermo Fisher Scientific). Sitten GFP-positiiviset solut lajiteltiin virtaussytometrialla ja laimennettiin monoklonaalista kasvua varten. Saaduista monoklonaalisista soluista uutettiin DNA, joka monistettiin PCR:llä ja sekvensoitiin. Knockout-positiiviset solut valittiin jatkokokeisiin.

Nodalin knockout-solulinjojen tuottamiseksi sgRNA-vektorin rakentamiseen käytettiin gRNA-sekvenssiä, joka kohdistui (GCCCTCGTCACCGTCCCCCCTCTGG) Nodalin eksoniin1. Nodal-sgRNA:n alukkeet (Nodal-sgF: caccgccctcgtcaccgtcccctc ja Nodal-sgR: aaacgaggggacggtgacgagggc) hehkutettiin ja hehkutettu tuote ligoitiin linearisoituun PX330-GFP:hen BbsI:n avulla. Vektorit transfektoitiin ESC-soluihin Lipofectamine 3000:lla ja GFP-positiiviset solut lajiteltiin virtaussytometrialla ja laimennettiin monoklonaalista kasvua varten. Saaduista monoklonaalisista soluista uutettiin DNA, joka monistettiin PCR:llä ja sekvensoitiin. Knockout-positiiviset solut valittiin jatkokokeisiin.

P53 knockout ESC-linjan tuottamiseksi p53-mutaation sgRNA-sekvenssi kloonattiin PX330-GFP-vektoriin (addgene, #48138) CRISPR-Cas9-järjestelmän59 avulla. Vektori transfektoitiin G4 ESC:iin Lipofectamine 3000:lla (L3000001, Thermo Fisher Scientific). Kolme päivää transfektion jälkeen GFP-positiiviset solut lajiteltiin ja sijoitettiin 6-kuoppalevylle. Pesäkkeet poimittiin, ja knockout-alueet monistettiin PCR:llä käyttäen alukkeita (F: CATCCAGGCGGGAAATAGAGAC; R: CCTGACTGTGTGTGTAAACTAGGC) ja sekvensoitiin. Kohdistamalla villin tyypin sekvenssin kanssa homotsygoottiset knockout-solupesäkkeet tunnistettiin ja valittiin jatkotutkimuksiin.

ESC-soluja kasvatettiin Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (11960069, Thermo Fisher Scientific) -mediassa, jossa oli 15 % (v/v) FBS:ää (Gibco, ES-solujen kelpoisuusvaatimukset täyttävä soluväliaine (Gibco, ES-solujen kelpoisuusvaatimukset täyttävä soluväliaine (Gibco, ES-solujen kelpoisuusvaatimukset täyttävä soluväliaine)), 2 mM GlutaMAX:aä (35050061, Thermo Fisher Scientific, 0.1 mM β-merkaptoetanolia (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM MEM ei-essentiaalisia aminohappoja (11140050, Thermo Fisher Scientific), 1 mM natriumpyruvaattia (11360070, Thermo Fisher Scientific), 1 % penisilliini-streptomysiiniä (15140122, Thermo Fisher Scientific), 1000 IU LIF:tä (130-099-895, Miltenyi Biotec), 1 µM PD0325901:tä (4423, Tocris) ja 3 µM:a CHIR99021:tä (4192, Tocris). ESC-yksilöitä kasvatettiin 37 °C:ssa ja 5 % CO2:ssa gelatinoituneilla ja feederillä päällystetyillä kudosviljelyyn soveltuvilla kuoppalevyillä, ja ne passagoitiin, kun 80 % konfluenssista oli saavutettu.

TSC-yksilöt johdettiin E3.5-blastokystoista, jotka huuhdottiin 5 viikon ikäisen CD1-hiiren naaraspuolisen nartun kohdusta15,60. Blastokystat kasvatettiin mitoottisesti inaktivoitujen hiiren MEF-solujen (syöttösolut) päällä TSC-viljelyalustalla: kehittynyt RPMI 1640 (11875-093, Thermo Fisher Scientific), jota täydennettiin 20 %:lla (v/v) FBS:llä (Gibco, ES-solujen kvalifikaatio), 2 mM GlutaMAX:lla (35050061, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM β-merkaptoetanolia (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 1 mM natriumpyruvaattia (11360070, Thermo Fisher Scientific), 1 % (v/v) penisilliini-streptomysiiniä (15140122, Thermo Fisher Scientific), 25 ng/ml rekombinanttia inhimillistä FGF4:ää (235-F4-025, R&D) ja 1 µg/ml hepariinia (07980, Stem Cell). Kunnes ulokkeet muodostuivat päivänä 4, ne purettiin sen jälkeen inkuboimalla 0,1-prosenttisessa trypsiini-EDTA:ssa 5 minuutin ajan inkubaattorissa. Lisättiin tuoretta hiiren 70-prosenttista alkion fibroblastikonditionoitua elatusainetta, joka sisälsi FGF4:ää ja hepariinia, reaktion pysäyttämiseksi ja palautettiin inkubaattoriin. Vaihda väliaine joka toinen päivä, kunnes TS-solupesäkkeitä voidaan havaita, ja vaihda väliaine TSC-viljelyaineeseen solujen ylläpitämiseksi. EGFP:tä ilmentävät TSC-solulinjat (TSC-EGFP) johdettiin villityyppisistä TSC-soluista, jotka transfektoitiin PB-UBC-EGFP-vektorilla JetPrime-ohjelmalla (114-15, Polyplus transfection). TSC-soluja kasvatettiin 37 °C:ssa ja 5 % CO2:ssa gelatinoidulla ja syöttölaitteella päällystetyllä kudosviljelyyn soveltuvalla kuoppalevyllä, ja ne passivoitiin, kun 80 %:n konfluenssi oli saavutettu. Viljelyalusta vaihdettiin päivittäin.

XENC:t johdettiin 5 viikon ikäisen 129-hiiren naaraan kohdusta huuhtoutuneista E3.5-blastokystoista käyttäen muunnettuja XENC-olosuhteita61. Hiiren blastokystoja kasvatettiin syöttösoluilla, kunnes ne muodostivat 4. päivänä ulokkeen, joka myöhemmin hajotettiin inkuboimalla sitä 0,1 %:n trypsiini-EDTA:ssa 5 minuutin ajan inkubaattorissa. Lisättiin tuoretta hiiren ES-solualustaa ilman PD0325901:tä ja CHIR99021:tä reaktion pysäyttämiseksi ja vaihdettiin väliaine joka toinen päivä, kunnes XEN-solupesäkkeitä voitiin havaita. XEN-solupesäkkeitä ylläpidettiin XEN-standardialustalla: kehittynyt RPMI 1640 (11875-093, Thermo Fisher Scientific), jota täydennettiin 15 %:lla (v/v) FBS:llä (Gibco) ja 0,1 mM β-merkaptoetanolilla (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 1 %:lla penisilliini-streptomysiinillä (15140122, Thermo Fisher Scientific). XENC-EGFP-solulinja johdettiin suoraan aktiini-EGFP-hiiren blastokystasta. Syöttimetöntä viljelyä varten XENC-soluja pidettiin kudosviljelylaatuisella kuoppalevyllä, joka oli päällystetty gelatiinilla. XENC-soluja kasvatettiin 37 °C:ssa ja 5 % CO2:ssa. Solut passivoitiin, kun ne olivat saavuttaneet 90 prosentin konfluenssin. Viljelyalusta vaihdettiin päivittäin.

Itsesyntyneiden alkioiden tuottaminen

ESC-solut, jotka saavuttivat 80 %:n konfluenssin, pestiin kerran PBS:llä (14190-094, Gibco) ja inkuboitiin 5 min 37 °C:ssa TrypLE:ssä (12605010, Thermo Fisher Scientific). TSC:t ja XENC:t dissosioitiin yksittäisiksi soluiksi inkuboimalla 0,1-prosenttisessa trypsiini-EDTA:ssa (25300054, Thermo Fisher Scientific) 37 °C:ssa. Solut pelletoitiin sentrifugoimalla 1000 rpm 5 minuutin ajan. Pelletti suspendoitiin uudelleen rekonstruoidun alkion väliaineeseen pipetoimalla yksittäisiksi soluiksi. Solut laskettiin automaattisesti automaattisella solulaskurilla.

ETX-alkioita varten sekoitettiin ESC-, TSC- ja XNEC-soluja 1 × 105, 1 × 105 ja 2 × 105 solumäärällä (ETS-alkioita varten sekoitettiin ESC- ja TSC-soluja 1 × 105 ja 1 × 105 solumäärällä; EXE-alkioiden osalta sekoitetaan ESC:t ja XENC:t 1 × 105:n ja 1 × 105:n solumäärällä) 2 ml:lla rekonstruoitua alkioalustaa 35 mm:n käsittelemätöntä soluviljelymaljaa kohti. Siirrä astia vaakasuorassa rotaattorissa 37 °C:ssa, 5 % CO2:ssa ja 100 %:n ilmankosteudessa. Pyörimisnopeus on 60 rpm/min. Rekonstruoidun alkion väliaine sisältää 39 % kehittynyttä RPMI 1640:tä (11875-093, Thermo Fisher Scientific) ja 39 % DMEM:ää (11960069, Thermo Fisher Scientific) täydennettynä 17,5 %:lla FBS:ää (Gibco, ES-solujen kelpoisuusvaatimukset täyttävä), 2 mM GlutaMAX:ää (35050061, Thermo Fisher Scientific), 0.1 mM β-merkaptoetanolia (21985-023, Thermo Fisher Scientific), 0,1 mM MEM ei-välttämättömiä aminohappoja (11140050, Thermo Fisher Scientific), 1 mM natriumpyruvaattia (11360070, Thermo Fisher Scientific), 1 % penisilliini-streptomysiini (15140122, Thermo Fisher Scientific). Vaihdettiin väliaine 2 ml:lla tuoretta rekonstruoitua alkioalustaa joka päivä.

EXE-embryoidit muodostuivat johdonmukaisesti ja tehokkaasti, toiminnalliset kokeet voidaan suorittaa ilman säännöllisten tai epäsäännöllisten rakenteiden valintaa. ETX-embryoidien ja ETS-embryoidien toiminnallisia kokeita varten valitsimme säännölliset rakenteet niiden morfologian perusteella sekä ESC- ja TSC-osastojen asianmukaiset mittasuhteet ja sijainnit osoittamalla TSC-EGFP:n stereofluoresenssimikroskoopilla.

Wild-tyypin alkioiden talteenotto ja in vitro -viljely

Blastokystat otettiin talteen E4.5 superovuloituneista tiineistä naarashiiristä kohdun huuhtelulla M2:lla (MR-015-D, Millipore). Alkioiden viljely IVC-mediassa muraalisen trofektodermin poistamisen jälkeen in vitro 8-kuoppaisilla μ-Slides-levyillä (80826, Ibidi)62. E5,5-, E5,75- ja E6,5-alkioiden talteenottoa varten decidua irrotettiin kohdusta raportoidun protokollan mukaisesti63. EPI-alkioita varten CD1-hiiristä peräisin olevat alkiot leikattiin E5.0-päivänä, kuten aiemmin on raportoitu28 , ja niitä viljeltiin ETX-alkioidien väliaineessa in vitro.

Immunofluoresenssivärjäys

Hiiren alkiot ja rekonstruoidut alkiot fiksoitiin 4 %:lla paraformaldehydillä (DingGuo, AR-0211) 4 °C:n lämpötilassa 20 minuutin ajan, minkä jälkeen ne pestiin kolmeen kertaan huuhtelupuskurilla (PBS:ssä, joka sisälsi 0,1-prosenttista 0.1%:a Tween-20:tä). Tämän jälkeen alkiot permeabiloitiin 0,5 %:lla Triton X-100:lla (H5142, Promega) 30 minuutin ajan huoneenlämmössä ja niitä inkuboitiin primaarivasta-aineiden kanssa estopuskurissa (3 % BSA, 0,3 % Triton X-100) yön yli 4 °C:ssa. Kun solut oli pesty sitoutumattomien primaarivasta-aineiden poistamiseksi, niitä inkuboitiin sekundaarivasta-aineen kanssa estopuskurissa yön yli 4 °C:ssa. Solujen tumat värjättiin DAPI:llä, minkä jälkeen ne pestiin kahdesti pesupuskurilla ja kiinnitettiin DAPI:tä sisältävään Fluoroshield Mounting Mediumiin (104140, abcam). Kuvat otettiin Nikon A1 -konfokaalimikroskoopilla.

Kuvantaminen käsittelyllä ja analysoinnilla

Hiiren alkioiden ja rekonstruoitujen alkioiden kuvat otettiin Nikon A1 -konfokaalimikroskoopilla, jossa oli 20 × tai 40 × objektiivi. Kaikki analyysit tehtiin avoimen lähdekoodin kuva-analyysiohjelmalla ”Fiji”. Rekonstruoitujen alkioiden ja villityypin alkioiden kudosten tilavuus ja solujen lukumäärä arvioitiin, ja immunofluoresenssin intensiteettimittaukset PCX:n jakautumisen analysointia varten tehtiin myös Fiji-ohjelmistolla9.

High-throughput single-cell qPCR ja tietojenkäsittely

Yksittäisten solujen eristämistä varten tietyt solut eri kehitysvaiheissa (0, 24 ja 84 h) kerättiin kahdesta erityyppisestä ETX-alkioidista, jotka rekonstruoitiin Lefty1-mCherry XENC (LC-ETX-alkioidit) ja BVSC ESC (BVSC-ETX-alkioidit) -reporttisolulinjoilla. Yksittäisten solujen eristämiseksi valitsimme vain LC-ETX-embryoidit, joilla oli DVE/AVE:n kaltaisia kudoksia, jotka tunnistettiin mCherry-proteiinien epäsymmetrisen ilmentymisen perusteella, ja valitsimme BVSC-ETX-embryoidit, joilla oli mVenus-proteiinien epäsymmetrinen ilmentyminen ESC-osastossa lähellä ESC- ja TSC-osastojen välistä rajaa. LC-ETX-embryoideja varten kerättiin 0, 24 ja 84 tunnin LC-negatiiviset ESC-peräiset solut (LC- XEN) sekä 84 tunnin positiiviset ESC-solut (BVSC+ ES) LC- XEN:n vastakkaiselta puolelta. BVSC-ETX-embryoideja varten kerättiin 0, 24 ja 84 h BV-negatiiviset ESC-peräiset solut (BVSC- ES) sekä 84 h positiiviset ESC:t (BVSC+ ES) BVSC- ES:n vastakkaiselta puolelta. Lisäksi kerättiin yksittäisiä soluja TSC-osastoista ETX-embryoideista, jotka oli koottu BVSC-ESC:llä 0, 24 ja 84 h:n kohdalla EGFP-reportterin perusteella.

Yksittäisten solujen erottelua varten kaikkia ETX-embryoideja inkuboitiin 0,1 %:n trypsiini-EDTA:ssa (Invitrogen, Carlsbad, USA) 5 minuuttia 37 °C:n lämpötilassa, minkä jälkeen ne siirrettiin M2-mediaan (MR-015-D, Millipore). Useita kertoja toistetun varovaisen suupipetoinnin jälkeen yksittäiset solut eristettiin hienoksi vedetyllä lasikärjellä. Kustakin tyypistä kerättiin keskimäärin 30-40 solua. Kukin solu pestiin kolme kertaa Dulbeccon fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (Invitrogen, Carlsbad, USA), joka sisälsi 0,1 % BSA:ta (Sigma-Aldrich, MO, USA), ja asetettiin käänteisen transkription ja polymeraasiketjureaktion (RT-PCR) master mixiin lyysiä, sekvenssispesifistä käänteistä transkriptiota ja esiamplikointia varten edellisen raportin kuvauksen mukaisesti64.

Alukkeiden suunnittelua ja validointia varten käytettiin geenejä, jotka säätelevät solulinjojen erilaistumista (pääasiassa E3.5- ja E6.5-vaiheesta) ja osallistuvat dominoivaan signaalireittiin (esim, Wnt, Nodal-signalointireitti) valittiin hiiren alkionmuodostuksen mukaan. Kunkin halutun geenin mRNA-sekvenssit haettiin NCBI:stä, ja vain yhteisiä alueita käytettiin geeneille, joilla oli erilaisia transkripteja. Geenispesifiset qRT-alkuaineet suunniteltiin Primer3-ohjelmistolla 100-250 bp:n pituisiksi. Kaikki alukkeet oli testattu hiiren alkioiden cDNA:lla (E5.5- ja E6.5-alkioiden sekoitus) amplifikaatiotehokkuuden ja spesifisyyden osalta (lueteltu lisätiedoissa 1).

Sekvenssispesifinen yhden solun esiasteinen amplifikaatio samanlainen kuin aiemmassa raportissa65. Yhteensä 96 alukesarjaa yhdistettiin siten, että kunkin alukkeen lopullinen pitoisuus oli 0,1 μM. Alkioista eristetyt yksittäiset solut siirrettiin steriileihin mikroputkiin, jotka ladattiin 5 μl:lla RT-PCR master mixiä, joka sisälsi 2,5 μl CellsDirect-reaktioseosta (Invitrogen, Carlsbad, USA), 0,5 μl alukepoolia, 0,1 μl RT/Taq-entsyymiä (Invitrogen, Carlsbad, USA) ja 1,9 μl nukleaasivapaata vettä (Invitrogen, Carlsbad, USA) jokaiseen putkeen. Putket pakastettiin välittömästi kuivajäällä. Lyhyen sentrifugoinnin jälkeen 4 °C:ssa putket asetettiin välittömästi PCR-koneeseen. Solujen lyysi ja sekvenssispesifinen käänteinen transkriptio suoritettiin 50 °C:ssa 1 tunnin ajan. Tämän jälkeen käänteinen transkriptaasi inaktivoitiin ja Taq-polymeraasi aktivoitiin kuumentamalla 95 °C:seen 3 minuutin ajan. Tämän jälkeen cDNA käytiin samassa putkessa läpi 20 sekvenssispesifistä monistussykliä denaturoimalla 95 °C:ssa 15 sekunnin ajan ja hehkuttamalla ja elongoimalla 60 °C:ssa 15 minuutin ajan. Haihtumisen välttämiseksi saadut tuotteet säilytettiin -80 °C:ssa.

Korkean läpimenon mikrofluidista yhden solun kvantitatiivista PCR:ää varten kaikki esivahvistetut cDNA-tuotteet validoitiin reaaliaikaisella PCR-järjestelmällä (ABI 7500) käyttäen endogeenista kontrolligeeniä Actinb:tä, ja vain kynnysarvon ylitysarvo (Ct), joka oli alle 9:n ja 12:n välillä, valittiin myöhempään kokeeseen. Amplifioidut yksittäissolunäytteet analysoitiin SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX (Bio-Rad, Kalifornia, Yhdysvallat) -menetelmällä ja yksittäisillä qPCR-alukkeilla 96 × 96 dynaamisissa matriiseissa Biomark-järjestelmässä (Fluidigm, San Francisco, Yhdysvallat). Ct-arvot laskettiin BioMark Real-Time PCR Analysis -ohjelmistolla (Fluidigm, San Francisco, USA).

Yksittäisen solun tietojen käsittelyä ja visualisointia varten kaikki BioMark-järjestelmästä saadut raa’at Ct-arvot muunnettiin Log2-suhteellisiksi ilmentymistasoiksi vähentämällä arvot oletetusta taustan Ct-arvosta 26. Näytteet, joissa endogeenisten kontrolligeenien (Actinb ja Gapdh) ilmentyminen oli vähäistä tai puuttui kokonaan, jätettiin myöhemmän analyysin ulkopuolelle. PLS-DA:ta sovellettiin ekspressiotietoihin soluryhmien erottamiseksi eri ETX-embryoideissa R-paketin mixOmics66 avulla. Hierarkkinen klusterointi suoritettiin käyttämällä euklidisia etäisyyksiä, ja dendrogrammit näytettiin riveille skaalattujen lämpökarttojen varrella fluidigmSC-paketin avulla. Box-plotit ja violin plotit luotiin origin 8.6- ja R-ohjelmistolla.

BVSC ESC-kimeeristen alkioiden tuottaminen

Tuotimme BVSC ESC-kimeerisiä alkioita 8-soluisen alkion injektiomenetelmällä Piezo Micromanipulation -menetelmällä67. Varmistaaksemme, että isäntäalkiot injektoitiin ennen tiivistämistä, keräsimme alkiot kahden solun vaiheessa ja viljelimme niitä in vitro. Kaksisoluisen vaiheen alkioiden saamiseksi 5 viikon ikäiset naarashiiret superovuloitiin ruiskuttamalla vatsaontelonsisäisesti viisi kansainvälistä yksikköä (IU) PMSG:tä, jota seurasi 5 IU HCG:tä 46-48 tuntia myöhemmin, ja paritettiin uroshiirien kanssa. Kaksisoluiset alkiot kerättiin huuhtelemalla munatorvi M2:lla E1,5:n kohdalla. Alkiot pestiin M2:lla (MR-015-D, Millipore) ja siirrettiin sitten 10 μl:n KSOM-tippoihin (MR-020P-5F, Millipore), jotka oli peitetty mineraaliöljyllä kudosviljelymaljalla. Alkioita pidettiin 37 °C:ssa ja 5 % CO2:ssa inkubaattorissa.

Noin 15 ES-solua injektoitiin 8-soluisessa vaiheessa oleviin alkioihin Piezo-mikromanipulaatiolla67,68. Kahdeksan viikon ikäisiä CD1-naaraita, jotka oli paritettu vasektomoitujen urosten kanssa, käytettiin pseudoraskaina hiirinä. Injektoidut blastokystat siirrettiin pseudoraskaiden naaraiden kohtuun 2,5 päivää coitumin jälkeen (dpc). Morula-vaiheessa olevat alkiot, joihin oli injektoitu ESC-soluja, siirrettiin 0,5 dpc:n ikäisten vastaanottajien munatorveen. Siirrettiin 14-16 alkiota vastaanottajaa kohti. E6.5:n kohdalla keräsimme kimeeriset alkiot deciduaeista edellä kuvatulla tavalla.

Embryonsiirto ja istutuksen arviointi

Kahdeksan viikon ikäisiä CD1-naaraita, jotka oli paritettu vasektomoitujen urosten kanssa, käytettiin pseudoraskaina hiirinä. Rekonstruoituja alkioita varten 36 h rekonstruoidut pallot (ETX-, ETS- ja EXE-alkioidit) siirrettiin pseudoraskaiden vastaanottavien CD1-naaraiden kohdunsarviin 2,5 dpc- tai 3,5 dpc-hetkellä. Vastaanottajaa kohti siirrettiin 16-20 alkiota. Implantaatiokohdat päivänä 6,5 tunnistettiin ja laskettiin injisoimalla suonensisäisesti 100 μl 1-prosenttista Chicago Sky Blue -liuosta. Kunkin deciduan pituus ja säde mitattiin kuva-analyysiohjelmistolla, ja tilavuus laskettiin näiden mittausten perusteella seuraavasti: V = πr2l.

HE-värjäys ja implantoitumiskohtien immunovärjäys

Tutkittaaksemme itsejärjestäytyneiden alkioiden kehityspotentiaalia keräsimme decidua-aineksia erilaisista vaiheista, mukaan lukien 48-, 72- ja 84-tunnin kuluttua siirrosta. Nämä rekonstruoidut (ETX, EXE ja ETS) alkionäytteet kiinnitettiin 4-prosenttisella paraformaldehydillä yön yli 4 °C:ssa, dehydratoitiin gradienttialkoholeilla, siirrettiin ksyleeniin ja upotettiin parafiiniin. Kontrollina käytettiin E5.5, E6.0 ja E6.5 villityypin alkioita. Näytteet leikattiin 5 μm:n paksuisiksi, värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla ja tarkasteltiin mikroskoopilla. Deparaffinoidut rehydratoidut näytteet kuumennettiin sitraattipuskurissa sitraattipuskurissa noin 95 °C:ssa mikroaaltouunissa 10 minuutin ajan, minkä jälkeen ne jäähdytettiin huoneenlämpötilaan ja huuhdeltiin kahdesti PBS:ssä 3 minuutin ajan kahdesti. Permeabilointi suoritettiin 0,5-prosenttisella Triton X-100:lla PBS:ssä 20 minuutin ajan huoneenlämmössä. Permeabiloinnin jälkeen näytteet pestiin PBS:ssä kolme kertaa (3 min kukin). Tämän jälkeen näytteet blokattiin 30 minuutin ajan 5 %:lla naudan seerumin albumiinilla (BSA) PBS:ssä ja inkuboitiin primaarivasta-aineilla kanin anti-CK:ta vastaan (ab9377, Abcam), kanin anti-COX2:ta vastaan (ab15191, Abcam), kanin anti-Laminiinia vastaan (L9393, Sigma), vuohen anti-Gata4:ää vastaan (sc-1237, Santa Cruz) tai hiiren anti-PL1:tä vastaan (sc-376436, Santa Cruz) 4 °C:n lämpötiloissa yön yli. Seuraavana päivänä viipaleita pestiin kolme kertaa PBS:llä 5 minuutin ajan ja inkuboitiin toissijaisen vasta-aineen kanssa 30 minuutin ajan 37 °C:ssa. Toissijaiset vasta-aineet merkittiin Alexa Fluorophore 488:lla tai 594:llä (Invitrogen). Tämän jälkeen leikkeet huuhdeltiin kuusi kertaa PBS:ssä 5 minuutin ajan ja kiinnitettiin Fluoroshield-kiinnitysalustalla, jossa oli DAPI (ab104140, Abcam). Objektiolevyjä säilytettiin -20 °C:ssa havainnointiin asti. Kuvat otettiin Leican fluoresenssimikroskoopilla.

In situ -hybridisaatio

In situ -hybridisaatio digoksigeniinillä (DIG) tehtiin kryoleikkauksista52. Hybridisoinnissa käytettiin hiirispesifisiä cRNA-koettimia Dtprp:lle. Sense-koettimilla hybridisoidut leikkeet toimivat negatiivisina kontrolleina. Pakastepoikkileikkeet (8-10 μm) kiinnitettiin poly-l-lysiinillä päällystettyihin objektiolevyihin (Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd, Jiang Su, Kiina) ja säilytettiin -80 °C:ssa käyttöön asti. Leikkeet asetettiin diojen lämmittimeen (37 °C) 2 minuutiksi, sitten ne rehydratoitiin PBS:ssä, jälkifiksoitiin 4 %:n PFA:ssa 15 minuutiksi 4 °C:ssa, käsiteltiin proteinaasi K:lla (15 μg/ml 5 minuutin ajan huoneenlämmössä), asetyloitiin 0,25 %:lla 10 minuutiksi ja hybridisoitiin DIG-merkityillä koettimilla yön yli 65 °C:ssa. Kaksi 65 °C:n jälkihybridisointipesua suoritettiin, minkä jälkeen tehtiin kaksi pesua 1 × MABT:ssä ja 30 minuutin RNaasikäsittely (20 μg/ml) 37 °C:ssa. Leikkeet blokattiin 1 h ja inkuboitiin yön yli blokissa anti-DIG-vasta-aineella (1:2500, Sigma-Aldrich). Pesun jälkeen väri kehitettiin NBT/BCIP:llä, kunnes ruskea sakka oli näkyvissä. Objektiolevyt värjättiin vastavärjäyksellä nuclear fast redillä, dehydratoitiin ja puhdistettiin ksyleenissä ja kiinnitettiin sytoosin kiinnitysalustaan. Valokuvat otettiin välittömästi ennen kuin INT/BCIP-sakka haalistui.

Siirrettyjen itsejärjestäytyneiden alkioiden genotyypin tunnistaminen

Genominen DNA uutettiin DsRed-ESC-, EGFP-TSC- ja ETX-alkioista, jotka oli eristetty decidua-kudoksesta, TIANamp Micro DNA Kitillä (DP316, Tiangen) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Diagnostinen alukesarja EGFP (5ʹ-AGGACGTCATCAAGGAGTTC-3ʹ, 5ʹ-CAGCCCATAGTCTTCTTCTTCTTCTG-3ʹ) ja DsRed (5ʹ-GTGCTTCAGCCGCTACCC-3ʹ, 5ʹ-AGTTCACCTTGATGCCCCGTTCT-3ʹ) käytettiin solujen ja näytteiden alueen tunnistamiseen PCR:llä. Lämpötilaprofiili oli 95 °C 5 minuutin ajan, 35 sykliä 95 °C:ssa 30 sekuntia, 60 °C:ssa 30 sekuntia ja 72 °C:ssa 20 tai 40 sekuntia ja viimeinen sykli 72 °C:ssa 5 minuuttia.

Tilastot

Statistiset analyysit käsiteltiin GraphPad Prism 7.0 -ohjelmistolla (GraphPad Software, La Jolla, CA) Windows-käyttöjärjestelmää varten (mukaan lukien yhden solun Log2-ekspressiotiedot). Tiedot oli tarkistettu normaalijakauman ja yhtäläisten varianssien osalta F-testillä ennen kunkin parametrisen tilastollisen testin suorittamista. Tarvittaessa suoritettiin Studentin t-testit ja Welchin korjaus, jos ryhmien välinen varianssi ei ollut yhtä suuri. Virhepalkit edustavat s.e.m.:n tai s.d.:n keskivirhettä määritellyllä tavalla. Kuvien legendoissa ilmoitetaan kussakin analyysissä suoritettujen riippumattomien kokeiden lukumäärä. Jokainen koe oli toistettu toistettavuuden varmistamiseksi.

Kudoksen tilavuus (kuvat 1i ja 7c sekä täydentävä kuva 4h), prosenttiosuus- ja lukumäärälaskenta (kuvat 2h, 2i, 3k, 4c, 4f, 5e, 5f, 7b, 7m ja 7n; täydentävät kuvat 2d, 3c, 4g, 8d, 11f, 12a ja 12g) määritettiin Excelillä. Merkitsevyysanalyysi tehtiin t-testillä GraphPad Prism -ohjelmalla. Pylväsdiagrammit piirrettiin Excelillä ja GraphPad Prism -ohjelmalla ja hajontakuviot GraphPad Prism -ohjelmalla.

Raportointiyhteenveto

Lisätietoa koesuunnittelusta on saatavilla tähän artikkeliin linkitetyssä Nature Research Reporting Summary -julkaisussa.